1.一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達(dá)菌株,其特征在于該菌株是由以下方法制備的:
1)以斑馬魚糞便菌群的總DNA為模板,以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分別為上、下游引物執(zhí)行PCR擴(kuò)增,得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段,即為pBpp蛋白表達(dá)基因;
2)取步驟1)所獲得的pBpp蛋白表達(dá)基因,連接到Abvec載體上,即得到重組質(zhì)粒Abvec-pBpp;
3)取步驟2)所得的重組質(zhì)粒Abvec-pBpp,轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli Top10中,得到重組菌株;
4)培養(yǎng)步驟3)所得的重組菌株,從中提取重組質(zhì)粒Abvec-pBpp,將其通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入感受態(tài)的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009中,通過氨芐青霉素抗性篩選出陽(yáng)性克隆,得到重組表達(dá)菌株Abvec-pBpp-VNP20009,即為所述減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達(dá)菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達(dá)菌株,其特征在于步驟2)中pBpp蛋白表達(dá)基因與Abvec載體的連接是先經(jīng)Age I和Bsiw I雙酶切,酶切產(chǎn)物純化后采用T4連接酶連接到Abvec載體上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達(dá)菌株,其特征在于步驟4)所述的電轉(zhuǎn)法包括以下步驟:取重組質(zhì)粒Abvec-pBpp與所述處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株在電轉(zhuǎn)杯中混合,而后以電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉(zhuǎn)4.7ms。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達(dá)菌株,其特征在于步驟4)所述感受態(tài)的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009,是通過以下方法制備的:
A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落;
B)挑取單菌落接種于3~7ml LB液體培養(yǎng)基中,35~39℃振蕩培養(yǎng)10~14h;
C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液,按1:80~1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至菌液OD值不小于0.4;
D)冰浴15~25min后,離心取沉淀用1/8~1/12體積預(yù)冷的無菌去離子水洗滌,而后離心取沉淀用1/80~1/120體積預(yù)冷的、8~12%(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體,再離心沉淀重懸于1/80~1/120體積預(yù)冷的、8~12%(mL/mL)的甘油中。
5.應(yīng)用權(quán)利要求1所述pBpp重組蛋白表達(dá)菌株制備pBpp重組蛋白的方法,其特征在于包括以下步驟:取HEK293-T細(xì)胞與所述pBpp重組蛋白表達(dá)菌株,以二者的細(xì)胞量為1:80~1:120的比例在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合,培養(yǎng)4~16h,而后將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基,培養(yǎng)40~56h,而后破碎細(xì)胞收集上清。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于HEK293-T細(xì)胞的加入量為8000~12000個(gè)/孔;HEK293-T細(xì)胞與所述pBpp重組蛋白表達(dá)菌株在細(xì)胞培養(yǎng)板中混合后每孔中液體總體積為380~420μL。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于所述針對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抗生素是青霉素和鏈霉素。
8.一種權(quán)利要求1所述pBpp重組蛋白表達(dá)菌株的功能驗(yàn)證方法,其特征在于包括以下步驟:
1)取小鼠,連續(xù)5d以每天50mg/kg的劑量注射鏈脲佐菌素,得到II型糖尿病模型小鼠;
2)取pBpp重組蛋白表達(dá)菌株,以灌胃的方式對(duì)步驟1)所得的II型糖尿病模型小鼠給藥,每次給藥劑量為105~106CFU,每2天給藥1次;每隔7天監(jiān)測(cè)所述II型糖尿病模型小鼠的血糖變化。