本發(fā)明涉及向日葵莖芯多糖技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及具有抗腫瘤活性的向日葵莖芯多糖及四種分級組分HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3、HALWP-4及其提取分離方法。
背景技術(shù)：
自21世紀(jì)以來，癌癥嚴(yán)重威脅著人類的生命，據(jù)報導(dǎo)我國每年因癌癥死亡的人數(shù)約為150萬，因此尋找一種可以高效的殺傷或者抑制腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞不具有毒性或具有保護(hù)作用的藥物十分重要。目前用于治療癌癥的化學(xué)藥物有許多不足之處，例如藥物在作用于癌癥腫瘤細(xì)胞的同時也對正常細(xì)胞產(chǎn)生了毒副作用，使患者產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，或有在治療腫瘤的同時誘發(fā)了另外一種腫瘤的可能性。近年來基于天然植物藥具有毒副作用較低、無致突變性及可以通過增強自身免疫力而促進(jìn)癌癥腫瘤細(xì)胞凋亡等特點，對其抗癌抗腫瘤作用的研究不斷深入。
向日葵(拉丁文：Helianthus annuus.L)為菊科向日葵屬植物，別名望日蓮、太陽花、向陽花。向日葵現(xiàn)于我國的東、西部地區(qū)和內(nèi)蒙古等地均有廣泛栽培。據(jù)我國藥典記載，向日葵的莖、葉、盤、根均有治療疾病的作用。向日葵莖芯為向日葵的莖內(nèi)髓芯，又名向日葵莖髓、向日葵瓤、葵花稈心、葵稈。其化學(xué)成分主要為多糖類，同時也含黃酮、酚酸、不飽和脂肪酸、萜、香豆素類等。向日葵莖芯水煎液可以明顯抑制小鼠的移植瘤，它還可以破壞亞硝胺，從而達(dá)到防治癌癥的目的。多年以來，杭州市第二人民利用向日葵莖芯煎液治療胃癌的結(jié)果表明，胃癌轉(zhuǎn)移的患者可以通過口服葵芯煎液來使病情得到有效的緩解。據(jù)研究表明，向日葵的莖心多糖能夠增強小鼠免疫功能。向日葵莖芯中主要的活性成分可能是多糖。
目前，向日葵莖芯多糖的提取主要是先提取粗多糖，然后再進(jìn)一步分離純化，再進(jìn)行活性檢測。這種方法具有較多的不確定因素，而且分離過程中容易導(dǎo)致活性成分丟失，且提取分離的向日葵莖芯多糖不一定具有抗腫瘤活性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種具有抗腫瘤活性的向日葵莖芯多糖的提取分離方法。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種具有抗腫瘤活性的向日葵莖芯多糖的提取分離方法：
(1)取于秋季采收的向日葵的稈，將向日葵莖芯剝離出來，置于陰涼處自然風(fēng)干，再放入40℃烘箱中干燥8h。將干燥的向日葵莖芯用粉碎機粉碎后備用。
(2)取一定量干燥的向日葵莖芯粉末，過篩，用95％乙醇回流提取兩次，以去除脂溶性成分；再用80％乙醇回流提取兩次，以除去單糖和低聚糖。所得殘渣烘干，揮發(fā)去除有機溶劑后，在一定的料液比、浸提時間和浸提溫度下，對向日葵莖芯多糖進(jìn)行多次浸煮提取。
(3)收集合并多次浸煮提取所得提取液，將提取液過濾后減壓濃縮后加入95％乙醇，靜置24h，3000r/min離心15min得沉淀，將所得沉淀用丙酮、乙醇洗滌并烘干，即得到向日葵莖芯多糖粗產(chǎn)品。
(4)根據(jù)苯酚-硫酸法測定上述多糖粗產(chǎn)品在490nm波長處的吸光度，并以多糖提取率為考察指標(biāo)，測定得到的多糖粗產(chǎn)品中多糖的含量為85.37％。
(5)取上述多糖粗產(chǎn)品，經(jīng)過除蛋白后，溶解于純化水中，過DEAE纖維素DE-52離子交換柱進(jìn)行分離，以一定的流速，依次用4種不同濃度的NaCI溶液梯度洗脫，收集四種洗脫組分，經(jīng)透析、濃縮、冷凍干燥，得到四種不同的洗脫組分HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3和HALWP-4，分別測定各不同洗脫組分的體內(nèi)外抗腫瘤活性，其中抗腫瘤活性最好的為HALWP-4。
優(yōu)選的，步驟(2)中向日葵莖芯粉末所過篩目數(shù)為20-100目。
優(yōu)選的，步驟(2)中向日葵莖芯粉末與純化水的比例為1:30-1:70。
優(yōu)選的，步驟(2)中向日葵莖芯粉末的浸提時間為2.0-4.0h。
優(yōu)選的，步驟(2)中向日葵莖芯粉末的浸提溫度為60-100℃。
優(yōu)選的，步驟(5)中NaCI溶液的流速為0.5-2.0mL/min。
優(yōu)選的，步驟(5)中NaCI溶液的濃度為0.1-0.4mol/L。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明還提供了一種抗腫瘤活性的向日葵莖芯多糖，以抗腫瘤活性為依據(jù)，采用離子交換柱層析法對粗多糖進(jìn)一步分離純化，經(jīng)試驗證明，所得到的向日葵莖芯多糖具有更好的抗腫瘤活性。為制備抗腫瘤藥物或保健類食品提供了新的選擇。
具體實施方式
實施例1
(1)取于秋季采收的向日葵的稈，將向日葵莖芯剝離出來，置于陰涼處自然風(fēng)干，再放入40℃烘箱中干燥8h。將干燥的向日葵莖芯用粉碎機粉碎后備用。
(2)取一定量干燥的向日葵莖芯粉末，過60目篩，用95％乙醇回流提取兩次，以去除脂溶性成分；再用80％乙醇回流提取兩次，以除去單糖和低聚糖。所得殘渣烘干，揮發(fā)去除有機溶劑后，在料液比為1：30，浸提時間為3.0h，和浸提溫度為80℃的條件下，對向日葵莖芯多糖進(jìn)行多次浸煮提取。
(3)收集合并多次浸煮提取所得提取液，將提取液過濾后減壓濃縮后加入95％乙醇，靜置24h，3000r/min離心15min得沉淀，將所得沉淀用丙酮、乙醇洗滌并烘干，即得到向日葵莖芯多糖粗產(chǎn)品。
(4)取上述多糖粗產(chǎn)品，經(jīng)過除蛋白后，溶解于純化水中，過DEAE纖維素DE-52離子交換柱進(jìn)行分離，以0.5mL/min的流速，依次用4種不同濃度的NaCI溶液梯度洗脫，收集四種洗脫組分，經(jīng)透析、濃縮、冷凍干燥，得到四種不同的洗脫組分HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3和HALWP-4。
實施例2
(1)取于秋季采收的向日葵的稈，將向日葵莖芯剝離出來，置于陰涼處自然風(fēng)干，再放入40℃烘箱中干燥8h。將干燥的向日葵莖芯用粉碎機粉碎后備用。
(2)取一定量干燥的向日葵莖芯粉末，過80目篩，用95％乙醇回流提取兩次，以去除脂溶性成分；再用80％乙醇回流提取兩次，以除去單糖和低聚糖。所得殘渣烘干，揮發(fā)去除有機溶劑后，在料液比為1：40，浸提時間為3.5h，和浸提溫度為90℃的條件下，對向日葵莖芯多糖進(jìn)行多次浸煮提取。
(3)收集合并多次浸煮提取所得提取液，將提取液過濾后減壓濃縮后加入95％乙醇，靜置24h，3000r/min離心15min得沉淀，將所得沉淀用丙酮、乙醇洗滌并烘干，即得到向日葵莖芯多糖粗產(chǎn)品。
(4)取上述多糖粗產(chǎn)品，經(jīng)過除蛋白后，溶解于純化水中，過DEAE纖維素DE-52離子交換柱進(jìn)行分離，以1.0mL/min的流速，依次用4種不同濃度的NaCI溶液梯度洗脫，收集四種洗脫組分，經(jīng)透析、濃縮、冷凍干燥，得到四種不同的洗脫組分HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3和HALWP-4。
實施例3
(1)取于秋季采收的向日葵的稈，將向日葵莖芯剝離出來，置于陰涼處自然風(fēng)干，再放入40℃烘箱中干燥8h。將干燥的向日葵莖芯用粉碎機粉碎后備用。
(2)取一定量干燥的向日葵莖芯粉末，過100目篩，用95％乙醇回流提取兩次，以去除脂溶性成分；再用80％乙醇回流提取兩次，以除去單糖和低聚糖。所得殘渣烘干，揮發(fā)去除有機溶劑后，在料液比為1：50，浸提時間為4.0h，和浸提溫度為100℃的條件下，對向日葵莖芯多糖進(jìn)行多次浸煮提取。
(3)收集合并多次浸煮提取所得提取液，將提取液過濾后減壓濃縮后加入95％乙醇，靜置24h，3000r/min離心15min得沉淀，將所得沉淀用丙酮、乙醇洗滌并烘干，即得到向日葵莖芯多糖粗產(chǎn)品。
(4)取上述多糖粗產(chǎn)品，經(jīng)過除蛋白后，溶解于純化水中，過DEAE纖維素DE-52離子交換柱進(jìn)行分離，以1.5mL/min的流速，依次用4種不同濃度的NaCI溶液梯度洗脫，收集四種洗脫組分，經(jīng)透析、濃縮、冷凍干燥，得到四種不同的洗脫組分HALWP-1、HALWP-2、HALWP-3和HALWP-4。