1.一種重組人尿激酶原的純化及去除病毒方法,其特征在于:將尿激酶原發(fā)酵液通過(guò)層析后獲得的初步純化液在酸性條件下孵育;和
納米過(guò)濾的步驟滅活和去除病毒,而尿激酶原原液直接被洗脫下來(lái)。
2.如權(quán)利要求1所述的純化及去除病毒方法,其特征在于:所述的低pH孵育步驟是指控制初步純化液孵育溫度,用酸調(diào)節(jié)pH值3.0-4.0后開始低pH孵育,再用堿調(diào)節(jié)溶液pH值7.0±0.5;即得孵育后的初步純化液。
3.如權(quán)利要求2所述的純化及去除病毒方法,其特征在于:所述低pH孵育步驟是指初步純化液置溫度穩(wěn)定的恒溫水浴鍋內(nèi),控制初步純化液孵育溫度22-28℃,攪拌,用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值3.0-4.0后開始低pH孵育,孵育30-90min,再用1.0-4.0M的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值7.0±0.5;即得孵育后的初步純化液。
4.如權(quán)利要求2所述的純化及去除病毒方法,其特征在于:所述的納米濾過(guò)步驟是指孵育后的初步純化液,進(jìn)一步經(jīng)過(guò)層析純化,得到的洗脫液經(jīng)過(guò)納米膜過(guò)濾,病毒富集在納米膜上,收集濾液即得本發(fā)明的重組人尿激酶原原液。
5.如權(quán)利要求4所述的純化及去除病毒方法,其特征在于:所述的納米濾過(guò)步驟是指孵育后的初步純化液,進(jìn)一步經(jīng)過(guò)層析純化,得到的洗脫液經(jīng)過(guò)微孔濾膜和納米膜過(guò)濾,病毒富集在納米膜上,收集濾液即得本發(fā)明的尿激酶原。
6.如權(quán)利要求5所述的純化及去除病毒方法,其特征在于,所述膜材料為聚偏二氟乙烯PVDF膜。
7.如權(quán)利要求2所述的純化及去除病毒方法,其特征在于,所述孵育后的初步純化液是通過(guò)下述方法制備得到的:步驟(1)蛋白捕獲:取尿激酶原發(fā)酵液上清液調(diào)節(jié)pH值至5.5~6.5后陽(yáng)離子交換層柱法上樣,采用0.005~0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫,根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰,即為純化中間體1;
步驟(2)凝膠層析:中間體1上凝膠層析柱后,采用0.005~0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫,根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰即為純化中間體2;
步驟(3)陽(yáng)離子交換層析:中間體2調(diào)節(jié)pH值至6.0±0.5后陽(yáng)離子交換層 析柱上樣,用0.005~0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫,根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰,即為初步純化液。
8.如權(quán)利要求4所述的純化及去除病毒方法,其特征在于,所述的步驟(A)親和層析:純化中間體3pH值至7.0±0.5后親和層析柱上樣,采用0.005~0.015mol/L磷酸鹽洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫,根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰,即為純化中間體4;
步驟(B)陰離子交換層析:純化中間體4與0.02~0.035mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0±0.5)按1:1.5-3體積比混合,調(diào)節(jié)pH值至8.0±0.5后陰離子交換柱上樣,用0.015~0.025mol/L Tris-HCl緩沖液洗脫,根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰,即為純化中間體5;
步驟(C)陽(yáng)離子交換層析:純化中間體5調(diào)節(jié)pH值至6.0±0.5后陽(yáng)離子交換層析柱上樣,采用0.005~0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫,根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰,即為層析后的洗脫液,簡(jiǎn)稱純化中間體6。
9.一種重組人尿激酶原的純化及去除病毒方法,其特征在于,包括如下步驟:
步驟(1)蛋白捕獲
步驟(2)凝膠層析
步驟(3)陽(yáng)離子交換層析:
步驟(4)低pH孵育:
步驟(5)親和層析:
步驟(6)陰離子交換層析:
步驟(7)陽(yáng)離子交換層析:
步驟(8)納米過(guò)濾。
10.如權(quán)利要求8所述的純化及去除病毒方法,其特征在于,包括如下步驟:
步驟(1)中所述發(fā)酵液取上清液調(diào)節(jié)pH值至5.5~6.5后陽(yáng)離子交換層柱法上樣,采用0.005~0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫,根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集洗脫蛋白峰,即為純化中間體1;
步驟(2)中間體1上凝膠層析柱后,采用0.005~0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫,根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰即為純化中間體2;
步驟(3)中間體2調(diào)節(jié)pH值至6.0±0.5后陽(yáng)離子交換層析柱上樣,用0.005~0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫,根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰,即為初步純化液;
(4)控制初步純化液孵育溫度,用酸調(diào)節(jié)pH值3.0-4.0后開始低pH孵育,再用堿調(diào)節(jié)溶液pH值7.0±0.5,即得孵育后的初步純化液簡(jiǎn)稱孵育后純化中間體3;
步驟(5)孵育后純化中間體3pH值至7.0±0.5后親和層析柱上樣,采用0.005~0.015mol/L磷酸鹽洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫,根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰,即為純化中間體4;
步驟(6)純化中間體4與0.02~0.035mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0±0.5)按1:1.5-3體積比混合,調(diào)節(jié)pH值至8.0±0.5后陰離子交換柱上樣,用0.015~0.025mol/L Tris-HCl緩沖液洗脫,根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集穿透液中的蛋白峰,即為純化中間體5;
步驟(7)純化中間體5調(diào)節(jié)pH值至6.0±0.5后陽(yáng)離子交換層析柱上樣,采用0.005~0.015mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫,根據(jù)UV 280紫外吸收曲線收集目標(biāo)蛋白峰,即為層析后的洗脫液簡(jiǎn)稱純化中間體6;
步驟(8)純化中間體6經(jīng)過(guò)納米膜過(guò)濾,病毒富集在納米膜上,收集濾液即得本發(fā)明的重組人尿激酶原原液。