本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種尿激酶原純化及去除病毒方法。

背景技術(shù)：

尿激酶原(Prourokinase,簡(jiǎn)稱pro-UK)是一類絲氨酸蛋白酶,可以激活體內(nèi)的纖溶酶原轉(zhuǎn)變成有活性的纖溶酶,從而溶解血栓中的纖維蛋白,因此在溶血栓的治療方面有著廣泛的應(yīng)用。pro-UK中Lys158-Ile159間肽鍵容易被纖溶酶及其他一些酶類水解,生成尿激酶(urokinase,簡(jiǎn)稱UK)。UK由A鏈和B鏈兩條肽鏈組成,靠鏈間二硫鍵連接。和UK相比,pro-UK和纖維蛋白的親和力較高,激活纖溶系統(tǒng)的部位常在血栓形成的部位,因而引起全身出血傾向的副作用要比尿激酶小,是一種更優(yōu)越的纖溶酶原激活劑。Pro-UK和UK之間往往只有一個(gè)多肽鍵的差異,兩者在分子表面特性、抗原性以及分子量方面非常相似,pro-UK也極易轉(zhuǎn)化為UK，常規(guī)層析方法難以將其分離，所以細(xì)胞表達(dá)的發(fā)酵液純化一方面要除去培養(yǎng)基和細(xì)胞正常代謝產(chǎn)物，另一方面要去除UK，因此pro-UK下游純化非常困難。

中國(guó)專利CN1680550A公開(kāi)了一種重組人尿激酶原的純化方法，包括如下4步：A、用陽(yáng)離子交換Streamline-SP擴(kuò)張床色譜從工程細(xì)胞培養(yǎng)上清中回收重組人尿激酶原；B、用Sephacryl S-200凝膠色譜進(jìn)一步純化上述A收集的尿激酶原粗品；C、用對(duì)氨基苯甲脒-Sepharose Fast Flow親和色譜法除去粗產(chǎn)品中的尿激酶；D、用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜除去重組人尿激酶原中殘留細(xì)胞的DNA。其中，為了達(dá)到更好地實(shí)驗(yàn)效果，在步驟C和D之間還可包括步驟E：用陽(yáng)離子交換Streamline-SP固定床色譜濃縮尿激酶原，濃縮可達(dá)10～15倍左右，以方便后續(xù)操作。

然而，該方法仍然存在蛋白純度不高、會(huì)存在宿主細(xì)胞DNA、宿主細(xì)胞殘留蛋白及病毒等外源性污染的問(wèn)題。CN1680550A的方法安全性不高，主要原因是完成D步驟后是產(chǎn)品原液，原液將作為注射用重組人尿激酶原的原料進(jìn)行制劑，但D步驟中所采用的Tris-HCl緩沖液將會(huì)進(jìn)入到成品，直接通過(guò)靜脈注射進(jìn)入人體。 Tris-HCl緩沖液對(duì)人體具有一定的刺激性，一般只用于研究而不能用于人體，Tris-HCl緩沖液直接進(jìn)入人體會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生一定的危害，因此不適宜作為原液的緩沖體系。

上海天士力生產(chǎn)的重組人尿激酶原為通過(guò)基因工程方法構(gòu)建的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)表達(dá)獲得的，主要用于急性ST段抬高性心肌梗死的溶栓治療，已于2011年作為國(guó)家一類新藥成功上市。

國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心制定的《生物組織提取制品和真核細(xì)胞表達(dá)制品的病毒安全性評(píng)價(jià)技術(shù)審評(píng)一般原則》(簡(jiǎn)稱原則)規(guī)定，凡是用細(xì)胞表達(dá)的人用生物制品均要求對(duì)生產(chǎn)用細(xì)胞株、細(xì)胞培養(yǎng)液、產(chǎn)品原液和產(chǎn)品進(jìn)行病毒檢測(cè)，并要求純化工藝中有滅活或除去病毒的步驟，以確保產(chǎn)品不被病毒污染及用藥安全。

為了適應(yīng)臨床研究，提供一種臨床安全有效，副作用小、高純度的重組人尿激酶原純化及去除方法是急需解決的事情。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新的CHO細(xì)胞表達(dá)的重組人尿激酶原的蛋白純化及去除病毒方法，該方法得到蛋白純度不低于98％，且清除了Tris-HCl緩沖液的殘留和病毒，有效降低了臨床使用風(fēng)險(xiǎn)。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明以CHO細(xì)胞表達(dá)的重組人尿激酶原的發(fā)酵液為起始原料，進(jìn)行以下本發(fā)明的純化步驟。

本發(fā)明提供了一種重組人尿激酶原的純化及去除病毒方法，將尿激酶原發(fā)酵液通過(guò)層析后獲得的初步純化液加入低pH孵育和納米過(guò)濾的步驟去除病毒而尿激酶原直接被洗脫下來(lái)，從而達(dá)到去除病毒的目的。

所述病毒包括但不限于如細(xì)小病毒、白血病病毒和狂犬病毒等。

本發(fā)明所述的尿激酶原發(fā)酵液通過(guò)CN 1062016、CN1178244(說(shuō)明書(shū)第5頁(yè)7-9的方法)、公開(kāi)的方法制備得到。

本發(fā)明所述的低pH孵育步驟是指控制初步純化液孵育溫度，用酸調(diào)節(jié)pH值3.0-4.0后開(kāi)始低pH孵育，再用堿調(diào)節(jié)溶液pH值7.0±0.5；即得孵育后的 初步純化液(簡(jiǎn)稱孵育后中間體3)。

所述的酸包括但不限于鹽酸。

所述的堿包括但不限于氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水、碳酸氫鈉等，優(yōu)選氫氧化鈉。

進(jìn)一步地，低pH孵育步驟是指初步純化液置溫度穩(wěn)定的恒溫水浴鍋內(nèi)，控制初步純化液孵育溫度22-28℃，(優(yōu)選23-25℃)攪拌，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值3.0-4.0后開(kāi)始低pH孵育，孵育30-90min，再用1-4M(優(yōu)選3-4M)的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值7.0±0.5；即得孵育后的初步純化液(簡(jiǎn)稱孵育后中間體3)。

本發(fā)明之所以選擇孵育時(shí)間30-90min(優(yōu)選30-60min)，在病毒滅活的過(guò)程中病毒可能存在逃逸現(xiàn)象，一個(gè)點(diǎn)的病毒滴度達(dá)到要求，不代表后面的點(diǎn)的病毒滴度都能達(dá)到要求，一般會(huì)再做一到兩個(gè)點(diǎn)證明我們想取的那個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度是真正的達(dá)到了滅活的要求。

本發(fā)明所述的納米濾過(guò)步驟是指：孵育后的初步純化液即孵育后中間體3經(jīng)過(guò)層析洗脫后得到的洗脫液經(jīng)過(guò)納米膜過(guò)濾，病毒富集在納米膜上，收集濾液即得本發(fā)明的尿激酶原。

所述納米膜孔徑為15-30nm，優(yōu)選孔徑20nm。

本發(fā)明優(yōu)選在納米膜過(guò)濾前進(jìn)行用微孔濾膜預(yù)過(guò)濾，所述微孔濾膜的孔徑0.1-0.45μm，優(yōu)選0.1μm。預(yù)過(guò)濾過(guò)程是為了除掉蛋白復(fù)融過(guò)程中的蛋白聚集成的顆粒，以免堵掉納米小孔濾膜。

上述濾膜的材質(zhì)為PVDF聚偏二氟乙烯膜。

具體地，優(yōu)選納米膜濾過(guò)步驟為：孵育后的初步純化液即孵育后中間體3經(jīng)過(guò)層析洗脫后得到的洗脫液經(jīng)0.1μm孔徑的PVDF預(yù)過(guò)濾器+20nm孔徑的PVDF納米過(guò)濾器，在壓力不超過(guò)5bar的條件下收集濾液，過(guò)濾完成后用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液進(jìn)行頂洗，收集濾液即可本發(fā)明的重組人尿激酶原原液。

本發(fā)明所述的初步純化液是經(jīng)過(guò)一定純化步驟，使得重組人尿激酶原蛋白純度達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn)≥95％的尿激酶原純化中間體?？赏ㄟ^(guò)現(xiàn)有技術(shù)例如，通過(guò)免疫親和層析法，或是陽(yáng)離子交換層析和免疫親和層析法等方法純化方法制備完成。為了達(dá)到更好的技術(shù)效果，優(yōu)選本發(fā)明的初步純化液是通過(guò)下述方法完成的步驟 (1)蛋白捕獲：尿激酶原發(fā)酵液選用陽(yáng)離子交換層析法得到純化中間體1；

步驟(2)凝膠層析：中間體1通過(guò)凝膠層析法獲得純化中間體2；

步驟(3)陽(yáng)離子交換層析：中間體2通過(guò)陽(yáng)離子交換層析法獲得初步純化液簡(jiǎn)稱純化中間體3；

進(jìn)一步地，步驟(1)中所述發(fā)酵液取上清液調(diào)節(jié)pH值至5.5～6.5后陽(yáng)離子交換層柱法上樣(優(yōu)選pH值至6.0)，采用0.005～0.015mol/L(優(yōu)選0.008～0.01mol/L)磷酸鹽緩沖液洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化中間體1。

所述的陽(yáng)離子交換層析柱填料包括但不限于Streamline SP、SP Sepharose F.F.，優(yōu)選Streamline SP陽(yáng)離子填料。所述的磷酸鹽緩沖液為含NaCl的磷酸鹽溶液，優(yōu)選pH6.0±0.5含0.05～0.7mol/L NaCl。

為達(dá)到更好的洗脫效果，優(yōu)選先用磷酸鹽緩沖液平衡層析柱后再上樣洗脫，所述平衡層析柱的磷酸鹽緩沖液含NaCl的濃度低于洗脫時(shí)磷酸鹽緩沖液含NaCl的濃度，也就是說(shuō)低鹽磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，再用高鹽磷酸鹽緩沖液洗脫層析柱。目的是通過(guò)緩沖液平衡使目標(biāo)蛋白帶正電荷，吸附在填料上，再通過(guò)緩沖液使目標(biāo)蛋白帶負(fù)電荷洗脫下來(lái)。緩沖液的pH值可以改變目標(biāo)蛋白的電荷性質(zhì)，鹽離子(NaCl)濃度調(diào)節(jié)電荷強(qiáng)度。平衡層析柱時(shí)的磷酸鹽緩沖液中加入低濃度的NaCl可增加目標(biāo)蛋白的電荷強(qiáng)度，從而增強(qiáng)陽(yáng)離子填料對(duì)目標(biāo)蛋白的捕獲能力。接下來(lái)通過(guò)高鹽(NaCl的濃度高于平衡時(shí)NaCl濃度)緩沖液洗脫使目標(biāo)蛋白的離子強(qiáng)度降低，降低其與目標(biāo)蛋白的結(jié)合能力。如果洗脫時(shí)的緩沖液鹽離子濃度過(guò)高(≥0.8mol/L NaCl)會(huì)將吸附在填料上的其它雜蛋白一并洗脫下來(lái)進(jìn)入純化中間體1。因此本發(fā)明的洗脫時(shí)磷酸緩沖液的濃度pH6.0±0.5含0.3-0.7mol/L NaCl。

具體為，

步驟(1)以Streamline SP陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，發(fā)酵液取上清液調(diào)節(jié)pH值至5.5～6.5后上樣，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0±0.5含0.3-0.7mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸 收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化中間體1。

本發(fā)明的步驟(2)中間體1上凝膠層析柱后，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰即為純化中間體2。

所述的凝膠層析柱的填料包括但不限于Sephacryl S-200HR、Sephadex G-50，優(yōu)選Sephacryl S-200HR凝膠分子篩。所述的磷酸鹽緩沖液為含NaCl的磷酸鹽溶液，優(yōu)選(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)。

為達(dá)到更好的洗脫效果，優(yōu)選先用磷酸鹽緩沖液層析柱后再上樣洗脫，平衡時(shí)磷酸鹽緩沖液濃度與洗脫時(shí)磷酸鹽緩沖液相同。

具體為，

以Sephacryl S-200HR凝膠分子篩填料為介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析。層析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽平衡緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化中間體1直接上樣，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽洗脫緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化中間體2。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的步驟(3)中間體2調(diào)節(jié)pH值至6.0±0.5后陽(yáng)離子交換層析柱上樣，用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為初步純化液簡(jiǎn)稱純化中間體3。

所述的陽(yáng)離子交換層析柱填料包括但不限于SP Sepharose F.F.、SP Sephadex C-50，優(yōu)選SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料。所述的磷酸鹽緩沖液為含NaCl溶液，優(yōu)選pH5.5～7.5含0.05～0.35mol/L NaCl。

為達(dá)到更好的洗脫效果，優(yōu)選先用磷酸鹽緩沖液平衡層析柱后再上樣洗脫。所述平衡層析柱的磷酸鹽緩沖液含NaCl濃度低于洗脫時(shí)磷酸鹽緩沖液含NaCl濃度，也就是說(shuō)低鹽磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，再用高鹽磷酸鹽緩沖液洗脫層析柱。優(yōu)選(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。所述的磷酸鹽緩沖液洗脫時(shí)，采用從低鹽到高鹽兩步梯度洗脫，優(yōu)選pH5.5～7.5含0.20～0.35mol/L NaCl。第一次用低鹽的緩沖液洗脫，洗脫雜質(zhì)蛋白，收集目標(biāo)蛋白，第二次用高鹽的緩沖液洗脫，既可以進(jìn)一步除去雜蛋白，同時(shí)還可以將純化中間 體3進(jìn)行濃縮后洗脫。這樣獲得的純化中間體3的雜蛋白更少，目標(biāo)蛋白量不變，但體積更小了，便于生產(chǎn)貯存。

具體為：

以SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化中間體2調(diào)節(jié)pH值至6.0±0.5后上樣，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH6.0±0.5含0.20～0.26mol/L NaCl)洗脫雜質(zhì)，0.005～0.015mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH7.0±0.5含0.28～0.35mol/L NaCl)洗脫目標(biāo)蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為初步純化液簡(jiǎn)稱純化中間體3。

該步驟(3)能夠更好的分離雜質(zhì)蛋白及目標(biāo)蛋白，濃縮得到高純度的中間體3。

純化中間體3可于-20℃以下冷凍儲(chǔ)存。待需要下一步操作時(shí)可提前取出復(fù)融混合，并進(jìn)行第(4)步低pH孵育操作，得到孵育后的純化中間體3。

本發(fā)明納米濾過(guò)步驟中所述的孵育后的初步純化液即孵育后中間體3，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)層析洗脫后得到的洗脫液，優(yōu)選通過(guò)下述方法制備：

步驟(A)親和層析：孵育后中間體3通過(guò)親和層析法獲得純化中間體4；

步驟(B)陰離子交換層析：中間體4通過(guò)陰離子交換層析法獲得純化中間體5；

步驟(C)陽(yáng)離子交換層析：中間體5通過(guò)陽(yáng)離子交換層析法獲得洗脫液簡(jiǎn)稱純化中間體6。

進(jìn)一步地，本發(fā)明步驟(A)孵育后純化中間體3pH值至7.0±0.5后親和層析柱上樣，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化中間體4。

所述的親和層析柱填料包括但不限于Benzamidine Sepharose 4FF H-sub、Arginine Sepharose 4B，優(yōu)選Benzamidine Sepharose 4FF H-sub親和填料。所述的磷酸鹽緩沖液為含NaCl溶液，優(yōu)選pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl。

優(yōu)選先用磷酸鹽緩沖液層析柱后再上樣洗脫，平衡時(shí)磷酸鹽緩沖液濃度與洗 脫時(shí)磷酸鹽緩沖液相同。

步驟(A)主要目的是除出去UK，具體為，

以Benzamidine Sepharose 4FF H-sub親和填料為介質(zhì)進(jìn)行親和層析。層析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。多批純化中間體3的冷凍蛋白溶液復(fù)融及混合，混合溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.5后上樣。采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化中間體4。

本發(fā)明步驟(B)純化中間體4與0.02～0.035mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0±0.5)按1：2體積比混合，調(diào)節(jié)pH值至8.0±0.5后陰離子交換柱上樣，用0.015～0.025mol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化中間體5。

所述的陰離子交換柱填料包括但不限于Streamline DEAE、DEAE Sephacel DE-52，優(yōu)選Streamline DEAE陰離子填料。所述的Tris-HCl緩沖液為含鹽或不含鹽的Tris-HCl緩沖液，優(yōu)選pH8.0±0.5含0～0.20mol/L NaCl，進(jìn)一步優(yōu)選中間體4與不含鹽Tris-HCl緩沖液混合。優(yōu)選先用Tris-HCl含鹽緩沖液平衡層析柱后再上樣洗脫，平衡時(shí)Tris-HCl緩沖液含鹽濃度高于洗脫時(shí)Tris-HCl緩沖液含鹽濃度。優(yōu)選平衡時(shí)Tris-HCl緩沖液液pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/L NaCl，洗脫時(shí)Tris-HCl洗脫緩沖液(pH8.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)。

具體，本發(fā)明第B步陰離子層析的原理是，通過(guò)陰離子填料吸附帶負(fù)電荷的DNA、宿主細(xì)胞殘留蛋白及病毒等。在Tris-HCl緩沖液基礎(chǔ)上增加NaCl，增強(qiáng)雜質(zhì)的負(fù)電荷強(qiáng)度，從而增加陰離子填料對(duì)DNA等雜質(zhì)的吸附。

以Streamline DEAE陰離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.015～0.025mol/L Tris-HCl平衡緩沖液(pH8.0±0.5含0.05～0.20mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化中間體4與0.02～0.035mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0±0.5)按1：2體積比混合，調(diào)節(jié)pH值至8.0±0.5后上樣，用0.015～0.025mol/L Tris-HCl洗脫緩沖液(pH8.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化中間體5。

本發(fā)明步驟(C)純化中間體5調(diào)節(jié)pH值至6.0±0.5后陽(yáng)離子交換層析柱上樣，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為本發(fā)明所要得到的洗脫液簡(jiǎn)稱純化中間體6。

所述的陽(yáng)離子交換層析柱填料包括但不限于SP Sepharose F.F.、SP Sephadex C-50，優(yōu)選SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料，本發(fā)明所述的磷酸鹽緩沖液為含NaCl溶液，優(yōu)選pH5.5～7.5含0.05～0.5mol/L NaCl。

為了更好的洗脫，優(yōu)選先用磷酸鹽緩沖液層析柱后再上樣洗脫，所述平衡層析柱的磷酸鹽緩沖液含NaCl濃度低于洗脫時(shí)磷酸鹽緩沖液含NaCl濃度，也就是說(shuō)低鹽磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，再用高鹽磷酸鹽緩沖液洗脫層析柱。優(yōu)選(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，用(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl)洗脫。

該步驟(C)用磷酸鹽緩沖液洗脫純化中間體5，替換了Tris-HCl緩沖液殘留，減少刺激性，提高了對(duì)人體的安全性，還除去了病毒.

具體為：

以SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.15mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化中間體5調(diào)節(jié)pH值至6.0±0.5后上樣，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0±0.5含0.3～0.5mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為洗脫液簡(jiǎn)稱純化中間體6。

用本發(fā)明的納米過(guò)濾步驟，過(guò)濾純化中間體6，即可得到本發(fā)明的純化產(chǎn)物：純的重組人尿激酶原。

進(jìn)一步優(yōu)選尿激酶原的純化及去病毒方法，

本發(fā)明的步驟(1)～(3)、低pH孵育步驟、步驟(A)～(C)、納米過(guò)濾步驟聯(lián)合使用作為尿激酶原的純化及去除病毒方法，具體為步驟(1)～(8)。見(jiàn)附圖1。

步驟(1)蛋白捕獲，得到純化中間體1；

步驟(2)凝膠層析，得到純化中間體2；

步驟(3)陽(yáng)離子交換層析，得到純化中間體3：

步驟(4)低pH孵育，得到孵育純化中間體3：

步驟(5)親和層析，得到純化中間體4；

步驟(6)陰離子交換層析，得到純化中間體5：

步驟(7)陽(yáng)離子交換層析，得到純化中間體6：

步驟(8)納米過(guò)濾，得到人重組尿激酶原原液。

本發(fā)明中所述的尿激酶原是指重組人尿激酶原。

本發(fā)明的有益效果

為了說(shuō)明本發(fā)明的有益效果，通過(guò)下述試驗(yàn)例來(lái)闡述

試驗(yàn)例一、增加低pH孵育步驟

1、增加低pH孵育步驟對(duì)純化中間體3的影響

·實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?

–考察低pH步驟對(duì)純化中間體3(實(shí)施例1步驟1-3)蛋白品質(zhì)的影響

·實(shí)驗(yàn)過(guò)程：

–將純化中間體3分別在pH3.9、3.5及3.0條件下處理90min，

–90min后調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.5

–對(duì)比處理前及處理后蛋白含量、生物學(xué)活性、比活性、電泳純度、SEC-HPLC純度及單鏈比例等指標(biāo)

·實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

–初步證明低pH步驟對(duì)純化中間體3蛋白品質(zhì)無(wú)明顯影響

2、增加低pH孵育步驟對(duì)原液影響

·實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?

–通過(guò)對(duì)低pH條件下處理后的純化中間體3，進(jìn)行純化后三步(實(shí)施例1步驟1-7)制備。對(duì)制備的原液進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估，以考察低pH孵育對(duì)原液的影響。

·實(shí)驗(yàn)流程

–分別選用低濃度蛋白及高濃度蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

–將純化中間體3復(fù)融后升溫至22-28℃

–調(diào)節(jié)pH值至3.0-4.0，22-28℃下放置90min

–調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.5

–進(jìn)行后三步純化制備原液(純化中間體6)

–樣品送檢

·實(shí)驗(yàn)結(jié)果

–純化中間體3經(jīng)過(guò)低pH處理后，蛋白濃度、蛋白活性、蛋白純度(包括SDS-PAGE、SEC-HPLC、RP-HPLC純度)、唾液酸比例均無(wú)顯著變化，單鏈比例略有下降(下降約0.4％)，但是產(chǎn)生多余的UK仍然可以通過(guò)后三步純化去除。

–經(jīng)過(guò)低pH處理后的純化中間體3，通過(guò)Scale-Down模式進(jìn)行后三步得到的原液，檢測(cè)項(xiàng)目均符合原液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

–本次試驗(yàn)輸出的低pH處理工藝過(guò)程為：

·選取純化中間體3置于2-12℃環(huán)境下復(fù)融

·將復(fù)融后純化中間體3置于22-28℃生化培養(yǎng)箱/水浴鍋中升溫，升溫后純化中間體3升溫至22-28℃，并將其取出

·將取出的純化中間體3用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.0-4.0之間

·調(diào)節(jié)后重新置于22-28℃生化培養(yǎng)箱/水浴鍋中，放置90min取出

·取出后重新調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.5，進(jìn)行后三步純化

3、增加低pH孵育步驟滅活病毒效果驗(yàn)證(實(shí)施例1，步驟1-4)

·驗(yàn)證設(shè)計(jì)見(jiàn)附圖2

–pH值：選用pH3.0-4.0作為處理?xiàng)l件；

–處理時(shí)間：采用處理80min作為最差條件進(jìn)行驗(yàn)證(對(duì)于低pH孵育來(lái)說(shuō)，時(shí)間越短對(duì)病毒的滅活效果越差，所以選擇比90分鐘要小的時(shí)間，如果在80分鐘時(shí)病毒都能全部滅活，90分鐘病毒滅活就沒(méi)有問(wèn)題)；

–溫度：采用22℃孵育作為本次驗(yàn)證的最差條件進(jìn)行驗(yàn)證(同上，溫度越低對(duì)病毒滅活效果越差，所以選擇最低的22度，來(lái)保證26度的效果)；

–蛋白濃度：選用低、中、高三種濃度蛋白進(jìn)行該驗(yàn)證。

·驗(yàn)證病毒選擇

選擇小鼠白血病病毒(Mulv)及偽狂犬病毒(PRV)作為指示病毒，病毒信 息如下：表1

·驗(yàn)證結(jié)果

表2小鼠白血病病毒(Mulv)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)

表3偽狂犬病毒(PRV)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)

·如表2-3、圖3可見(jiàn)，經(jīng)低pH孵育的30min，60min，80min的LRV值均大于4，即病毒滴度下降大于4logs(99.99％)，病毒滅活在孵育30min時(shí)病毒滴度已經(jīng)降到最低水平。

試驗(yàn)例二、增加納米過(guò)濾步驟

·病毒去除過(guò)濾器選擇(實(shí)施例1步驟1-8)

–考慮蛋白回收率

–考慮與生產(chǎn)規(guī)模相適應(yīng)的膜面積

–選用20nm孔徑的PVDF過(guò)濾器作為生產(chǎn)用過(guò)濾器

·驗(yàn)證病毒選擇

除病毒過(guò)濾原理主要利用尺寸攔截原理對(duì)病毒進(jìn)行物理去除，故本次驗(yàn)證選擇豬細(xì)小病毒(PPV)和小鼠腦心肌炎病毒(EMCV)作為指示病毒，病毒信息如下：表4

·試驗(yàn)方法見(jiàn)圖4

·驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表5-6，圖5

表5豬細(xì)小病毒(PPV)滴度檢驗(yàn)數(shù)據(jù)

·表6小鼠腦心肌炎病毒(EMCV)病毒滴度檢驗(yàn)數(shù)據(jù)

·圖5中縱坐標(biāo)Lg均表示LgTCID50/0.1mL值。

·三批樣品的豬細(xì)小病毒和小鼠腦心肌炎病毒的降低量均大于4Lgs，納米過(guò)濾可以有效地去除指示病毒；三批樣品在過(guò)濾全過(guò)程的病毒過(guò)濾效果均保持穩(wěn)定。

試驗(yàn)例三、增加低pH孵育和納米過(guò)濾步驟對(duì)注射用重組人尿激酶原質(zhì)量的影響

–原液檢驗(yàn)結(jié)果

·三批納米過(guò)濾蛋白收率分別為100.2％、101.5％、98.7％

·檢驗(yàn)項(xiàng)目均符合注射用重組人尿激酶原原液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求

–成品檢驗(yàn)結(jié)果

–檢驗(yàn)項(xiàng)目均符合注射用重組人尿激酶原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求

–原液可比性研究

·原液的氨基酸組成與理論組成保持一致

·原液的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量與對(duì)照品原液含量基本一致

·原液的高分辨分子質(zhì)量與對(duì)照品原液基本一致

·原液的二硫鍵對(duì)數(shù)及配對(duì)方式與理論及對(duì)照品原液一致

–結(jié)論：增加了低pH孵育及納米過(guò)濾步驟后，注射用重組人尿激酶原產(chǎn)品品質(zhì)進(jìn)行全面質(zhì)量對(duì)比，確認(rèn)增加的步驟對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)無(wú)影響。

試驗(yàn)例四、本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)的比較

現(xiàn)有技術(shù)：CN1680550A

本發(fā)明方法：實(shí)施例1的方法

(一)、增加純化第3步陽(yáng)離子交換層析

試驗(yàn)方法：細(xì)胞發(fā)酵液分別按照CN1680550A中的方法和本發(fā)明方法進(jìn)行純化前2步和前3步的操作。按照CN1680550A中的方法經(jīng)過(guò)純化第1步和第2步后，收集純化中間體2，本發(fā)明方法收集純化中間體3，分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

試驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)過(guò)圖6比較，按照CN1680550A中的方法，在進(jìn)行第二步凝膠層析后直接將重組人尿激酶原純化2中間體進(jìn)行上樣，可見(jiàn)含有一條20KD左右的雜質(zhì)蛋白條帶；而在本發(fā)明的方法中，加入SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子交換層析的步驟，并分別采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽高鹽洗脫緩沖液(pH7.0±0.5含0.28～0.35mol/L NaCl)和0.005～0.015mol/L磷酸鹽低鹽洗脫緩沖液(pH6.0±0.5含0.20～0.26mol/L NaCl)的洗脫液進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)均可將20KD左右的雜質(zhì)蛋白除去。

由于用0.005～0.015mol/L磷酸鹽低鹽洗脫緩沖液(pH6.0±0.5含0.20～0.26mol/L NaCl)洗脫目標(biāo)蛋白時(shí)，洗脫體積較大，所以最終選擇0.005～0.015mol/L磷酸鹽低鹽洗脫緩沖液(pH6.0±0.5含0.20～0.26mol/L NaCl)與0.005～0.015mol/L磷酸鹽高鹽洗脫緩沖液(pH7.0±0.5含0.28～0.35mol/L NaCl)共同作為生產(chǎn)過(guò)程中最終洗脫目標(biāo)蛋白緩沖液較為合適。

表7純度比較

表7可見(jiàn)，在CN1680550A的純化方法中，沒(méi)有SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子交換層析的步驟，在進(jìn)行凝膠層析之后，直接進(jìn)行親和層析，導(dǎo)致蛋白純度不高，僅為90.660％～96.627％。而在本發(fā)明的方法中，增加SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子交換層析的步驟，可使蛋白純度提高至98.3％～99.8％。

(二)優(yōu)化純化第2步凝膠層析緩沖體系中的pH值和鹽濃度

1、試驗(yàn)方法：降低CN1680550A中的方法純化第2步的緩體液的PH值和鹽濃度，將純化1中間體進(jìn)行純化第2步時(shí)，以吸收峰的最高點(diǎn)為分界線，分別進(jìn)行吸收，分為前半峰和后半峰，將收到的兩個(gè)樣品分別進(jìn)行第3步，然后對(duì)第3步收到的純化3中間體進(jìn)行宿主蛋白殘留量(用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)，按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。)和SDS-PAGE的檢驗(yàn)(藥典方法)。

1.1降低純化第2步凝膠層析緩沖體系中的pH值和鹽濃度的電泳圖比較

CN1680550A方法：將純化1中間體進(jìn)行第2步凝膠層析；

本發(fā)明：以Sephacryl S-200HR凝膠分子篩填料為介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析，層析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽平衡緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化中間體1直接上樣，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽洗脫緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)洗脫。

1.2降低純化第2步凝膠層析的緩沖體系中的pH值和鹽濃度前后純化2中間體，分別通過(guò)第三步SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子交換層析后的純化3中間體的電泳圖比較

CN1680550A方法：進(jìn)行第二步凝膠層析后按本發(fā)明純化第3步進(jìn)行純化后，將純化3中間體直接上樣；

本發(fā)明的方法：以Sephacryl S-200HR凝膠分子篩填料為介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析。層析柱采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽平衡緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化中間體1直接上樣，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽洗脫緩沖液(pH6.0±0.5含0.05～0.12mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280 紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰得到純化中間體2；采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽高鹽洗脫緩沖液(pH7.0±0.5含0.28～0.35mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫；

本發(fā)明的方法：采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽低鹽洗脫緩沖液(pH6.0±0.5含0.20～0.26mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫得到純化3中間體進(jìn)行上樣。

2、試驗(yàn)結(jié)果：

2.1通過(guò)降低純化第2步凝膠層析的緩沖體系中的pH值和鹽濃度，使得凝膠填料對(duì)蛋白產(chǎn)生非特異性吸附，延遲目標(biāo)蛋白峰(峰2)的出峰位置，擴(kuò)大凝膠的第二雜質(zhì)峰和主峰之間的間距，分離度大于CN1680550A，從而提高蛋白純度。

2.2本發(fā)明獲得的純化3中間體宿主細(xì)胞蛋白殘留量遠(yuǎn)低于CN1680550A中獲得的純化3中間體，優(yōu)化后去除宿主細(xì)胞蛋白能力提高2倍～5倍，見(jiàn)表8。

表8純化中間體3宿主蛋白殘留量(％)

2.3通過(guò)降低純化第2步凝膠層析的緩沖體系中的pH值和鹽濃度前后純化2中間體，分別通過(guò)第三步SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子交換層析后的純化3中間體，可以去除CN1680550A方法不能去除的28KD和32KD的雜蛋白，從而提高了目標(biāo)蛋白純度。純化3中間體SDS-PAGE電泳純度數(shù)據(jù)見(jiàn)表9。

表9 SDS-PAGE電泳純度(％)

綜上所述，本發(fā)明對(duì)CN1680550A中的工藝進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，增加步驟(3)并通過(guò)對(duì)純化過(guò)程中緩沖液及鹽離子濃度的調(diào)整，大大降低了雜蛋白的量，提高了目標(biāo)蛋白純度，同時(shí)大幅降低了DAN、宿主細(xì)胞殘留蛋白及病毒等外源性污染。并通過(guò)第6步采用磷酸鹽緩沖液替換Tris-HCl緩沖液，提高了產(chǎn)品的安全性，降低了制劑的臨床應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)，為制劑產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化打下了良好的基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1、工藝流程圖，其中虛線框內(nèi)為病毒滅活/去除工藝步驟

圖2、低pH孵育滅活病毒效果驗(yàn)證流程圖

圖3、納米過(guò)濾去除病毒效果驗(yàn)證流程圖

圖4、SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子交換層析后的樣品電泳圖

條帶1、CN1680550A方法中，在進(jìn)行第二步凝膠層析后純化中間體2直接上樣，

條帶2、本發(fā)明的方法中，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽高鹽洗脫緩沖液(pH7.0±0.5含0.28～0.35mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫；

條帶3、本發(fā)明的方法中，采用0.005～0.015mol/L磷酸鹽低鹽洗脫緩沖液(pH6.0±0.5含0.20～0.26mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫。

圖5、降低純化第2步凝膠層析的緩沖體系中的pH值和鹽濃度前后純化中間體2，分別通過(guò)第三步SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子交換層析后的純化中間體3電泳圖。

色譜峰1：CN1680550A凝膠層析圖譜目標(biāo)蛋白峰

色譜峰2:本發(fā)明凝膠層析圖譜目標(biāo)蛋白峰

圖6、降低純化第2步凝膠層析的緩沖體系中的pH值和鹽濃度前后純化2中間體，其中

條帶1:凝膠層析上樣前樣本、

條帶2:本發(fā)明凝膠層析前半峰

條帶3:本發(fā)明凝膠層析后半峰

條帶4:CN1680550A凝膠層析前半峰

條帶5:CN1680550A凝膠層析后半峰

本發(fā)明具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

純化第1步：蛋白捕獲

以Streamline SP陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，發(fā)酵液取上清液調(diào)節(jié)pH值至6.0后上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.5mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化中間體1。

純化第2步：凝膠層析

以Sephacryl S-200 HR凝膠分子篩填料為介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.09mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化中間體1直接上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.09mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化中間體2。

純化第3步：陽(yáng)離子交換層析

以SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化中間體2調(diào)節(jié)pH值至6.0后上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH6.0含0.25mol/L NaCl)洗脫雜質(zhì)，0.01mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH7.0含0.3mol/L NaCl)洗脫目標(biāo)蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化中間體3。于-20℃以下冷凍儲(chǔ)存。

純化第4步：低pH孵育

將孵育后純化中間3體置溫度穩(wěn)定的恒溫水浴鍋內(nèi)，控制溫度26℃，在升溫過(guò)程中不停攪拌純化中間體3，待溫度上升至控制溫度時(shí)，用稀鹽酸調(diào)節(jié)純化中間體3pH值3.5；重新置于恒溫水浴鍋中開(kāi)始低pH孵育，孵育90min，用2M的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值7.0±0.5；將孵育后純化中間體3置于冰箱暫存。

純化第5步：親和層析

以Benzamidine Sepharose 4FF H-sub親和填料為介質(zhì)進(jìn)行親和層析。層析柱采 用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。根據(jù)制劑所需蛋白量要求取多批純化中間體3的冷凍蛋白溶液復(fù)融及混合，混合溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0后上樣。采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化中間體4。

純化第6步：陰離子交換層析

以Streamline DEAE陰離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化中間體4與0.03mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)按1：2體積比混合，調(diào)節(jié)pH值至8.0后上樣，用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化中間體5。

純化第7步：陽(yáng)離子交換層析

以SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化中間體5調(diào)節(jié)pH值至6.0后上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化中間體6。

純化第8步：納米過(guò)濾

純化中間體6經(jīng)0.1μm孔徑的PVDF預(yù)過(guò)濾器(預(yù)過(guò)濾過(guò)程是為了除掉蛋白復(fù)融過(guò)程中的蛋白聚集成的顆粒，以免堵掉20nm的小孔濾膜)+20nm孔徑的PVDF納米過(guò)濾器，在壓力不超過(guò)5bar的條件下收集濾液，純化中間體6過(guò)濾完成后用0.01mol/L PB緩沖液緩沖液進(jìn)行頂洗，過(guò)濾時(shí)間不超過(guò)120min，收集濾液即得尿激酶原。

實(shí)施例2

純化第1步：蛋白捕獲

以Streamline SP陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，發(fā)酵液取上清液調(diào)節(jié)pH 值至5.5后上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.3mol/L NaCl洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化中間體1。

純化第2步：凝膠層析

以Sephacryl S-200HR凝膠分子篩填料為介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化中間體1直接上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/LNaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化中間體2。

純化第3步：陽(yáng)離子交換層析

以SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化中間體2調(diào)節(jié)pH值至5.5后上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH5.5含0.20mol/L NaCl)洗脫雜質(zhì)，0.005mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH6.5含0.28mol/L NaCl)洗脫目標(biāo)蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化中間體3。于-20℃以下冷凍儲(chǔ)存。

純化第4步：低pH孵育

將孵育后純化中間3體置溫度穩(wěn)定的恒溫水浴鍋內(nèi)，控制溫度22℃，在升溫過(guò)程中不停攪拌純化中間體3，待溫度上升至控制溫度時(shí)，用稀鹽酸調(diào)節(jié)純化中間體3pH值3.0；重新置于恒溫水浴鍋中開(kāi)始低pH孵育，孵育30min，用1M的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值7.0±0.5；將孵育后純化中間體3置于冰箱暫存。

純化第5步：親和層析

以Benzamidine Sepharose 4FF H-sub親和填料為介質(zhì)進(jìn)行親和層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。根據(jù)制劑所需蛋白量要求取多批純化中間體3的冷凍蛋白溶液復(fù)融及混合，混合溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5后上樣。采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化中間體4。

純化第6步：陰離子交換層析

以Streamline DEAE陰離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.015mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5含0.05mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化中間體4與0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)按1：2體積比混合，調(diào)節(jié)pH值至7.5后上樣，用0.015mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5含0.05mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化中間體5。

純化第7步：陽(yáng)離子交換層析

以SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化中間體5調(diào)節(jié)pH值至5.5后上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化中間體6。

純化第8步：納米過(guò)濾

純化中間體6經(jīng)0.1μm孔徑的PVDF預(yù)過(guò)濾器(預(yù)過(guò)濾過(guò)程是為了除掉蛋白復(fù)融過(guò)程中的蛋白聚集成的顆粒，以免堵掉20nm的小孔濾膜)+20nm孔徑的PVDF納米過(guò)濾器，在壓力不超過(guò)5bar的條件下收集濾液，純化中間體6過(guò)濾完成后用0.01mol/L PB緩沖液緩沖液進(jìn)行頂洗，過(guò)濾時(shí)間不超過(guò)120min，收集濾液即得尿激酶原。

實(shí)施例3

純化第1步：蛋白捕獲

以Streamline SP陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，發(fā)酵液取上清液調(diào)節(jié)pH值至6.5后上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.7mol/L NaCl洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化中間體1。

純化第2步：凝膠層析

以Sephacryl S-200HR凝膠分子篩填料為介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.12mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化中間 體1直接上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.12mol/L)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化中間體2。

純化第3步：陽(yáng)離子交換層析

以SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化中間體2調(diào)節(jié)pH值至6.5后上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH6.5含0.26mol/L NaCl)洗脫雜質(zhì)，0.015mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH7.5含0.35mol/L NaCl)洗脫目標(biāo)蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化中間體3。于-20℃以下冷凍儲(chǔ)存。

純化第4步：低pH孵育

將孵育后純化中間3體置溫度穩(wěn)定的恒溫水浴鍋內(nèi)，控制溫度28℃，在升溫過(guò)程中不停攪拌純化中間體3，待溫度上升至控制溫度時(shí)，用稀鹽酸調(diào)節(jié)純化中間體3pH值4.0；重新置于恒溫水浴鍋中開(kāi)始低pH孵育，孵育60min，用4M的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值7.0±0.5；將孵育后純化中間體3置于冰箱暫存。

純化第5步：親和層析

以Benzamidine Sepharose 4FF H-sub親和填料為介質(zhì)進(jìn)行親和層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。根據(jù)制劑所需蛋白量要求取多批純化中間體3的冷凍蛋白溶液復(fù)融及混合，混合溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5后上樣。采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化中間體4。

純化第6步：陰離子交換層析

以Streamline DEAE陰離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.025mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5含0.20mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化中間體4與0.035mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5)按1：2體積比混合，調(diào)節(jié)pH值至8.5后上樣，用0.025mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5含0.15mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化中間體5。

純化第7步：陽(yáng)離子交換層析

以SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化中間體5調(diào)節(jié)pH值至6.5后上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為本發(fā)明所要得到的尿激酶原。

純化第8步：納米過(guò)濾

純化中間體6經(jīng)0.1μm孔徑的PVDF預(yù)過(guò)濾器(預(yù)過(guò)濾過(guò)程是為了除掉蛋白復(fù)融過(guò)程中的蛋白聚集成的顆粒，以免堵掉20nm的小孔濾膜)+20nm孔徑的PVDF納米過(guò)濾器，在壓力不超過(guò)5bar的條件下收集濾液，純化中間體6過(guò)濾完成后用0.01mol/L PB緩沖液緩沖液進(jìn)行頂洗，過(guò)濾時(shí)間不超過(guò)120min，收集濾液即得尿激酶原。

實(shí)施例4

純化第1步：蛋白捕獲

以Streamline SP陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.008mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.12mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，發(fā)酵液取上清液調(diào)節(jié)pH值至6.0后上樣，采用0.008mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.4mol/L洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化中間體1。

純化第2步：凝膠層析

以Sephacryl S-200 HR凝膠分子篩填料為介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.07mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化中間體1直接上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.07mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化中間體2。

純化第3步：陽(yáng)離子交換層析

以SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.012mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.012mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化中間體2調(diào)節(jié)pH 值至6.0后上樣，采用0.012mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH6.0含0.25mol/L NaCl)洗脫雜質(zhì)，0.012mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH7.0含0.3mol/L NaCl)洗脫目標(biāo)蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化中間體3。于-20℃以下冷凍儲(chǔ)存。

純化第4步：低pH孵育將孵育后純化中間3體置溫度穩(wěn)定的恒溫水浴鍋內(nèi)，控制溫度22℃，在升溫過(guò)程中不停攪拌純化中間體3，待溫度上升至控制溫度時(shí)，用稀鹽酸調(diào)節(jié)純化中間體3pH值3.0；重新置于恒溫水浴鍋中開(kāi)始低pH孵育，孵育30min，用1M的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值7.0±0.5；將孵育后純化中間體3置于冰箱暫存。

純化第5步：親和層析

以Benzamidine Sepharose 4FF H-sub親和填料為介質(zhì)進(jìn)行親和層析。層析柱采用0.008mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.4mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。根據(jù)制劑所需蛋白量要求取多批純化中間體3的冷凍蛋白溶液復(fù)融及混合，混合溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5后上樣。采用0.008mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.4mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化中間體4。

純化第6步：陰離子交換層析

以Streamline DEAE陰離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.01mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.15mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化中間體4與0.03mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)按1：2體積比混合，調(diào)節(jié)pH值至8.0后上樣，用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化中間體5。

純化第7步：陽(yáng)離子交換層析

以SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.009mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.11mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化中間體5調(diào)節(jié)pH值至6.5后上樣，采用0.009mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.4mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化中間體6。

純化第8步：納米過(guò)濾

純化中間體6經(jīng)0.1μm孔徑的PVDF預(yù)過(guò)濾器(預(yù)過(guò)濾過(guò)程是為了除掉蛋白復(fù)融過(guò)程中的蛋白聚集成的顆粒，以免堵掉20nm的小孔濾膜)+20nm孔徑的PVDF納米過(guò)濾器，在壓力不超過(guò)5bar的條件下收集濾液，純化中間體6過(guò)濾完成后用0.01mol/L PB緩沖液緩沖液進(jìn)行頂洗，過(guò)濾時(shí)間不超過(guò)120min，收集濾液即得尿激酶原。

實(shí)施例5

純化第1步：蛋白捕獲

以SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，發(fā)酵液取上清液調(diào)節(jié)pH值至6.0后上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.5mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化1中間體。

純化第2步：凝膠層析

以Sephadex G-50凝膠分子篩填料為介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.09mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化1中間體直接上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.09mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化2中間體。

純化第3步：陽(yáng)離子交換層析

以SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化2中間體調(diào)節(jié)pH值至6.0后上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH6.0含0.25mol/L NaCl)洗脫雜質(zhì)，0.01mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH7.0含0.3mol/L NaCl)洗脫目標(biāo)蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化3中間體。于-20℃以下冷凍儲(chǔ)存。

純化第4步：低pH孵育

將孵育后純化中間3體置溫度穩(wěn)定的恒溫水浴鍋內(nèi)，控制溫度26℃，在升溫過(guò)程中不停攪拌純化中間體3，待溫度上升至控制溫度時(shí)，用稀鹽酸調(diào)節(jié)純化中間體3pH值3.5；重新置于恒溫水浴鍋中開(kāi)始低pH孵育，孵育90min，用2M的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值7.0±0.5；將孵育后純化中間體3置于冰箱暫存。

純化第5步：親和層析

以BenzamidineSepharose 4FF H-sub親和填料為介質(zhì)進(jìn)行親和層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。根據(jù)制劑所需蛋白量要求取多批純化3中間體的冷凍蛋白溶液復(fù)融及混合，混合溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0后上樣。采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化4中間體。

純化第6步：陰離子交換層析

以Streamline DEAE陰離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化4中間體與0.03mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)按1：2體積比混合，調(diào)節(jié)pH值至8.0后上樣，用0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0含0.1mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化5中間體。

純化第7步：陽(yáng)離子交換層析

以SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.0含0.1mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化5中間體調(diào)節(jié)pH值至6.0后上樣，采用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0含0.4mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化中間體6。

純化第8步：納米過(guò)濾

純化中間體6經(jīng)0.1μm孔徑的PVDF預(yù)過(guò)濾器(預(yù)過(guò)濾過(guò)程是為了除掉蛋白復(fù)融過(guò)程中的蛋白聚集成的顆粒，以免堵掉20nm的小孔濾膜)+20nm孔徑的PVDF納米過(guò)濾器，在壓力不超過(guò)5bar的條件下收集濾液，純化中間體6過(guò)濾完成后用0.01mol/L PB緩沖液緩沖液進(jìn)行頂洗，過(guò)濾時(shí)間不超過(guò)120min，收集濾液即 得尿激酶原。

實(shí)施例6

純化第1步：蛋白捕獲

以Streamline SP陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，發(fā)酵液取上清液調(diào)節(jié)pH值至5.5后上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.3mol/L NaCl洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化1中間體。

純化第2步：凝膠層析

以Sephacryl S-200 HR凝膠分子篩填料為介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化1中間體直接上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/LNaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化2中間體。

純化第3步：陽(yáng)離子交換層析

以SP Sephadex C-50陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化2中間體調(diào)節(jié)pH值至5.5后上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH5.5含0.20mol/L NaCl)洗脫雜質(zhì)，0.005mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH6.5含0.28mol/L NaCl)洗脫目標(biāo)蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化3中間體。于-20℃以下冷凍儲(chǔ)存。

純化第4步：低pH孵育

將孵育后純化中間3體置溫度穩(wěn)定的恒溫水浴鍋內(nèi)，控制溫度22℃，在升溫過(guò)程中不停攪拌純化中間體3，待溫度上升至控制溫度時(shí)，用稀鹽酸調(diào)節(jié)純化中間體3pH值3.0；重新置于恒溫水浴鍋中開(kāi)始低pH孵育，孵育30min，用1M的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值7.0±0.5；將孵育后純化中間體3置于冰箱暫存。

純化第5步：親和層析

以Arginine Sepharose 4B親和填料為介質(zhì)進(jìn)行親和層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。根據(jù)制劑所需蛋白量要求取多批純化3中間體的冷凍蛋白溶液復(fù)融及混合，混合溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5后上樣。采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化4中間體。

純化第6步：陰離子交換層析

以DEAE Sephacel DE-52陰離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.015mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5含0.05mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化4中間體與0.02mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)按1：2體積比混合，調(diào)節(jié)pH值至7.5后上樣，用0.015mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5含0.05mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化5中間體。

純化第7步：陽(yáng)離子交換層析

以SP Sepharose F.F.陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化5中間體調(diào)節(jié)pH值至5.5后上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.3mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化中間體6。

純化第8步：納米過(guò)濾

純化中間體6經(jīng)0.1μm孔徑的PVDF預(yù)過(guò)濾器(預(yù)過(guò)濾過(guò)程是為了除掉蛋白復(fù)融過(guò)程中的蛋白聚集成的顆粒，以免堵掉20nm的小孔濾膜)+20nm孔徑的PVDF納米過(guò)濾器，在壓力不超過(guò)5bar的條件下收集濾液，純化中間體6過(guò)濾完成后用0.01mol/L PB緩沖液緩沖液進(jìn)行頂洗，過(guò)濾時(shí)間不超過(guò)120min，收集濾液即得尿激酶原。

實(shí)施例7

純化第1步：蛋白捕獲

以Sephadex G-50陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，發(fā)酵液取上清液調(diào)節(jié)pH值 至6.5后上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.7mol/LNaCl洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化1中間體。

純化第2步：凝膠層析

以Sephacryl S-200HR凝膠分子篩填料為介質(zhì)進(jìn)行凝膠層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.12mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化1中間體直接上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.12mol/L)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化2中間體。

純化第3步：陽(yáng)離子交換層析

以SP Sephadex C-50陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，將純化2中間體調(diào)節(jié)pH值至6.5后上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽低鹽緩沖液(pH6.5含0.26mol/L NaCl)洗脫雜質(zhì)，0.015mol/L磷酸鹽高鹽緩沖液(pH7.5含0.35mol/L NaCl)洗脫目標(biāo)蛋白，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化3中間體。于-20℃以下冷凍儲(chǔ)存。

純化第4步：低pH孵育

將孵育后純化中間3體置溫度穩(wěn)定的恒溫水浴鍋內(nèi)，控制溫度28℃，在升溫過(guò)程中不停攪拌純化中間體3，待溫度上升至控制溫度時(shí)，用稀鹽酸調(diào)節(jié)純化中間體3pH值4.0；重新置于恒溫水浴鍋中開(kāi)始低pH孵育，孵育60min，用4M的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值7.0±0.5；將孵育后純化中間體3置于冰箱暫存。

純化第5步：親和層析

以BenzamidineSepharose 4FF H-sub親和填料為介質(zhì)進(jìn)行親和層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。根據(jù)制劑所需蛋白量要求取多批純化3中間體的冷凍蛋白溶液復(fù)融及混合，混合溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5后上樣。采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)進(jìn)行洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化4中間體。

純化第6步：陰離子交換層析

以Streamline DEAE陰離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.025mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5含0.20mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化4中間體與0.035mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5)按1：2體積比混合，調(diào)節(jié)pH值至8.5后上樣，用0.025mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5含0.15mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰，即為純化5中間體。

純化第7步：陽(yáng)離子交換層析

以SP Sephadex C-50陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.5含0.15mol/L NaCl)進(jìn)行平衡。純化5中間體調(diào)節(jié)pH值至6.5后上樣，采用0.015mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5含0.5mol/L NaCl)洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，即為純化中間體6。

純化第8步：納米過(guò)濾

純化中間體6經(jīng)0.1μm孔徑的PVDF預(yù)過(guò)濾器(預(yù)過(guò)濾過(guò)程是為了除掉蛋白復(fù)融過(guò)程中的蛋白聚集成的顆粒，以免堵掉20nm的小孔濾膜)+20nm孔徑的PVDF納米過(guò)濾器，在壓力不超過(guò)5bar的條件下收集濾液，純化中間體6過(guò)濾完成后用0.01mol/L PB緩沖液緩沖液進(jìn)行頂洗，過(guò)濾時(shí)間不超過(guò)120min，收集濾液即得尿激酶原。

實(shí)施例8

以蛋白G-Sepharose 4B為填料進(jìn)行親和層析，上樣前用pH7.5±0.5的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡，將尿激酶原發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH至7.5±0.5后上樣，上樣完畢后用pH7.5±0.5的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，后用pH2.5±0.5的0.2mol/L的Gly-HCl緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白，根據(jù)UV280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，既得初步純化液。

實(shí)施例9

以Streamline SP陽(yáng)離子填料為介質(zhì)進(jìn)行交換層析。層析柱采用0.005磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.05mol/L NaCl)進(jìn)行平衡，發(fā)酵液取上清液調(diào)節(jié)pH值至 5.5后上樣，采用0.005mol/L磷酸鹽緩沖液(pH5.5含0.3mol/L NaCl洗脫，根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰，即為純化中間體；以蛋白G-Sepharose 4B為填料進(jìn)行親和層析，上樣前用pH7.5±0.5的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡，將純化中間體調(diào)節(jié)pH至7.5±0.5后上樣，上樣完畢后用pH7.5±0.5的0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白，后用pH2.5±0.5的0.2mol/L的Gly-HCl緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白，根據(jù)UV280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰，既得初步純化液。

實(shí)施例10

取實(shí)施例5或6的初步純化液，按照實(shí)施例1-4任何一項(xiàng)步驟4-8操作得到人重組尿激酶原原液。