本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵
技術領域：
，具體涉及一種高純度液體劑型葡萄糖異構酶的生產(chǎn)方法。
背景技術：
：傳統(tǒng)葡萄糖異構酶生產(chǎn)考慮到發(fā)酵酶活力偏低，葡萄糖異構酶在液體劑型時穩(wěn)定性差等因素，通常把發(fā)酵結束時的發(fā)酵液通過化工產(chǎn)品進行交聯(lián)固定酶活，烘干后得到固定化葡萄糖異構酶，其劑型為固體，目前僅有國外丹麥諾維信、美國杜邦公司供應。固定化葡萄糖異構酶使用時，必須花費幾十萬上百萬一次購買大量裝柱后方可使用，且使用要求葡萄糖液必須精制達標方可生產(chǎn)果葡糖漿，且生產(chǎn)也要求連續(xù)，葡萄糖液質量不達標、間歇生產(chǎn)或使用維護不當，均會導致失效甚至報廢，造成生產(chǎn)巨大損失。技術實現(xiàn)要素：為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種高純度液體劑型葡萄糖異構酶的生產(chǎn)方法，使用所述生產(chǎn)方法生產(chǎn)得到的葡萄糖異構酶，具有活力高、耐溫、酶活穩(wěn)定性好的優(yōu)點，應用于果葡糖漿行業(yè)，適合間歇生產(chǎn)F42型果葡糖漿，同時也可使用該葡萄糖異構酶一步法生產(chǎn)F55型果葡糖漿。生產(chǎn)F42型果葡糖漿時該產(chǎn)品對葡萄糖漿質量標準要求較低；一次購酶花費少；操作簡單，隨加隨生產(chǎn)，不需維護和考慮酶活，完全實現(xiàn)該酶國產(chǎn)且生產(chǎn)靈活性高。本發(fā)明采用的技術方案是：高純度液體劑型葡萄糖異構酶的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：A、活化接種：將鏈霉菌活化后，接入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，得到種母液；B、連續(xù)培養(yǎng)：將種母液依次在180-220轉/分，30-35℃下培養(yǎng)24-28小時，在180-220轉/分，30-35℃下培養(yǎng)18-36小時，在150-180轉/分，30-35℃下培養(yǎng)18-36小時，得到培養(yǎng)液；C、發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)液在110-150轉/分，30-35℃下培養(yǎng)40-55小時，得到發(fā)酵液；D、處理發(fā)酵液：將發(fā)酵液經(jīng)過過濾處理后取濾液，得到含有葡萄糖異構酶的液體制劑。使用所述生產(chǎn)方法生產(chǎn)得到的葡萄糖異構酶，具有活力高、耐溫、酶活穩(wěn)定性好的優(yōu)點。本發(fā)明使用的培養(yǎng)基為：蔗糖7％、蛋白胨3％、牛肉粉1.5％、麩皮1％、玉米漿0.5％、硫酸銨0.5％、硫酸鎂0.05％、氯化鈷0.05％、磷酸氫二鉀0.02％、磷酸二氫鉀0.01％，余量為純凈水。優(yōu)選的，培養(yǎng)基為蔗糖10％、蛋白胨1.5％、牛肉粉2.0％、麩皮0.8％、玉米漿1.0％、硫酸銨0.35％、硫酸鎂0.08％、氯化鈷0.05％、磷酸氫二鉀0.02％、磷酸二氫鉀0.01％，余量為純凈水。為了進一步提高得到的液體制劑中的葡萄糖異構酶的含量及酶活，優(yōu)選的技術方案是，所述鏈霉菌為M1033鏈霉菌。所述M1033鏈霉菌是本申請的發(fā)明人經(jīng)過反復試驗確定的，相較普通的鏈霉菌，在發(fā)酵后得到的液體制劑中的葡萄糖異構酶的含量及酶活耐溫性都較高。為了進一步提高鏈霉菌活化效率，優(yōu)選的技術方案是，步驟A中，從零下80-零下85℃的凍干管中取出鏈霉菌，在30-35℃下查氏斜面活化48-72小時后，接入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。為方便對所述鏈霉菌進行多級培養(yǎng)，優(yōu)選的技術方案是，步驟A中，所述培養(yǎng)瓶為搖瓶，以方便在搖床上進行培養(yǎng)；步驟B中，將種母液依次在180-220轉/分，30-35℃下在搖瓶中培養(yǎng)24-28小時，然后在180-220轉/分，30-35℃下在一級種子罐中培養(yǎng)18-36小時，在150-180轉/分，30-35℃下在二級種子罐中培養(yǎng)18-36小時，得到培養(yǎng)液，在連續(xù)培養(yǎng)過程中，依次從搖瓶到一級種子罐再到二級種子罐，根據(jù)不同培養(yǎng)時期選擇不同的培養(yǎng)容器以便于整個培養(yǎng)流程的順利進行；步驟C中，在發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)，便于提供穩(wěn)定的發(fā)酵環(huán)境。為避免雜菌污染，以保證整個生產(chǎn)工藝的順利進行，優(yōu)選的技術方案是，連續(xù)培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)均在無菌環(huán)境中進行。為保證過濾的效果，優(yōu)選的技術方案是，步驟D中的過濾處理為：向發(fā)酵液中添加防腐劑、硅藻土、膨潤土和純凈水，在15-30℃下攪拌15-30分鐘后，靜置1-3小時，再依次進行過濾除渣、微濾除菌和超濾濃縮。防腐劑為苯甲酸鈉、山梨酸鉀、尼泊金甲酯或尼泊金乙酯。根據(jù)防腐劑的不同，相對于發(fā)酵液的加入的量也不同，如苯甲酸鈉的添加量為2-3g/L，山梨酸鉀的加入量為1-2g/L，尼泊金甲酯或尼泊金乙酯的加入量均為200-500ppm。在過濾之前加入硅藻土、膨潤土和純凈水，主要是起到絮凝的作用，以方便將后續(xù)過濾操作，并且，本發(fā)明中采用板框過濾、微濾和卷式膜超濾的組合過濾方式，除渣、除菌更充分，從而提高了最終產(chǎn)品的純度。進一步的，所述硅藻土、膨潤土和純凈水相對發(fā)酵液的重量百分比分別為1-3％、1-5％和50-150％。根據(jù)本申請的發(fā)明人實驗發(fā)現(xiàn)，在上述配比下，既能夠保證良好的絮凝效果，又能節(jié)省試劑，從而降低了生產(chǎn)工藝的成本。根據(jù)不同過濾手段的工況和目的，本申請的發(fā)明人進一步研究得到：所述板框過濾、微濾和卷式膜超濾的過濾壓力分別為0.05-0.25MPa，0.15-0.35MPa和0.30-0.50MPa，在上述壓差參數(shù)下，能夠保證較好的過濾效果和過濾速率。為保證最終產(chǎn)品能夠長期穩(wěn)定保存，優(yōu)選的技術方案是，步驟D中，超濾濃縮處理后，還有防腐穩(wěn)定處理：向濃縮液中加入食鹽、醋酸鈉、甘油、硫酸鎂和氯化鈷，食鹽、醋酸鈉、甘油、硫酸鎂和氯化鈷相對最終液體制劑的體積百分比分別為15-20％，5-10％，2-5％，0.1-0.2％和0.05-0.1％。本申請的發(fā)明人經(jīng)過正交反復試驗，得到了上述防腐組合物的成分和配比，能夠使上述含有葡萄糖異構酶的液體制劑穩(wěn)定保存較長的時間，便于后續(xù)生產(chǎn)使用。為保證產(chǎn)品質量，步驟D中，經(jīng)過防腐穩(wěn)定處理后，還需經(jīng)過檢驗步驟，檢驗合格后，灌裝入庫；檢驗的標準為：含有葡萄糖異構酶的液體制劑的酶活大于等于5000u/ml。需要說明的是，酶活的數(shù)值主要是濃縮比決定的，也就是說，在發(fā)酵完成之后，提取精制時，超濾濃縮比越大，得到的液體產(chǎn)品酶活越高。除了酶活之外，還有以下檢測指標：通過以上檢驗標準檢驗之后，即可保證最終成品具有較好的穩(wěn)定性，能夠長期保存。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了高純度液體劑型葡萄糖異構酶的生產(chǎn)方法，使用所述液體劑型葡萄糖異構酶生產(chǎn)工藝生產(chǎn)得到的葡萄糖異構酶，具有活力高、耐溫、酶活穩(wěn)定性好的優(yōu)點，應用于果葡糖漿行業(yè)，適合間歇生產(chǎn)F42型果葡糖漿，同時也可使用該葡萄糖異構酶一步法生產(chǎn)F55型果葡糖漿。生產(chǎn)F42型果葡糖漿時該產(chǎn)品對葡萄糖漿質量標準要求較低；一次購酶花費少；操作簡單，隨加隨生產(chǎn)，不需維護和考慮酶活，完全實現(xiàn)該酶國產(chǎn)且生產(chǎn)靈活性高。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1是利用粗制糖液生產(chǎn)制備F42型果葡糖漿時不同的液體制劑添加量的果糖含量隨時間變化示意圖；圖2是利用粗制糖液生產(chǎn)制備F42型果葡糖漿時不同的溫度下的果糖含量隨時間變化示意圖；圖3是利用粗制糖液生產(chǎn)制備F42型果葡糖漿時不同的pH下的果糖含量隨時間變化示意圖圖4是利用精制糖液生產(chǎn)制備F55型果葡糖漿時不同的液體制劑添加量的果糖含量隨時間變化示意圖；圖5是利用精制糖液生產(chǎn)制備F55型果葡糖漿時不同的溫度下的果糖含量隨時間變化示意圖；圖6是利用精制糖液生產(chǎn)制備F55型果葡糖漿時不同的pH下的果糖含量隨時間變化示意圖。具體實施方式為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明的技術方案進行詳細的描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所得到的所有其它實施方式，都屬于本發(fā)明所保護的范圍。實施例1高純度液體劑型葡萄糖異構酶的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：A、活化接種：從零下80℃的凍干管中取出M1033鏈霉菌，在35℃下斜面活化48小時后，接入搖瓶中培養(yǎng)，得到種母液；B、連續(xù)培養(yǎng)：將種母液依次在220轉/分，30℃下在搖瓶中培養(yǎng)28小時，然后在180轉/分，35℃下在一級種子罐中培養(yǎng)18小時，在180轉/分，30℃下在二級種子罐中培養(yǎng)36小時，得到培養(yǎng)液；C、發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)液在110轉/分，35℃下在發(fā)酵罐中培養(yǎng)40小時，得到發(fā)酵液；連續(xù)培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)均在無菌環(huán)境中進行；D、處理發(fā)酵液：向發(fā)酵液中添加苯甲酸鈉、硅藻土、膨潤土和純凈水，防腐劑的添加量為2g/L，硅藻土、膨潤土和純凈水相對發(fā)酵液的重量百分比分別為3％、1％和150％；在15℃下攪拌30分鐘后，靜置1小時，再依次進行板框過濾、微濾和卷式膜超濾，所述板框過濾、微濾和卷式膜超濾的過濾壓力分別為0.25MPa，0.15MPa和0.50MPa；過濾處理后，還有防腐穩(wěn)定處理：向發(fā)酵液中加入食鹽、醋酸鈉、甘油、硫酸鎂和氯化鈷，食鹽、醋酸鈉、甘油、硫酸鎂和氯化鈷相對最終液體制劑的體積百分比分別為15％，10％，2％，0.2％和0.05％；經(jīng)過防腐穩(wěn)定處理后，得到含有葡萄糖異構酶的液體制劑，實施液體制劑經(jīng)過檢驗步驟，檢驗合格后，灌裝入庫。實施例2高純度液體劑型葡萄糖異構酶的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：A、活化接種：從零下85℃的凍干管中取出M1033鏈霉菌，在30℃下斜面活化72小時后，接入搖瓶中培養(yǎng)，得到種母液；B、連續(xù)培養(yǎng)：將種母液依次在180轉/分，35℃下在搖瓶中培養(yǎng)24小時，然后在220轉/分，30℃下在一級種子罐中培養(yǎng)36小時，在150轉/分，35℃下在二級種子罐中培養(yǎng)18小時，得到培養(yǎng)液；C、發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)液在150轉/分，30℃下在發(fā)酵罐中培養(yǎng)55小時，得到發(fā)酵液；連續(xù)培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)均在無菌環(huán)境中進行；D、處理發(fā)酵液：向發(fā)酵液中添加山梨酸鉀、硅藻土、膨潤土和純凈水，山梨酸鉀的添加量為2g/L，所述硅藻土、膨潤土和純凈水相對發(fā)酵液的重量百分比分別為1％、5％和50％；在30℃下攪拌15分鐘后，靜置2小時，再依次進行板框過濾、微濾和卷式膜超濾，所述板框過濾、微濾和卷式膜超濾的過濾壓力分別為0.05MPa，0.35MPa和0.30MPa；過濾處理后，還有防腐穩(wěn)定處理：向發(fā)酵液中加入食鹽、醋酸鈉、甘油、硫酸鎂和氯化鈷，食鹽、醋酸鈉、甘油、硫酸鎂和氯化鈷相對最終液體制劑的體積百分比分別為20％，5％，5％，0.1％和0.1％；經(jīng)過防腐穩(wěn)定處理后，得到含有葡萄糖異構酶的液體制劑，實施液體制劑經(jīng)過檢驗步驟，檢驗合格后，灌裝入庫。實施例3高純度液體劑型葡萄糖異構酶的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：A、活化接種：從零下82℃的凍干管中取出M1033鏈霉菌，在32℃下斜面活化60小時后，接入搖瓶中培養(yǎng)，得到種母液；B、連續(xù)培養(yǎng)：將種母液依次在200轉/分，32℃下在搖瓶中培養(yǎng)26小時，然后在200轉/分，32℃下在一級種子罐中培養(yǎng)27小時，在165轉/分，32℃下在二級種子罐中培養(yǎng)27小時，得到培養(yǎng)液；C、發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)液在130轉/分，32℃下在發(fā)酵罐中培養(yǎng)47小時，得到發(fā)酵液；連續(xù)培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)均在無菌環(huán)境中進行；D、處理發(fā)酵液：向發(fā)酵液中添加尼泊金甲酯、硅藻土、膨潤土和純凈水，尼泊金甲酯的添加量為500ppm，所述硅藻土、膨潤土和純凈水相對發(fā)酵液的重量百分比分別為2％、3％和100％；在22℃下攪拌22分鐘后，靜置2小時，再依次進行板框過濾、微濾和卷式膜超濾，所述板框過濾、微濾和卷式膜超濾的過濾壓力分別為0.15MPa，0.25MPa和0.4MPa；過濾處理后，還有防腐穩(wěn)定處理：向發(fā)酵液中加入食鹽、醋酸鈉、甘油、硫酸鎂和氯化鈷，食鹽、醋酸鈉、甘油、硫酸鎂和氯化鈷相對最終液體制劑的體積百分比分別為17％，7％，3.5％，0.15％和0.07％；經(jīng)過防腐穩(wěn)定處理后，得到含有葡萄糖異構酶的液體制劑，實施液體制劑經(jīng)過檢驗步驟，檢驗合格后，灌裝入庫。實驗例1本實驗例是對實施例1-3得到的含有葡萄糖異構酶的液體制劑的檢驗，檢驗結果如表1所示：本實驗例的檢測值，均為使用國標GB/T23533--2009測定方法或行業(yè)通用測量方法得到的，其中，酶活力保存率為室溫20-25℃保存三個月后的酶活力保存率。表1：檢測結果表檢測項目標準實施例1值實施例2值實施例3值結論酶活力≥5000u/ml5445555710600均合格酶活力保存率≥85％90.1％92％91.5％均合格pH值5.0-7.57.117.056.95均合格容重1.10-1.25g/ml1.181.201.22均合格重金屬(以Pb計)≤0.0040.0030.0030.003均合格鉛(以Pb計)≤0.0010.000720.000720.0002均合格砷(以As計)≤0.00030.000130.000130.00007均合格菌落總數(shù)≤50000個/ml300300500均合格大腸菌群≤30個/ml230均合格大腸桿菌不得檢出未檢出未檢出未檢出均合格霉菌≤100個/ml000均合格酵母≤100個/ml000均合格黃曲霉毒素B1≤0.0000005％000均合格從表1能夠看出，實施例1-3得到的含有葡萄糖異構酶的液體制劑均具有酶活高，穩(wěn)定性好的優(yōu)點，說明本發(fā)明提供的生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性好，成品質量佳。實驗例2本實驗例，為實施例1和2得到的含有葡萄糖異構酶的液體制劑生產(chǎn)果葡糖漿的使用報告：使用報告11、實驗條件取葡萄糖含量大于92％的糖液170kg，固形物含量34.8％，DE＝98.1；將pH值調至8.1左右，加入140g七水合硫酸鎂和32g焦亞硫酸鈉，攪拌均勻，加入實施例1得到的含有葡萄糖異構酶的液體制劑550ml，升溫至65-68℃，作用16小時后，用高效液相色譜檢測，糖液中果糖含量達到43.19％，葡萄糖+果糖含量＝94.87％，最后將糖水pH值調至4.2滅酶。2、實驗評價使用實施例3得到的含有葡萄糖異構酶的液體制劑生產(chǎn)F42果葡糖漿，能使糖液中果糖含量達到43.19％，葡萄糖+果糖含量＝94.87％，滿足GB/T20882-2007《果葡糖漿》中果糖含量42-44％，葡萄糖+果糖含量≥92％的要求。所述液體制劑使用方便，經(jīng)過適當?shù)墓に嚳刂?，能直接把葡萄糖液轉化為F42果葡糖漿，滿足生產(chǎn)的需求。使用報告21、實驗條件取葡萄糖含量大于93％的糖液28立方，固形物含量30％，DE＝101；將pH值調至8.1左右，加入25kg七水合硫酸鎂和6.1kg焦亞硫酸鈉，攪拌均勻，加入實施例2得到的含有葡萄糖異構酶的液體制劑8.5L，升溫至65-68℃，作用21小時后，用高效液相色譜檢測，糖液中果糖含量達到45.02％，葡萄糖+果糖含量＝92.72％，最后將糖水pH值調至4.1滅酶。2、實驗評價使用實施例3得到的含有葡萄糖異構酶的液體制劑生產(chǎn)F42果葡糖漿，能使糖液中果糖含量達到45.02％，葡萄糖+果糖含量＝92.72％。所述液體制劑使用方便，經(jīng)過適當?shù)墓に嚳刂?，能直接把葡萄糖液轉化為F42果葡糖漿，滿足生產(chǎn)的需求。實驗例3本實驗例，是對實施例3得到的含有葡萄糖異構酶的液體制劑生產(chǎn)果葡糖漿的能力研究。一、利用粗制糖液生產(chǎn)制備F42型果葡糖漿使用實施例3得到的含有葡萄糖異構酶的液體制劑(酶活10600u/ml)，底物為粗葡萄糖液，固形物含量為35.0％，MgSO4·7H2O：550-850g/M3(糖液)，Na2S2O5：200-300g/M3(糖液)。1、不同的液體制劑添加量，果糖含量隨時間變化結果如圖1所示，從圖1可以看出，隨著液體制劑添加量的增大，果糖含量達到F42型所需時間越短，液體制劑添加量2‰時，達到F42型需要30個小時，而液體制劑添加量3‰，達到F42型，只需18個小時。2、不同的溫度下，果糖含量隨時間變化結果如圖2所示，隨著溫度的提高(一定溫度)，在相同時間內，溫度越高，果糖含量越高，說明溫度的提高有利于果糖的轉化。3、不同的pH下，果糖含量隨時間變化結果如圖3所示，隨著pH值的升高(一定pH值)，相同時間內，pH值越高，果糖含量越高。二、利用精制糖液生產(chǎn)制備F55型果葡糖漿使用實施例3得到的含有葡萄糖異構酶的液體制劑(酶活10600u/ml)，底物為精制葡萄糖液，固形物含量為35.0％，水為去離子水，MgSO4·7H2O：550-850g/M3(糖液)，Na2S2O5：200-300g/M3(糖液)。1、不同的液體制劑添加量，果糖含量隨時間變化結果如圖4所示，從圖4可以看出，隨著液體制劑添加量的增大，果糖含量達到F55型所需時間越短，液體制劑添加量1％時，達到F55型需要10個小時，液體制劑添加量2％，達到F55型，只需5個小時。2、不同的溫度下，果糖含量隨時間變化結果如圖5所示，從圖5可以看出，隨著溫度的提高，在一定時間內(≤18h)，相同時間時，溫度越高，果糖含量越高，當溫度達到68℃以上，時間18小時，果糖含量相差不大。說明在一定時間內，溫度的提高有利于果糖的轉化。3、不同的pH下，果糖含量隨時間變化結果如圖6所示，從圖6可以看出，在生產(chǎn)F55型果葡糖漿時，在pH值8.0與pH值8.2時，兩者果糖含量相差不大。在pH值8.0與pH值7.8相比較，相同時間內，pH值8.0的果糖含量比pH值7.8的要高。pH值7.5時，在20小時內，果糖含量達不到F55型。結果分析1、在用高純度液體葡萄糖異構酶生產(chǎn)果葡糖漿時，酶加量、溫度、pH值越高，越有利于果糖的轉化。2、隨著時間的延長，果糖含量增長較快，呈明顯的上升趨勢，在20小時以后，果糖含量增長快慢，逐漸趨于平緩。使用液體制劑的優(yōu)點1、設備簡單，投資小，不需購進昂貴的設備，如色譜分離柱，普通制糖設備就可以生產(chǎn)F55果葡糖漿。2、操作簡單，直接添加，一步制得型果葡糖漿，減去了生產(chǎn)工序，生產(chǎn)更易操作。3、生產(chǎn)更易調度?？筛鶕?jù)市場情況，靈活安排生產(chǎn)，不存在固定化異構酶不生產(chǎn)易失活、難保護和昂貴設備閑置的情況。4、簡化了生產(chǎn)工序，節(jié)約了人力、水電費用和生產(chǎn)成本，增強了企業(yè)競爭力。5、有利于果葡糖漿的存儲、運輸，減少了因結晶企業(yè)不必要的損失。以上所述，僅為本發(fā)明的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術領域：
的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。因此，本發(fā)明的保護范圍應以所述權利要求的保護范圍為準。當前第1頁1 2 3