本發(fā)明涉及雜環(huán)化合物，特別涉及一種吡喃駢吲哚乙?；苌锛捌渲苽浞椒ê蛻?yīng)用。
背景技術(shù)：
血栓性疾病是引起人類死亡的三大疾病之一，嚴(yán)重威脅人類生命和健康，血栓性疾病引起的死亡人數(shù)已經(jīng)超過惡性腫瘤。溶栓療法是早期急性心肌梗塞和血栓栓塞性疾病的有效治療方法。纖溶療法是早期急性心肌梗塞和其它血栓性疾病的有效治療方法，這種療法是通過藥物激活血液潛在活性的纖溶酶原，形成活性的纖溶酶降解血栓成纖維蛋白降解產(chǎn)物而溶解血栓。纖溶療法被譽(yù)為20世紀(jì)心腦血管藥理學(xué)領(lǐng)域的十大發(fā)現(xiàn)之一。
國內(nèi)外臨床上使用的溶栓藥物近百種，典型的是鏈激酶(streptokinase，sk)、尿激酶(urokinase-typeplasminogenactivator，uk，u-pa)、重組組織型纖溶酶原激活劑(recombinanttissue-typeplaminogenactivator，rt-pa)，對-甲氧苯甲酰纖溶酶原鏈激酶激活劑復(fù)合物(anisoylatedplasmsnogenstreptokinaseactivatorcomplex，apsac)和重組鏈激酶(reeombinantstreptokinase，r-sk)等。
典型的纖溶療法在臨床上使用的藥品如組織型纖溶酶原激活劑、尿激酶型纖溶酶原激活劑等會(huì)帶來出血的重大危險(xiǎn)性，只能用于治療嚴(yán)重血栓患者。由于纖溶酶原激活劑類藥物存在安全性問題，研究者正在使用組織型纖溶酶原激活劑重組變異體(recombinantvariantsoftissue-typeplasminogenactivator，rt-pa)等低分子量化合物以降低出血危險(xiǎn)性，活化的血液蛋白質(zhì)c的抗凝血作用和促進(jìn)纖溶作用正在受到關(guān)注。在臨床上，消除血栓的藥物如血小板膜特異性糖蛋白抑制劑阿昔單抗，除了具有出血危險(xiǎn)性外，還帶來了像阿司匹林減少血小板的副作用。
心腦血管藥理學(xué)領(lǐng)域正亟需出血危險(xiǎn)性小、不損傷血液因子、專一性高的小分子化合物作為藥物的出現(xiàn)，尋找這樣的小分子化合物并將其開發(fā)成高效、特異、安全的溶栓藥物一直是全球的研究熱點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供了一種吡喃駢吲哚乙酰化衍生物，該目標(biāo)化合物能提高纖溶酶原活性，促進(jìn)異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,fttc)-纖維蛋白降解，具有優(yōu)良的溶栓活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供吡喃駢吲哚乙酰化衍生物i的制備方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
一種吡喃駢吲哚乙?；苌餅?,5-二((2-(2,6,-二甲基-2,6-二烯)壬基)-(2-甲基-3-乙酰氧基)-吡喃并(5-乙酰氧基)-異吲哚酮基)-戊酸，其結(jié)構(gòu)式如式i所示：
上述吡喃駢吲哚乙酰化衍生物的制備方法，其步驟包括：
1)、將菌株fg216活化于斜面培養(yǎng)基，然后將斜面菌株fg216種子培養(yǎng)液按照1％的接種量，接種于培養(yǎng)基中，22-26℃、180r·min-1的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)4-6天，然后再添加培養(yǎng)基體積1％的鳥氨酸，培養(yǎng)24-28小時(shí)；
2)、加入與查氏培養(yǎng)基等體積的甲醇，超聲處理12-18分鐘，在轉(zhuǎn)速10000rpm條件下離心12-18分鐘，取上清液在55-65℃下減壓濃縮、真空干燥；然后將干固物溶于甲醇中，過濾，取上清液減壓濃縮、真空干燥；最后將干固物硅膠柱層析得到吡喃駢吲哚化合物(膠柱層析的流動(dòng)相可以是氯仿-甲醇-甲酸，其體積比為9:1:0.1–3:1:0.1)，其結(jié)構(gòu)式如式ii所示：
3)、以步驟2)中得到的吡喃駢吲哚化合物為反應(yīng)原料，在醋酸酐/吡啶體系(例如吡喃駢吲哚化合物20～30mg，醋酸酐50～150μl，吡啶0.2～1.5ml)中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12h，反應(yīng)液傾入適量冰水(例如使吡啶與冰水的體積比為1～10:50)中，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層分別用5％鹽酸，飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，減壓回收乙酸乙酯，得粗品，經(jīng)硅膠柱層析(膠柱層析的流動(dòng)相的可以是石油醚∶丙酮的體積比可以為5:1–3:1，效果更好)洗脫得如結(jié)構(gòu)式i的吡喃駢吲哚乙?；苌?。
上述制備方法，步驟1)中所述培養(yǎng)基由蔗糖、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、酵母提取物、氯化鈷、硫酸亞鐵、氯化鈣和海水組成，經(jīng)滅菌后使用。例如，培養(yǎng)基可以是每1000ml人工海水中含有蔗糖50g、硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀0.1g、硫酸鎂0.5g、氯化鉀0.5g、酵母提取物1g、氯化鈷0.0025g、硫酸亞鐵0.015g、氯化鈣0.0065g，ph5.8經(jīng)滅菌后使用。
一種藥物組合物由結(jié)構(gòu)式i的化合物和可藥用載體和/或賦形劑組成。即所述藥物組合物除了含有結(jié)構(gòu)式i的化合物外，其余為藥物學(xué)上可接受的，對人和動(dòng)物無毒的惰性的可用載體和/或賦形劑。所述的藥用載體或賦形劑是一種或多種固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑，可以是是乳糖、糖粉、淀粉、海藻酸鈉等。
優(yōu)選的，上述藥物組合物中的含結(jié)構(gòu)式i的化合物占藥物組合物總量的0.1％-99wt％。
上述吡喃駢吲哚乙酰化衍生物在制備治療或預(yù)防血栓栓塞性疾病藥物中的應(yīng)用。
上述藥物組合物在制備治療或預(yù)防血栓栓塞性疾病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明制備的吡喃駢吲哚乙酰化衍生物i用作藥物時(shí)，可直接使用，或者以藥物組合物的形式使用?？梢砸詥挝惑w服用量的形式使用。本發(fā)明的藥物組合物可經(jīng)靜脈注射和口服兩種形式給藥。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：
1、所述吡喃駢吲哚乙?；苌飅能夠提高纖溶酶原活性，經(jīng)過檢測，化合物的纖溶酶原活性提高了3.5倍以上；可促進(jìn)fitc-纖維蛋白的降解，具有溶栓活性。
2、所述吡喃駢吲哚乙?；苌飅可用于治療或預(yù)防血栓栓塞性疾病藥物中，出血危險(xiǎn)性小、不損傷血液因子、專一性高。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)。
fg216菌株，該菌株屬于小單胞菌屬(micromonosporasp.)。該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號：cctccno.m2012272，保藏日期是2012年7月12日。
培養(yǎng)基的制備：每1000ml人工海水中含有蔗糖50g、硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀0.1g、硫酸鎂0.5g、氯化鉀0.5g、酵母提取物1g、氯化鈷0.0025g、硫酸亞鐵0.015g、氯化鈣0.0065g，ph5.8經(jīng)滅菌后使用。
實(shí)施例1：
將菌株fg216活化于斜面培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)好的斜面菌株fg216種子培養(yǎng)液按照1％的接種量，接種于上述培養(yǎng)基中，25℃、180r·min-1的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)4天，然后再添加培養(yǎng)基體積1％重量的鳥氨酸，培養(yǎng)24小時(shí)完成發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，三角瓶中加入與等體積的甲醇，超聲15min，在轉(zhuǎn)速10000rpm條件下離心15min，棄除沉淀，上清液在60℃條件下減壓蒸餾蒸干，濃縮物真空干燥8h，干固物溶于20ml的甲醇溶液中，過濾棄除沉淀，收集上清液，再減壓濃縮真空干燥，所得干固物硅膠柱層析氯仿-甲醇-甲酸(7：1：0.1，v/v)，而得到具有溶血栓促進(jìn)作用的吡喃駢吲哚類化合物ii，吡喃駢吲哚化合物ii為反應(yīng)原料，在醋酸酐/吡啶體系中室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12h，反應(yīng)液傾入適量冰水中，乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層分別用5％鹽酸，飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，減壓回收乙酸乙酯，得粗品，經(jīng)硅膠柱層析(石油醚∶丙酮，4:1，v/v)洗脫得吡喃駢吲哚乙?；苌?i)
分子式：c59h76n2o14
分子量：1036
性狀：白色粉末
1hnmr(cdcl3,500mhz)：δ6.67(s,1h),6.63(s,1h),5.11(t,j＝6.4hz,2h),5.03(t,j＝6.4hz,2h),4.73(dd,j＝10.1,5.4hz,1h),4.20–4.17(m,4h),3.80(dd,j＝12.8,6.8hz,1h),3.48(t,j＝6.4hz,2h),2.78–2.85(m,2h),2.52–2.53(m,2h),2.35(s,6h),2.02(s,6h),2.10(m,4h),2.00–2.01(m,4h),1.90(m,2h),1.88–1.92(m,4h),1.60(s,6h),1.57(m,4h),1.54(m,2h),1.52(s,6h),1.52(s,6h),1.18(s,3h),1.15(s,3h)；13cnmr(cdcl3,125mhz)：δ172.4，170,169,168.7,167.5,156.2,156.1,148.5,148.3，134.30,134.28，131.7,130.9,130.6,130.6,124.1,124.1,124.17,124.19,119.8,119.4,111.7,111.3,99.6,99.6,66.7,66.0,65.9,53.4,41.1，44.8,46.3,39.1,37.2,37.1,26.66,26.64,26.2,26.1,25.4,25.0,21.1,21.0,20.0,18.5,18.3,17.4,15.6；esims:m/z1037[m+h]+.
活性評價(jià)：
(1)對結(jié)構(gòu)式i中化合物進(jìn)行纖溶酶原活性測定
使用96孔圓底酶標(biāo)板，在20μmol/l纖溶酶原、20μmol/l單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑、100μg/mlsuk(spectrozyme
(2)化合物ifitc-纖維蛋白降解活性測定
溶解于0.1mol/l碳酸氫鈉(ph9.0)的360μl(10mg/ml)的纖維蛋白原和溶解于磷酸鹽緩沖液的36μl(10mg/ml)fitc(fluoresceinisothiocyanateisomerⅰ)混合，在25℃下保溫0.5小時(shí)，使用由磷酸鹽緩沖液平衡的葡聚糖層析柱層析該混合液，得到了fitc-fbg(fibrinogen)。含有20μgfitc-fbg的磷酸鹽緩沖液100μl被分注到96孔平底酶標(biāo)板的孔中，在37℃下保溫12小時(shí)至干燥，向干燥的穴孔里添加25μl凝血酶[0.68u/mlinnacl/napi(150mmnacland20mmsodiumphosphate,ph7.4)]，在37℃下維持3小時(shí)后，用含有0.1％tween80的nacl/napi和不含有0.1％tween80的nacl/napi分別洗凈2次和1次，隨后添加5mg/ml胎兒皮膚膠原蛋白的nacl/napi溶液200μl，在37℃下保溫1小時(shí)，棄除緩沖液后被用于纖溶活性的測定。
含有10％血漿(不含有血小板)的tbs/bsa100μl、0.1nm單鏈尿激酶型纖溶酶原激活劑和樣品(0-14μg/ml)被順次添加到上述穴孔里，每一個(gè)樣品重復(fù)3次，在37℃下保溫1小時(shí)，使用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長494nm和檢測波長520nm測定了fitc-纖維蛋白的分解量。與對照相比，6.0μm以上結(jié)構(gòu)1的吡喃駢吲哚乙?；苌锾岣遞itc-纖維蛋白的降解2.0倍以上。
(3)結(jié)論
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)施例1制備的吡喃駢吲哚乙?；苌飅在體外能夠提高纖溶酶原活性和促進(jìn)fitc(異硫氰酸熒光素)-纖維蛋白降解，具有溶栓活性。
實(shí)施例2
將實(shí)施例1中制得吡喃駢吲哚乙?；苌?，各取1mg分別用0.5ml的dmso溶解后，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。
實(shí)施例3
將實(shí)施例1中制得吡喃駢吲哚乙酰化衍生物，各取1mg分別用0.5ml的dmso溶解后，按常規(guī)加注射用水，將其溶于無菌注射用水中，攪拌使溶解，用無菌抽濾漏斗過濾，分裝于安培瓶中，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。
實(shí)施例4
將實(shí)施例1中制得的吡喃駢吲哚乙?；苌?，按照喃駢吲哚乙酰化衍生物與賦形劑的重量比為9:1的比例混合，制成粉劑。所述賦形劑為乳糖、糖粉、淀粉、海藻酸鈉等，制成粉劑。
實(shí)施例5
將實(shí)施例1中制得的吡喃駢吲哚乙?；苌铮凑锗夁胚犷惢衔锱c賦形劑的重量比為5:1的比例混合，制成粉劑。所述賦形劑為乳糖、糖粉、淀粉、海藻酸鈉等，制成粉劑。
實(shí)施例6：
將實(shí)施例1中制得的吡喃駢吲哚乙?；苌铮闯Ｒ?guī)口服液制法，制成口服液。
實(shí)施例7：
將實(shí)施例1中制得的吡喃駢吲哚乙?；苌?，按其與賦形劑按照重量比為5:1的比例混合制成膠囊，賦形劑可以是乳糖、糖粉、淀粉、海藻酸鈉。
實(shí)施例8：
按實(shí)施例1中制得的吡喃駢吲哚乙?；苌?，按其與賦形劑按照重量比為3:1的比例混合，制成膠囊，賦形劑可以是乳糖、糖粉、淀粉、海藻酸鈉。