本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，進一步涉及重組蛋白表達系統(tǒng)的構(gòu)建技術(shù)，具體涉及一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達菌株及其功能驗證方法。

背景技術(shù)：

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各種致病因子作用于機體導(dǎo)致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合征，臨床上以高血糖為主要特點。

目前，我國Ⅱ型糖尿病的患病率增長較快，據(jù)1979年在我國30萬人口中的調(diào)查，糖尿病患病率為0.6％，1989年為2.02％，年均增長0.1％左右，1994年我國普查20萬人口，患病率已上升為2.5％，目前20～75歲人群中糖尿病患病率約為3％左右。糖耐量低減患者不低于3％。一般而言，在我國富裕地區(qū)的糖尿病患病率高于貧困地區(qū)，城市高于農(nóng)村，肥胖高于正常體重，高齡高于低齡。目前我國糖尿病發(fā)病率為1/1000左右，50歲以上的平均患病率為7％以上，40歲以下患病率隨著年齡的增長而升高，患者高峰年齡在50～70歲。

我國患病率以北京、遼寧、寧夏、甘肅、云南、福建較高，據(jù)1979～1997年調(diào)查結(jié)果表明為全國之首，而新疆、貴州、山西較低。發(fā)病率較高的北京、遼寧與最低的貴州、新疆之間相差達10倍，城市發(fā)病率高于農(nóng)村1～4倍，廣西地區(qū)調(diào)查證明，產(chǎn)糖地區(qū)糖尿病患病率高于非產(chǎn)糖區(qū)2倍。

盡管多種治療方法可以控制血糖濃度，但目前仍未實現(xiàn)糖尿病的根治?，F(xiàn)有技術(shù)中，藥物干預(yù)仍是糖尿病治療的主要手段，其中以GLP-1類似物、DPPIV抑制劑等應(yīng)用較為廣泛。pBpp蛋白(promotingβ-Cell proliferation protein)，是指可誘導(dǎo)胰腺中β細胞增殖、進而促進胰島素分泌的一類功能性蛋白，由于其不直接參與人體糖代謝機制，因此降糖作用較為溫和，對人體副作用較小。然而，此類蛋白的規(guī)?；a(chǎn)是目前制約其臨床應(yīng)用的直接技術(shù)問題，其中人源蛋白的獲取較為困難，而其他生物來源的pBpp蛋白其藥效及安全性又難以得到保障。此外，盡管具有確切的β細胞增殖誘導(dǎo)效果，但由于pBpp蛋白對胰島細胞靶向性不高，因此在一定程度上影響了pBpp蛋白的藥效。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達菌株及其功能驗證方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種pBpp蛋白表達系統(tǒng)的技術(shù)問題。

本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是常規(guī)的在利用pBpp蛋白進行血糖調(diào)節(jié)的過程中，pBpp蛋白本身缺乏靶向性。

本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中pBpp蛋白表達菌株對哺乳動物血糖的調(diào)節(jié)效果難以得到準(zhǔn)確的量化考察。

為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達菌株，該菌株是由以下方法制備的：

1)以斑馬魚糞便菌群的總DNA為模板，以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分別為上、下游引物執(zhí)行PCR擴增，得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段，即為pBpp蛋白表達基因；

2)取步驟1)所獲得的pBpp蛋白表達基因，連接到Abvec載體上，即得到重組質(zhì)粒Abvec-pBpp；

3)取步驟2)所得的重組質(zhì)粒Abvec-pBpp，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli Top10中，得到重組菌株；

4)培養(yǎng)步驟3)所得的重組菌株，從中提取重組質(zhì)粒Abvec-pBpp，將其通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入感受態(tài)的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009中，通過氨芐青霉素抗性篩選出陽性克隆，得到重組表達菌株Abvec-pBpp-VNP20009，即為所述減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達菌株。

作為優(yōu)選，步驟2)中pBpp蛋白表達基因與Abvec載體的連接是先經(jīng)Age I和Bsiw I雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后采用T4連接酶連接到Abvec載體上。

作為優(yōu)選，步驟4)所述的電轉(zhuǎn)法包括以下步驟：取重組質(zhì)粒Abvec-pBpp與所述處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株在電轉(zhuǎn)杯中混合，而后以電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉(zhuǎn)4.7ms。

作為優(yōu)選，步驟4)所述感受態(tài)的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009，是通過以下方法制備的：

A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；

B)挑取單菌落接種于3～7ml LB液體培養(yǎng)基中，35～39℃振蕩培養(yǎng)10～14h；

C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:80～1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值不小于0.4；

D)冰浴15～25min后，離心取沉淀用1/8～1/12體積預(yù)冷的無菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/80～1/120體積預(yù)冷的、8～12％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/80～1/120體積預(yù)冷的、8～12％(mL/mL)的甘油中。

一種上述pBpp重組蛋白表達菌株制備pBpp重組蛋白的方法，包括以下步驟：取HEK293-T細胞與所述pBpp重組蛋白表達菌株，以二者的細胞量為1:80～1:120的比例在細胞培養(yǎng)板中混合，培養(yǎng)4～16h，而后將細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40～56h，而后破碎細胞收集上清。

作為優(yōu)選，HEK293-T細胞的加入量為8000～12000個/孔；HEK293-T細胞與所述pBpp重組蛋白表達菌株在細胞培養(yǎng)板中混合后每孔中液體總體積為380～420μL。

作為優(yōu)選，所述針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素是青霉素和鏈霉素。

一種上述pBpp重組蛋白表達菌株的功能驗證方法，其特征在于包括以下步驟：

1)取小鼠，連續(xù)5d以每天50mg/kg的劑量注射鏈脲佐菌素，得到II型糖尿病模型小鼠；

2)取pBpp重組蛋白表達菌株，以灌胃的方式對步驟1)所得的II型糖尿病模型小鼠給藥，每次給藥劑量為10⁵～10⁶CFU，每2天給藥1次；每隔7天監(jiān)測所述II型糖尿病模型小鼠的血糖變化。

本發(fā)明提供了一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達菌株及其功能驗證方法，該技術(shù)方案以斑馬魚糞便菌群DNA為模板，擴增得到pBpp表達基因，再利用Abvec質(zhì)粒為載體，先于大腸桿菌TOP10中擴增質(zhì)粒，而后采用電擊轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株。該技術(shù)方案依托于減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009胞內(nèi)侵襲的特性，可攜帶pBpp蛋白靶向作用于胰島β細胞，在保證pBpp蛋白高效表達的基礎(chǔ)上提升其血糖調(diào)節(jié)作用。

在此基礎(chǔ)上，為考察上述菌株的降糖效果，本發(fā)明建立了相應(yīng)的功能驗證方法，該方法先利用鏈脲佐菌素構(gòu)建II型糖尿病模型小鼠，而后采用灌胃的方式進行活菌給藥，以給藥后小鼠血糖變化情況來對菌株的降糖效果進行分析。實驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所提供的pBpp重組蛋白表達菌株可確切誘導(dǎo)胰腺中β細胞的增殖，從而對因胰島β細胞損傷所導(dǎo)致的糖尿病起到治療效果。

具體實施方式

以下將對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。

以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。

以下實施例中，所用到的E.coli Top10，減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009，Abvec載體質(zhì)粒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；所用到的限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA連接酶購自NEB公司；所用到的LB固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基由本實驗室自行配制。

實施例1

1、pBpp重組蛋白表達菌株的構(gòu)建

以斑馬魚糞便菌群DNA為模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2序列為引物，PCR擴增獲得SEQ ID No.3所示的pBpp片段，命名為pBpp。

已獲得的pBpp片段和質(zhì)粒Abvec，經(jīng)Age I和Bsiw I雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后，采用T4連接酶連接到Abvec(SEQ ID No.4)質(zhì)粒中，重組質(zhì)粒命名為Abvec-pBpp。

將-80℃保存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009劃線接種于無抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取單個菌落于5ml LB中，37℃振蕩培養(yǎng)12h；按1：100比例接種于100ml LB中振蕩培養(yǎng)至細菌OD＝0.4左右；冰浴20min后，4℃3000rpm離心10min；菌體沉淀用1/10體積預(yù)冷的無菌去離子水洗滌兩次，4℃3000rpm離心10min；菌體沉淀再次用1/100體積預(yù)冷的10％甘油洗滌菌體，4℃3000rpm離心10min；將菌體沉淀重懸于1/100體積預(yù)冷的10％甘油中，制成VNP20009感受態(tài)分裝后-80留存?zhèn)溆谩?/p>

將已獲得的重組質(zhì)粒Abvec-pBpp電轉(zhuǎn)進入減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009中，采用0.1cm電轉(zhuǎn)杯，條件設(shè)置為：1.8kv 200Ω25uF，電轉(zhuǎn)4.7ms；通過氨芐青霉素抗性篩選出陽性克隆，獲得重組減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009，命名為Abvec-pBpp-VNP20009。

2、pBpp重組蛋白表達菌株的功能驗證

試劑配置：0.1M枸櫞酸緩沖液(PH4.5)：0.1M枸櫞酸液4.5mL(0.21014枸櫞酸溶于10mL蒸餾水中)+0.1M枸櫞酸鈉液5.5mL(0.29412枸櫞酸鈉溶于10mL蒸餾水中)；7.5mg/mL無菌STZ溶液(取37.5mgSTZ溶于5mL枸櫞酸緩沖液，與超凈臺0.22um濾器過濾，分裝存于-20℃即可)(注意避光)

(1)劑量及給藥方式：陽性組：50mg/kg/天STZ溶液；陰性組：與陽性組同等劑量枸櫞酸緩沖液；

給藥方式：腹腔注射；

(2)取12只健康雄性老鼠，觀察24h，無異常后進行試驗；小鼠隨機分為2組，稱重；第一次給藥前饑餓處理24h，禁食不禁水；稱重后，按照陽性組劑量換算后，與超凈臺中腹腔注射STZ藥物，打完后，正常給予飼料，無菌水喂養(yǎng)，連續(xù)5天同一時間注射STZ藥物；并于打完第3，7，10，14，21，28天用試紙測定小鼠空腹8h后的血糖和接著喂食2h后的血糖，若陽性組大于11.1mmol/L，則造模成功；

(3)造模成功后，每日灌胃Abvec-pBpp-VNP20009，灌胃10⁵-10⁶CFU/次，灌胃頻率2天一次，正常飲食；陰性組，灌胃PBS作為對照；

(4)在第7天，第14天，第21天檢測小鼠空腹8h后的血糖及接著喂食2h后的血糖，觀察血糖有無下降；

實施例2

一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達菌株，該菌株是由以下方法制備的：

1)以斑馬魚糞便菌群的總DNA為模板，以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分別為上、下游引物執(zhí)行PCR擴增，得到序列如SEQID No.3所示的DNA片段，即為pBpp蛋白表達基因；

2)取步驟1)所獲得的pBpp蛋白表達基因，連接到Abvec載體上，即得到重組質(zhì)粒Abvec-pBpp；

3)取步驟2)所得的重組質(zhì)粒Abvec-pBpp，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli Top10中，得到重組菌株；

4)培養(yǎng)步驟3)所得的重組菌株，從中提取重組質(zhì)粒Abvec-pBpp，將其通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入感受態(tài)的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009中，通過氨芐青霉素抗性篩選出陽性克隆，得到重組表達菌株Abvec-pBpp-VNP20009，即為所述減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達菌株。

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：

步驟2)中pBpp蛋白表達基因與Abvec載體的連接是先經(jīng)Age I和Bsiw I雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后采用T4連接酶連接到Abvec載體上。

步驟4)所述的電轉(zhuǎn)法包括以下步驟：取重組質(zhì)粒Abvec-pBpp與所述處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株在電轉(zhuǎn)杯中混合，而后以電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉(zhuǎn)4.7ms。

步驟4)所述感受態(tài)的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009，是通過以下方法制備的：

A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；

B)挑取單菌落接種于3ml LB液體培養(yǎng)基中，35℃振蕩培養(yǎng)10h；

C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:80的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值為0.4；

D)冰浴15min后，離心取沉淀用1/8體積預(yù)冷的無菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/80體積預(yù)冷的、8％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/80體積預(yù)冷的、8％(mL/mL)的甘油中。

應(yīng)用上述pBpp重組蛋白表達菌株制備pBpp重組蛋白的方法，包括以下步驟：取HEK293-T細胞與所述pBpp重組蛋白表達菌株，以二者的細胞量為1:80的比例在細胞培養(yǎng)板中混合，培養(yǎng)4h，而后將細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40h，而后破碎細胞收集上清。

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：

HEK293-T細胞的加入量為8000個/孔；HEK293-T細胞與所述pBpp重組蛋白表達菌株在細胞培養(yǎng)板中混合后每孔中液體總體積為380μL。

所述針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素是青霉素和鏈霉素。

上述述pBpp重組蛋白表達菌株的功能驗證方法，包括以下步驟：

1)取小鼠，連續(xù)5d以每天50mg/kg的劑量注射鏈脲佐菌素，得到II型糖尿病模型小鼠；

2)取pBpp重組蛋白表達菌株，以灌胃的方式對步驟1)所得的II型糖尿病模型小鼠給藥，每次給藥劑量為10⁵CFU，每2天給藥1次；每隔7天監(jiān)測所述II型糖尿病模型小鼠的血糖變化。

實施例3

一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達菌株，該菌株是由以下方法制備的：

1)以斑馬魚糞便菌群的總DNA為模板，以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分別為上、下游引物執(zhí)行PCR擴增，得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段，即為pBpp蛋白表達基因；

2)取步驟1)所獲得的pBpp蛋白表達基因，連接到Abvec載體上，即得到重組質(zhì)粒Abvec-pBpp；

3)取步驟2)所得的重組質(zhì)粒Abvec-pBpp，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli Top10中，得到重組菌株；

4)培養(yǎng)步驟3)所得的重組菌株，從中提取重組質(zhì)粒Abvec-pBpp，將其通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入感受態(tài)的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009中，通過氨芐青霉素抗性篩選出陽性克隆，得到重組表達菌株Abvec-pBpp-VNP20009，即為所述減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達菌株。

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：

步驟2)中pBpp蛋白表達基因與Abvec載體的連接是先經(jīng)Age I和Bsiw I雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后采用T4連接酶連接到Abvec載體上。

步驟4)所述的電轉(zhuǎn)法包括以下步驟：取重組質(zhì)粒Abvec-pBpp與所述處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株在電轉(zhuǎn)杯中混合，而后以電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉(zhuǎn)4.7ms。

步驟4)所述感受態(tài)的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009，是通過以下方法制備的：

A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；

B)挑取單菌落接種于7ml LB液體培養(yǎng)基中，39℃振蕩培養(yǎng)14h；

C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值為0.6；

D)冰浴25min后，離心取沉淀用1/12體積預(yù)冷的無菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/120體積預(yù)冷的、12％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/120體積預(yù)冷的、12％(mL/mL)的甘油中。

應(yīng)用上述pBpp重組蛋白表達菌株制備pBpp重組蛋白的方法，包括以下步驟：取HEK293-T細胞與所述pBpp重組蛋白表達菌株，以二者的細胞量為1:120的比例在細胞培養(yǎng)板中混合，培養(yǎng)16h，而后將細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)56h，而后破碎細胞收集上清。

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：

HEK293-T細胞的加入量為12000個/孔；HEK293-T細胞與所述pBpp重組蛋白表達菌株在細胞培養(yǎng)板中混合后每孔中液體總體積為420μL。

上述述pBpp重組蛋白表達菌株的功能驗證方法，包括以下步驟：

1)取小鼠，連續(xù)5d以每天50mg/kg的劑量注射鏈脲佐菌素，得到II型糖尿病模型小鼠；

2)取pBpp重組蛋白表達菌株，以灌胃的方式對步驟1)所得的II型糖尿病模型小鼠給藥，每次給藥劑量為10⁶CFU，每2天給藥1次；每隔7天監(jiān)測所述II型糖尿病模型小鼠的血糖變化。

實施例4

一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達菌株，該菌株是由以下方法制備的：

1)以斑馬魚糞便菌群的總DNA為模板，以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分別為上、下游引物執(zhí)行PCR擴增，得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段，即為pBpp蛋白表達基因；

2)取步驟1)所獲得的pBpp蛋白表達基因，連接到Abvec載體上，即得到重組質(zhì)粒Abvec-pBpp；

3)取步驟2)所得的重組質(zhì)粒Abvec-pBpp，轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli Top10中，得到重組菌株；

4)培養(yǎng)步驟3)所得的重組菌株，從中提取重組質(zhì)粒Abvec-pBpp，將其通過電轉(zhuǎn)法導(dǎo)入感受態(tài)的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009中，通過氨芐青霉素抗性篩選出陽性克隆，得到重組表達菌株Abvec-pBpp-VNP20009，即為所述減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達菌株。

以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 南昌大學(xué)

<120> 一種減毒鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)的pBpp重組蛋白表達菌株及其功能驗證方法

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgtcgagtc gaaccggtat gaacaagcgt aactggttgc tg 42

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtcgtgctca ccgtacggcg gctcgtttca gtcaagtc 38

<210> 3

<211> 783

<212> DNA

<213> 天然序列（斑馬魚）

<400> 3

atgaacaagc gtaactggtt gctggccttg tcactgagtc tggccttctc accctgttat 60

gccgactggg ccaagctcaa ggccgcagcg tccgatctgg gagcggcagt gagcgagacc 120

agcaaggagg tgtggcagga tgtcagcgat ttctccaaga agagctgggc ttccatctct 180

gcatggggtg aagaggcgtt caataccgcc ggggtctgga ccgacaagag catcgcgacc 240

ggcaaggagt ggctgaaggc agccgacaag gagctcaacg agatgctcaa ccccaagacg 300

gcgaaagagg cgaggatcgc gatcaatacc atggccgaca ctgcgctgat ccggttgttc 360

aacgagcagc catcagccaa gttgttgttt gacaaggctt atggttatgc ggtgttcgat 420

tcgcgcaagt tctccctgat gctgcatacc aatcaggggg ccggggtggc agtcaatcgc 480

aaaaccggca agcacaccta tatgaagatg tttggtgcgg gtctggcggc cgggattggc 540

ggcaagttct atcagcaggt gatcctgttt gaagacaagg ccagattcga tgccttcgtg 600

acccaggggt gggaagctac ctccgaagtg ggtgtggtgg ccggcaagga gagcgctgag 660

ctgaccgcca aatataatgg cggcatggcc atctaccaga ttggcgagaa gggtttgctg 720

ctcgatgcca atatctccgg ctctaaatac tggattgaca aggacttgac tgaaacgagc 780

cgc 783

<210> 4

<211> 4756

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcgagctcg cccgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca 60

ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 120

ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 180

acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 240

ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 300

aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 360

tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat 420

gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 480

gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc 540

ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt 600

ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga 660

caccgggacc gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca ttggaacgcg gattccccgt 720

gccaagagtg acgtaagtac cgcctataga gtctataggc ccaccccctt ggcttcgtta 780

gaacgcggct acaattaata cataacctta tgtatcatac acatacgatt taggtgacac 840

tatagaataa catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gtccaactgc 900

acctcggttc tatcgattga attccaccat gggatggtca tgtatcatcc tttttctagt 960

agcaactgca accggtgtac actcgagcgt acgaagcttg gccgccatgg cccaacttgt 1020

ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 1080

catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 1140

tctggatcga tcgggaatta attcggcgca gcaccatggc ctgaaataac ctctgaaaga 1200

ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc tgtggaatgt gtgtcagtta 1260

gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 1320

tagtcagcaa ccaggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc 1380

atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta 1440

actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca 1500

gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga 1560

ggcctaggct tttgcaaaaa gctgttaaca gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 1620

gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccccttcg 1680

ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgtagcc 1740

tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac 1800

accgcatacg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 1860

tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 1920

cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 1980

ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 2040

tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 2100

gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 2160

tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 2220

aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat 2280

tttatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc aactccgcta 2340

tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 2400

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tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagta ttcttgaaga 2520

cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 2580

tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 2640

taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 2700

tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 2760

gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct 2820

gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 2880

cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 2940

tgtggcgcgg tattatcccg tgatgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 3000

tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 3060

atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac 3120

ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 3180

gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac 3240

gagcgtgaca ccacgatgcc agcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc 3300

gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt 3360

gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga 3420

gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 3480

cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag 3540

atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 3600

tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 3660

ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 3720

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tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta 3840

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ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 4080

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agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat 4260

agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg 4320

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accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca 4500

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attcattaat ccagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 4620

gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg 4680

gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 4740

catgattacg aattaa 4756