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一種高純度竹蓀多糖的制備方法與流程

文檔序號:12692098閱讀:1007來源:國知局

本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物多糖制備技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種竹蓀多糖的制備方法。



背景技術(shù):

竹蓀是世界上名貴的大型食用菌之一,營養(yǎng)豐富、味道鮮美,素有“菌中皇后”、“山珍之王”的稱號。竹蓀含有蛋白質(zhì)、多種氨基酸、維生素、多糖和多種微量元素等營養(yǎng)成分。竹蓀多糖廣泛存在于竹蓀子實體的細(xì)胞壁中,研究表明竹蓀多糖具有抗腫瘤、抗凝血、抗炎癥、刺激免疫以及降血壓、降血糖等療效,是竹蓀中重要的活性物質(zhì)。

目前,竹蓀多糖的制備一般是采用熱水提取、稀堿提取或者稀酸提取,然后經(jīng)過濃縮、醇沉等步驟得到竹蓀粗多糖。粗多糖再經(jīng)脫蛋白和柱層析等工藝得到純多糖。如杜昱光等人公布的高純度竹蓀多糖的制備方法是首先將原料經(jīng)預(yù)處理,熱水抽提,醇析,透析和洗滌等得到粗多糖,然后采用DEAE-纖維素柱進行層析分離獲得高純度竹蓀多糖(專利申請公開號為CN 1165148A)。王飛娟等制備得到的具有抑制腫瘤細(xì)胞生長的紅托竹蓀菌托多糖也是經(jīng)過水提醇沉、脫蛋白和Sephadex G-75柱層析獲得(專利申請公開號為CN 101029087A)。專利申請?zhí)枮镃N 104262500 A公布的“一種具有免疫活性的新型紅托竹蓀多糖及其制備方法和應(yīng)用”則是依次采用離子交換層析、凝膠過濾層析、超濾分離和凝膠過濾柱層析四步分離法對竹蓀多糖進行純化。這些竹蓀多糖制備方法耗時費力,不適宜進行大規(guī)模的應(yīng)用和竹蓀多糖相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的是提供一種高純度竹蓀多糖的制備方法,該方法高效快速,有效保存竹蓀多糖生物活性,極大地提高了竹蓀多糖的純度。另外,本法工藝過程綠色環(huán)保,沒有采用任何有害試劑,能夠保證食品的安全性。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。

本發(fā)明所述的一種高純度竹蓀多糖的制備方法,其特征是按如下步驟。

(1)將干燥的竹蓀子實體粉碎,然后采用90~100℃熱水提取,料液比(g/mL)為1:10~1:30,提取時間為2~6 h,提取次數(shù)為1~3次。合并提取液。提取液經(jīng)濃縮、干燥等工藝獲得竹蓀提取物。

(2)稱取一定量竹蓀提取物,加水溶解,溶解溫度為20~50 ℃,質(zhì)量體積比(g/mL)為1:5~1:30。

(3)向步驟(2)的溶液中緩慢加入體積分?jǐn)?shù)為95%~100%的乙醇溶液,直至體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)達到20%,于4~25 ℃靜置8~14 h,將上述醇沉體系3000~4800 r/min離心分離10~20 min,分別收集沉淀和上清液。

(4)向步驟(3)的離心分離所得上清液中繼續(xù)加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液,直至體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)達到40%,于4~25 ℃靜置8~14 h,將上述醇沉體系3000~4800 r/min離心分離10~20 min,分別收集沉淀和上清液。

(5)向步驟(4)的離心分離所得上清液中繼續(xù)加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液,直至體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)達到60%,于4~25 ℃靜置8~14 h,將上述醇沉體系3000~4800 r/min離心分離10~20 min,分別收集沉淀和上清液。

(6)向步驟(5)的離心分離所得上清液中繼續(xù)加入乙醇溶液(乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%)直至體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)達到80%,于4~25 ℃靜置8~14 h,將上述醇沉體系3000~4800 r/min離心分離10~20 min,分別收集沉淀和上清液。

(7)分別將步驟(4)、(5)和(6)中離心分離所得沉淀物加水復(fù)溶,轉(zhuǎn)移至裝入透析袋(截留分子量3500 Da)中,放置于冰盒中用蒸餾水透析48~72 h,得三個透析液濃縮。

(8)將步驟(7)中的三個透析液濃縮,分別加入乙醇溶液(乙醇體積分?jǐn)?shù)為95~100%),直至體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)達到80%,于4~25℃靜置8~14 h,將上述三個醇沉體系分別3000~4800 r/min離心分離10~20 min,離心所得沉淀物再用無水乙醇洗滌2~4次,干燥得到三個高純度竹蓀多糖組分。

本發(fā)明步驟(1)中提取液濃縮至原體積的1/5~1/20,干燥方式采用噴霧干燥或冷凍干燥。

本發(fā)明步驟(1)中提取液經(jīng)濃縮、干燥即得竹蓀提取物。竹蓀提取物呈暗黃色粉末,易溶于水,苯酚硫酸法測得糖含量為80%以上,完全酸水解之后只有葡萄糖檢出,液相色譜圖在13~19 min具有兩個明顯的特征峰(見附圖1)。

本發(fā)明以竹蓀為原料,通過提取及乙醇分級沉淀技術(shù)同時獲得三個級分的高純度竹蓀多糖樣品,其主要優(yōu)點是:1、多糖制備步驟簡單,所得多糖純度高,所得多糖的總糖含量達到85%以上,最高可以達到98%;2、制備工藝綠色環(huán)保,可為天然產(chǎn)物中高純度多糖提供參考,應(yīng)用前景廣。

附圖說明

圖1 為實施例1中高純度竹蓀多糖凝膠色譜示差信號圖。

具體實施方式

本發(fā)明將通過以下實施例作進一步說明。

實施例1。

稱取100 g竹蓀子實體粉末,90 ℃熱水浴條件下,1:30料液比(g/mL)提取2 h,提取2次后合并提取液,然后將提取液濃縮至800 mL左右,采用真空干燥獲得竹蓀提取物。稱取50 g竹蓀提取物,按質(zhì)量體積比(g/mL)1: 10的比例加500 mL水溶解后,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇沉淀多糖,體系中的乙醇體積分?jǐn)?shù)控制在20%,置于4 ℃靜置8 h,離心(4800 r/min,10 min),棄去沉淀。向上清液中繼續(xù)加入乙醇至體系中的乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%,置于4 ℃靜置10 h。離心得到沉淀用無水乙醇洗滌兩次,再次離心收集沉淀,加水復(fù)溶后,透析三天。透析液經(jīng)濃縮、醇沉、離心、無水乙醇洗滌、真空干燥得到40%乙醇沉淀組分,記為A1。同樣的繼續(xù)加入乙醇溶液得到體系乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,80%的多糖組分,分別記為A2和A3。

實施例2。

稱取100 g竹蓀子實體粉末,90 ℃熱水浴條件下,1:20料液比(g/mL)提取2 h,提取3次后合并提取液,然后將提取液濃縮至400 mL左右,采用冷凍干燥獲得竹蓀提取物。稱取50 g竹蓀提取物,按質(zhì)量體積比(g/mL)1: 10的比例加500 mL水溶解后,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇沉淀多糖,體系中的乙醇體積分?jǐn)?shù)控制在20%,置于10 ℃靜置10 h,離心(3000 r/min,20 min),棄去沉淀。向上清液中繼續(xù)加入乙醇至體系中的乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%,置于10 ℃靜置12 h。離心得到沉淀用無水乙醇洗滌兩次,再次離心收集沉淀,加水復(fù)溶后,透析三天。透析液經(jīng)濃縮、醇沉、離心、無水乙醇洗滌、真空干燥得到40%乙醇沉淀組分,記為B1(糖含量:97.3%)。同樣的繼續(xù)加入乙醇溶液得到體系乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,80%的多糖組分,分別記為B2(糖含量:95.0%)和B3(糖含量:89.2%)。

實施例3。

稱取100 g竹蓀子實體粉末,95 ℃熱水浴條件下,1:30料液比(g/mL)提取2 h,提取2次后合并提取液,然后將提取液濃縮至600 mL左右,噴霧干燥獲得竹蓀提取物。稱取25 g竹蓀提取物,按質(zhì)量體積比(g/mL)1: 20的比例加500 mL水溶解后,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇沉淀多糖,體系中的乙醇體積分?jǐn)?shù)控制在20%,置于4 ℃靜置10 h,離心(4800 r/min,15 min),棄去沉淀。向上清液中繼續(xù)加入乙醇至體系中的乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%,置于4 ℃靜置12 h。離心得到沉淀用無水乙醇洗滌兩次,再次離心收集沉淀,加水復(fù)溶后,透析兩天。透析液經(jīng)濃縮、醇沉、離心、無水乙醇洗滌、真空干燥得到40%乙醇沉淀組分,記為C1(糖含量:93.7%)。同樣的繼續(xù)加入乙醇溶液得到體系乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%,80%的多糖組分,分別記為C2(糖含量:92.7%)和C3(糖含量:94.9%)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例,對于本發(fā)明而言僅僅是說明性的,而非限制性的。本專業(yè)人員理解,在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神的范圍內(nèi)可對其進行許多改變、修改,甚至等效,但都將落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

下面結(jié)合上述具體實施例1中所得樣品對本發(fā)明所述的高純度竹蓀多糖的純度做進一步說明。

1、材料與方法。

葡萄糖(Glc)標(biāo)準(zhǔn)品,美國Sigma公司;不同分子量的葡聚糖系列標(biāo)準(zhǔn)品(Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-50、Dextran T-70、Dextran T-500、藍(lán)色葡聚糖)美國Pharmacia公司;8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品(巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖)和2種糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品(半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)美國Sigma公司;苯酚、硫酸等均為國產(chǎn)分析純。

2、主要儀器與設(shè)備。

TU-1900紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、Aligent 1260 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)、Dionex ICS-5000 DC(離子交換色譜儀美國戴安公司)。

3、實驗方法。

3.1竹蓀多糖純度表征。

用流動相配制1.0 mg/mL竹蓀提取物及竹蓀多糖溶液,采用高效凝膠滲透色譜對其純度進行鑒定。

色譜條件:保護柱:Ultrahydrogel TM Guard Column(6 ×40 mm),分析柱Ultrahydrogel TM500 Column (7.8 ×300 mm,10 μm);柱溫:35 ℃;流動相為水溶液(添加0.02 % NaN3);流速0.6 mL/min;進樣量:20 μL。采用G1362A示差檢測器進行檢測,示差檢測器溫度:35 ℃;ChemStation色譜工作站采集分析數(shù)據(jù)。

3.2 總糖含量測定。

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品,采用苯酚-硫酸法測定竹蓀多糖的總糖含量。樣品平行測定三次,取平均值。

3.3 單糖組成測定。

稱取5 mg樣品,用3 mL 2 M H2SO4于100 ℃水解2 h,用蒸餾水稀釋至50 mL定容,得到多糖水解母液。樣品稀釋10倍,過0.22 μm濾膜進樣。

精確稱取巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸共10種標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg 溶于50 mL容量瓶中,作為混合標(biāo)準(zhǔn)品母液。將單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品母液稀釋成不同濃度梯度進樣,得到不同單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線,進行定量測定。

離子色譜工作條件:Dionex ICS-5000離子交換色譜系統(tǒng),脈沖安培檢測器,色譜柱為CarboPacTM PA20(50 mm× 4 mm)保護柱和CarboPacTMPA20分析柱(250 mm× 4 mm);流動相為A 液(250 mmol/L NaOH溶液)、B 液(H2O)和C 液(1 mol/L醋酸鈉);柱溫:30 ℃;流速:0.5 mL/min ;進樣量:10 μL;用Chromeleon色譜工作站采集和處理數(shù)據(jù);

4、實驗結(jié)果。

4.1 竹蓀多糖糖含量及單糖組成。

表1實施例1中高純度竹蓀多糖糖含量及單糖組成測定結(jié)果

(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,n=3)

4.2 竹蓀多糖凝膠色譜行為表征。

圖1為實施例1中高純度竹蓀多糖凝膠色譜示差信號圖。由圖1可以看出,竹蓀粗提物經(jīng)液相洗脫之后,呈現(xiàn)三個明顯的峰(黑色線),經(jīng)乙醇分級方法制備的竹蓀多糖組分A1、A2、A3的凝膠色譜峰則為單一對稱的峰,再結(jié)合糖含量(均為90%左右),因此可以判定A1、A2、A3是高純度的竹蓀多糖。

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