本發(fā)明屬于生物化學(xué)材料領(lǐng)域，涉及一種基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光原理用于選擇性檢測(cè)半胱氨酸的熒光試劑、合成方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)是人體內(nèi)最為常見的三種巰基氨基酸，是細(xì)胞中的主要活性物質(zhì)。其中Cys是構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種基本氨基酸中唯一的巰基氨基酸，具有重要的生理功能。兩個(gè)Cys殘基中的巰基可以通過(guò)形成二硫鍵來(lái)保持蛋白質(zhì)空間立體結(jié)構(gòu)。Cys中巰基的氧化還原性質(zhì)直接決定了蛋白質(zhì)和寡肽的生物活性，使其具有抗衰老性能，可清除生物體內(nèi)自由基，對(duì)氨基酸的轉(zhuǎn)換和吸收都有至關(guān)重要的作用。體內(nèi)Cys的缺乏與多種疾病密切相關(guān)，如兒童生長(zhǎng)緩慢、頭發(fā)褪色、肝臟損傷、皮膚損傷、水腫、嗜睡癥等。Cys的重要生理作用激發(fā)了科學(xué)家們對(duì)其檢測(cè)方法的研究，其中熒光探針?lè)ㄓ捎诰哂胁僮骱?jiǎn)單、靈敏度高、檢測(cè)限低、可應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)或活體成像等優(yōu)點(diǎn)受到了科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。但是由于Cys、Hcy、GSH的結(jié)構(gòu)十分類似，所含巰基的反應(yīng)活性相當(dāng)，因此目前能夠特異性的將Cys與Hcy、GSH區(qū)分開來(lái)的熒光探針還比較少，并且這些為數(shù)不多的熒光探針?biāo)捎玫臒晒夥肿哟蠖鄶?shù)在高濃度時(shí)極易發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象，即聚集誘導(dǎo)熒光猝滅現(xiàn)象(aggregation caused quenching，ACQ)。這種現(xiàn)象迫使研究人員在檢測(cè)過(guò)程中只能使用稀溶液，導(dǎo)致檢測(cè)信噪比低，限制了這些Cys熒光探針的實(shí)際應(yīng)用。

2001年，唐本忠等人發(fā)現(xiàn)了一種在溶液狀態(tài)下呈現(xiàn)無(wú)熒光或弱熒光，但是在聚集態(tài)呈現(xiàn)強(qiáng)熒光的特殊熒光分子，并將這種特殊的發(fā)光現(xiàn)象稱為聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aggregation induced emission,AIE)效應(yīng)。具有AIE效應(yīng)的熒光分子由于具有高熒光量子產(chǎn)率、強(qiáng)抗漂白性、無(wú)需低濃度下檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，為Turn-on型熒光探針的設(shè)計(jì)提供了新的思路。其中四苯乙烯類分子(tetraphenylethylene,TPE)更是設(shè)計(jì)AIE類熒光探針的熱門分子。本發(fā)明利用TPE分子的AIE特性，通過(guò)在TPE分子上連接2,4-二硝基苯磺?；鶊F(tuán)作為巰基的響應(yīng)基團(tuán)，合成了一種基于TPE分子的Cys特異性熒光試劑TPENNO₂。其中2,4-二硝基苯磺?；鶊F(tuán)可猝滅TPENNO₂分子的熒光，當(dāng)與巰基反應(yīng)后，2,4-二硝基苯磺?；鶊F(tuán)離去，生成具有AIE特性的TPE分子TPENH₂，熒光恢復(fù)。該方法設(shè)計(jì)的Cys特異性熒光試劑TPENNO₂具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、抗漂白能力強(qiáng)、能夠?qū)ys與結(jié)構(gòu)和反應(yīng)性相似的Hcy和GSH區(qū)分開來(lái)的特點(diǎn)。TPENNO₂對(duì)Cys的特異性響應(yīng)來(lái)源于其與Cys、Hcy、GSH中巰基的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)差異。并且，TPENNO₂還可在活細(xì)胞中檢測(cè)巰基化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的內(nèi)容是一種基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光原理用于選擇性檢測(cè)半胱氨酸的熒光試劑、合成方法及其應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案是：一種選擇性檢測(cè)Cys的熒光試劑，具有如下結(jié)構(gòu)：

該目標(biāo)化合物中的2,4-二硝基苯磺酰基團(tuán)可猝滅分子的熒光，使其在溶液中不發(fā)光。

一種選擇性檢測(cè)Cys的熒光試劑的合成方法，合成路線如下：

第一步：二苯甲酮和鋅粉加到四氫呋喃中，攪拌下冷卻到-20℃半小時(shí)，然后緩慢滴入四氯化鈦，在-20℃繼續(xù)攪拌半小時(shí)后，緩慢升至室溫，然后加熱回流過(guò)夜，冷卻，過(guò)濾，濃縮后利用柱層析法分離純化，得到具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性的化合物1；

第二步：將化合物1加入醋酸和二氯甲烷中，冷卻到-20℃后，將濃硝酸(65％)加到反應(yīng)液中，在-20℃繼續(xù)攪拌15min后，加入冷水分液萃取，有機(jī)相用水洗滌三次，干燥濃縮，殘余物用甲醇重結(jié)晶得黃色固體化合物2；

第三步：將化合物2、Pd/C加到乙醇中，室溫下攪拌15min，將水合肼(85％)加入反應(yīng)液中回流4h，冷卻后抽濾，濾液濃縮后用甲醇重結(jié)晶得還原產(chǎn)物TPENH₂；

第四步：化合物TPENH₂與2,4-二硝基苯磺酰氯在碳酸鉀作用下發(fā)生反應(yīng)，生成目標(biāo)化合物TPENNO₂，利用柱層析提純后，目標(biāo)化合物TPENNO₂的結(jié)構(gòu)經(jīng)¹H NMR、¹³CNMR和高分辨質(zhì)譜鑒定。

一種選擇性檢測(cè)Cys的熒光試劑的應(yīng)用：

在目標(biāo)化合物TPENNO₂中含有一個(gè)2,4-二硝基苯磺?；鶊F(tuán)，該基團(tuán)的強(qiáng)拉電子能力可猝滅TPENNO₂的發(fā)光。在本發(fā)明中，用于檢測(cè)Cys的溶劑為PBS緩沖溶液(50mM,pH 7.4，含2.5％的DMSO，目標(biāo)化合物TPENNO₂的濃度為25μM)，向溶液中加入200μM的Cys，在37℃下孵化，檢測(cè)溶液熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化情況，結(jié)果表明，在37℃下孵化30min后，溶液的熒光強(qiáng)度基本達(dá)到飽和。

在25μM的目標(biāo)化合物TPENNO₂的PBS溶液中加入不同濃度的Cys，在37℃下孵化30min后，測(cè)定目標(biāo)化合物TPENNO₂的熒光強(qiáng)度隨Cys濃度的變化情況。在60至100μM Cys濃度范圍內(nèi)目標(biāo)化合物TPENNO₂的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

向目標(biāo)化合物TPENNO₂的溶液中加入Cys后，Cys中的巰基與目標(biāo)化合物TPENNO₂發(fā)生親核芳香取代反應(yīng)(nucleophilic aromatic substitution reaction)，C-S鍵斷裂，并進(jìn)一步消除一分子SO₂后生成TPENH₂。TPENH₂是具有AIE效應(yīng)的分子，在水溶液中生成聚集態(tài)，因而溶液熒光大大增強(qiáng)。為了了解目標(biāo)化合物TPENNO₂對(duì)Cys的選擇性，本發(fā)明對(duì)人體內(nèi)必需氨基酸、Hcy、GSH等與目標(biāo)化合物TPENNO₂反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度也進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，除Cys外的其他分子，特別是與Cys具有相似結(jié)構(gòu)和反應(yīng)性的Hcy、GSH與目標(biāo)化合物TPENNO₂反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度均沒(méi)有明顯增強(qiáng)，說(shuō)明TPENNO₂對(duì)Cys的特異性。反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明，TPENNO₂對(duì)Cys的特異性響應(yīng)來(lái)源于TPENNO₂與Cys、Hcy和GSH中巰基反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)差異，如，TPENNO₂與Cys、Hcy和GSH中巰基的一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)分別為1.3×10^-1min^-1，5.3×10^-2min^-1和4.8×10^-3min^-1。

人乳腺癌(HeLa)細(xì)胞內(nèi)巰基化合物熒光成像：本發(fā)明測(cè)定了目標(biāo)化合物TPENNO₂對(duì)HeLa細(xì)胞中巰基化合物的熒光成像情況和應(yīng)用潛力。目標(biāo)化合物TPENNO₂用二甲基亞砜(DMSO)溶解準(zhǔn)確配制成1mM的母液，然后再用培養(yǎng)基稀釋成4μM的稀釋液。移取200μL的稀釋液加入HeLa細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于室溫下孵育20min，用PBS緩沖溶液沖洗細(xì)胞培養(yǎng)皿洗去多余染料分子。在405nm激發(fā)下用共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的熒光成像情況，采集450-550nm的熒光信號(hào)進(jìn)行熒光成像。結(jié)果表明，目標(biāo)化合物TPENNO₂可在HeLa細(xì)胞中呈現(xiàn)綠色熒光信號(hào)。而同樣條件下，先將含0.5mM Cys的培養(yǎng)基加入HeLa細(xì)胞培養(yǎng)皿中孵育24h，再加入含目標(biāo)化合物TPENNO₂ 4μM的培養(yǎng)基孵育20min，用PBS緩沖溶液沖洗細(xì)胞培養(yǎng)皿洗去多余染料分子進(jìn)行熒光成像，結(jié)果表明，目標(biāo)化合物TPENNO₂在HeLa細(xì)胞中的熒光信號(hào)增強(qiáng)。將0.5mM Cys的培養(yǎng)基改為0.5mM NEM(N-乙基馬來(lái)酰亞胺，一種可消耗細(xì)胞內(nèi)巰基化合物的試劑)的培養(yǎng)基孵育15min，再用含目標(biāo)化合物TPENNO₂ 4μM的培養(yǎng)基孵育20min，用PBS緩沖溶液沖洗細(xì)胞培養(yǎng)皿洗去多余染料分子進(jìn)行熒光成像，結(jié)果表明，目標(biāo)化合物TPENNO₂在HeLa細(xì)胞中的熒光信號(hào)減弱，說(shuō)明目標(biāo)化合物TPENNO₂可應(yīng)用于對(duì)細(xì)胞內(nèi)巰基化合物的熒光成像。

發(fā)明人通過(guò)簡(jiǎn)單的設(shè)計(jì)與合成，將目標(biāo)化合物TPENNO₂成功用于Cys的特異性檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明合成步驟簡(jiǎn)單，較易大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用，對(duì)Cys的選擇性高，克服了傳統(tǒng)染料分子易漂白、僅能在稀溶液中檢測(cè)的缺點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1(a)在25μM化合物TPENNO₂的PBS緩沖溶液中加入不同濃度的Cys，37℃孵化30min后熒光發(fā)射光譜的變化；(b)25μM化合物TPENNO₂在490nm處熒光強(qiáng)度與Cys濃度的關(guān)系及線性擬合曲線圖。

圖2(a)在25μM化合物TPENNO₂的PBS緩沖溶液中分別加入300μM的體內(nèi)必需氨基酸、Cys、Hcy、GSH孵化30min后熒光發(fā)射光譜的變化，(b)在25μM化合物TPENNO₂的PBS緩沖溶液中分別加入300μM Cys、Hcy、GSH孵化30min后，490nm處熒光強(qiáng)度變化的柱狀圖。

圖3化合物TPENNO₂與HeLa細(xì)胞37℃下孵化20min后的激光共聚焦顯微成像照片。(a)4μM化合物TPENNO₂與HeLa細(xì)胞在37℃下孵化20min后的明場(chǎng)照片；(b)化合物TPENNO₂與HeLa細(xì)胞在37℃下孵化20min后的熒光照片；(c)為(a)與(b)的疊加圖；(d)0.5mM Cys與HeLa細(xì)胞在37℃下孵化24h后再與4μM化合物TPENNO₂37℃下孵化20min后的明場(chǎng)照片；(e)0.5mM Cys與HeLa細(xì)胞在37℃下孵化24h后再與4μM化合物TPENNO₂與HeLa細(xì)胞在37℃下孵化20min后的熒光照片；(f)為(d)與(e)的疊加圖；(g)0.5mM NEM與HeLa細(xì)胞在37℃下孵化15min后再與4μM化合物TPENNO₂ 37℃下孵化20min后的明場(chǎng)照片；(h)0.5mM NEM與HeLa細(xì)胞在37℃下孵化15min后再與4μM化合物TPENNO₂與HeLa細(xì)胞在37℃下孵化20min后的熒光照片；(i)為(g)與(h)的疊加圖。

具體實(shí)施方式

本實(shí)施例中所用的原料均為已知化合物，可以由商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1

目標(biāo)化合物TPENNO₂的合成

(1)化合物1的合成：將二苯甲酮(1.8g,10mmol)和鋅粉(5.2g,80mmol)加到四氫呋喃中，攪拌下冷卻到-20℃半小時(shí)，然后緩慢滴入四氯化鈦(4.4mL,40mmol)，在-20℃繼續(xù)攪拌半小時(shí)后，緩慢升至室溫，然后加熱回流過(guò)夜，冷卻，過(guò)濾，濃縮后利用柱層析法分離純化，得到具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性的化合物1，產(chǎn)率為72％。

(2)化合物2的合成：將化合物1(2.64g,8mmol)、醋酸(1.9mL,32mmol)加到二氯甲烷中，冷卻到-20℃后，將濃硝酸(65％,1.6mL,24mmol)加到反應(yīng)液中，在-20℃繼續(xù)攪拌15min后，加入冷水分液萃取，有機(jī)相用水洗滌三次，干燥濃縮，殘余物用甲醇重結(jié)晶得黃色固體2，產(chǎn)率為90％。

(3)化合物TPENH₂的合成：將化合物2(1.2g,3.18mmol)、10％Pd/C(100mg)、加到乙醇中，室溫下攪拌15min，將水合肼(85％)(5.4mL,95.4mmol)加入反應(yīng)液中回流4h，冷卻后抽濾，濾液濃縮后用甲醇重結(jié)晶得還原產(chǎn)物TPENH₂，產(chǎn)率為85％。核磁表征數(shù)據(jù)為：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ＝7.16–7.03(m,9H),6.99–6.93(m,4H),6.90(d,J＝6.7Hz,2H),6.57(d,J＝8.4Hz,2H),6.27(d,J＝8.5Hz,2H),5.06(br,2H).

(4)化合物TPENNO₂的合成：將化合物TPENH₂(50mg,0.14mmol)和碳酸鉀(80mg,0.58mmol)加入20mL乙腈中冷卻至0℃。之后分批加入2,4-二硝基苯磺酰氯(85mg,0.32mmol)，將混合液在室溫下攪拌過(guò)夜，飽和食鹽水洗三次，乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥、濃縮、柱層析分離后得到化合物TPENNO₂，產(chǎn)率63％。核磁表征數(shù)據(jù)為：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ＝10.91(s,1H),8.90(d,J＝2.3Hz,1H),8.57(dd,J＝8.7,2.3Hz,1H),8.09(d,J＝8.7Hz,1H),7.12–7.03(m,9H),6.93–6.85(m,10H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ149.91,147.75,142.94,142.93,142.75,140.82,140.30,139.61,136.16,134.03,131.68,131.58,130.52,127.77,127.75,127.73,126.95,126.55,126.50,126.33,120.82,120.22.HR-MS(MALDI-TOF):m/z:577.1316,[M]⁺.

實(shí)施例2

Cys選擇性識(shí)別檢測(cè)

(1)Cys響應(yīng)時(shí)間測(cè)定：取50μL化合物TPENNO₂的DMSO溶液(1mM)于2mL PBS緩沖溶液中，加入200μM Cys，混合液在37℃下孵化不同的時(shí)間，測(cè)定混合溶液的熒光強(qiáng)度隨孵化時(shí)間的變化，結(jié)果表明，30min后，熒光強(qiáng)度基本達(dá)到飽和。

(2)Cys熒光滴定測(cè)試：取50μL化合物TPENNO₂的DMSO溶液(1mM)于2mL PBS緩沖溶液中，然后加入不同量的Cys的PBS溶液，混合溶液在37℃下孵化30min后，測(cè)定加入不同Cys后溶液的熒光發(fā)射光譜(E_x＝341nm)，在60至100μM Cys濃度范圍內(nèi)混合液的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(如圖1所示)。

(3)化合物TPENNO₂對(duì)Cys的選擇性測(cè)試：取50μL化合物TPENNO₂的DMSO溶液(1mM)于2mL PBS緩沖溶液中，然后分別加入300μM的體內(nèi)必需氨基酸、Cys、Hcy、GSH，混合溶液在37℃下孵化30min，然后測(cè)定溶液的熒光發(fā)射光譜(E_x＝341nm)。結(jié)果表明，除Cys外的其他分子與目標(biāo)化合物TPENNO₂反應(yīng)前后的熒光強(qiáng)度均沒(méi)有明顯增強(qiáng)(如圖2所示)，說(shuō)明該熒光試劑可以選擇性檢測(cè)Cys，而結(jié)構(gòu)和巰基反應(yīng)活性類似的Hcy和GSH干擾均較小。

實(shí)施例3

人乳腺癌(HeLa)細(xì)胞內(nèi)巰基化合物熒光成像：HeLa細(xì)胞經(jīng)過(guò)復(fù)蘇接種于含10％胎牛血清的DEME培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO₂、100％飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后在18mm蓋玻片上培養(yǎng)24h，待用。

將HeLa細(xì)胞分別浸入含4μM化合物TPENNO₂的培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO₂、100％飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min后，倒出培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基清洗細(xì)胞3遍。在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，并對(duì)其進(jìn)行明場(chǎng)和暗場(chǎng)下拍照(如圖3所示)。結(jié)果表明，目標(biāo)化合物TPENNO₂在HeLa細(xì)胞中呈現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，而同樣條件下，先將含0.5mM Cys的培養(yǎng)基加入HeLa細(xì)胞培養(yǎng)皿中孵育24h，再加入含目標(biāo)化合物TPENNO₂ 4μM的培養(yǎng)基孵育20min，用PBS緩沖溶液沖洗細(xì)胞培養(yǎng)皿洗去多余染料分子進(jìn)行熒光成像，結(jié)果表明，目標(biāo)化合物TPENNO₂在HeLa細(xì)胞中的熒光信號(hào)增強(qiáng)。將0.5mM Cys的培養(yǎng)基改為0.5mM NEM的培養(yǎng)基孵育15min，再用含目標(biāo)化合物TPENNO₂ 4μM的培養(yǎng)基孵育20min，用PBS緩沖溶液沖洗細(xì)胞培養(yǎng)皿洗去多余染料分子進(jìn)行熒光成像，結(jié)果表明，目標(biāo)化合物TPENNO₂在HeLa細(xì)胞中的熒光信號(hào)減弱，說(shuō)明目標(biāo)化合物TPENNO₂可成功應(yīng)用于對(duì)細(xì)胞內(nèi)巰基化合物的熒光成像。