專利名稱:用嗜熱放線菌生產(chǎn)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的方法及其用于高果糖漿的生產(chǎn)方法
本發(fā)明是關(guān)于葡萄糖異構(gòu)酶生產(chǎn)方法，特別是關(guān)于固定化葡萄糖異構(gòu)酶的生產(chǎn)方法及其用于生產(chǎn)高果糖漿的方法。
酶法是使葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖的重要方法。以前國(guó)內(nèi)曾采用過(guò)液酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但是其產(chǎn)品質(zhì)量差、成本高，無(wú)法進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。目前國(guó)內(nèi)外普遍采用的是固定化酶進(jìn)行異構(gòu)化轉(zhuǎn)化，也就是使酶附著在一個(gè)不溶于水的固相載體上，形成固相酶，然后進(jìn)行異構(gòu)化轉(zhuǎn)化?！短卦S公報(bào)》昭49-42555及50-17560介紹了一種先用嗜熱鏈霉菌Streptomyces YT-№6生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶，然后將培養(yǎng)液過(guò)濾，離心分離后收集到的菌體進(jìn)行自溶等處理，得到酶液，再使酶掛到載體上進(jìn)行異構(gòu)化的方法。該方法由于產(chǎn)生的酶多是胞內(nèi)酶，因此需要一套破壞細(xì)胞壁釋出酶的工藝及設(shè)備，并且此方法轉(zhuǎn)化比較低，1∶2000左右，因此其工藝較復(fù)雜，設(shè)備要求低，產(chǎn)率也較低。
本發(fā)明的目的是改進(jìn)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的生產(chǎn)方法及其用于生產(chǎn)高果糖漿的方法，簡(jiǎn)化工藝，減少設(shè)備，增加產(chǎn)率。
本發(fā)明的方法為采用嗜熱放線菌Streptomyces M 1033(其寄存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心寄存號(hào)為CGMCC№.0032)生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶，此酶中胞外酶占總酶量的90%。
甲、所說(shuō)明菌其培養(yǎng)特征為(1)察氏培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好，氣絲從乳白色到深灰色，基絲由白到黃褐色不形成可溶性色素。
(2)淀粉瓊脂生長(zhǎng)良好，氣絲由白色到灰色，基絲由乳白色到淺黃色不形成可溶性色素。
(3)馬鈴薯浸汁生長(zhǎng)良好，氣絲由白色到灰褐色，基絲由金黃色到淺褐色，不形成可溶性色素。
(4)馬鈴薯塊生長(zhǎng)一般，氣絲由白到淺灰色。
(5)葡糖天冬素瓊脂生長(zhǎng)良好，氣絲由白色到灰色，基絲由乳白色到淺黃色，不形成可溶性色素。
(6)葡糖旦白胨瓊脂生長(zhǎng)良好，氣絲由白到淺灰色，基內(nèi)菌絲由白色到淺褐色，不形成可溶性色素。
乙、所說(shuō)明菌的形態(tài)特征為45～50℃在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)3天，氣絲由白色到灰色，培養(yǎng)3～5天，產(chǎn)生灰色胞子。菌落為園形，似傘狀，表面呈粉狀，胞子絲形狀為彎曲至形成螺旋。胞子形狀為園形、橢園形。
丙、所說(shuō)明菌的生理生化特征為(1)明膠培養(yǎng)基生長(zhǎng)一般，液化明膠能力較弱。
(2)牛奶培養(yǎng)基生長(zhǎng)一般，對(duì)牛奶的凝固胨化能力較差。
(3)淀粉水解瓊脂生長(zhǎng)良好，能利用淀粉，氣生菌絲從白到灰白色，無(wú)可溶性色素形成。
(4)酪氨酸瓊脂生長(zhǎng)困難，少數(shù)菌落，氣絲由白到灰褐色，不形成可溶性色素，酪氨酸酶為陰性。
(5)碳源利用能夠很好地利用淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、甘露醇、肌醇。很難利用棉子糖。
均-態(tài)葡萄糖異構(gòu)酶的某些性質(zhì)清發(fā)酵液經(jīng)(NH4)2SO4淀沉透析脫鹽，DEAE-Sephadex A50柱和Sephadex G150柱提純，得均-態(tài)葡萄糖異構(gòu)酶，園盤(pán)電泳為一個(gè)區(qū)帶。
酶蛋白組成為天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸等。比酶活為180.86單位/mg米氏常數(shù)Km為0.56M。此酶不但能將D-葡糖和D-果糖相互可逆轉(zhuǎn)化，也可將D-木糖和D-木酮糖，D-核糖和D-核酮糖相互可逆轉(zhuǎn)化。
所說(shuō)的菌首先在含有淀粉1～3%，KNO30.05～0.4%，MgSO40.01～0.1%，NaCl0.01～0.1%，K2HPO40.01～0.01%，F(xiàn)eSO40.001～0.005%的培養(yǎng)基上高溫35℃～55℃(范圍比實(shí)施例大一些)培養(yǎng)，其次再把上面得到的菌放入含麩夫3～8%，豆餅0.5～2%，MgSO40.05～0.2%，K2HPO40.05～0.2%，CoCl20.005～0.05%的培養(yǎng)基上通氣1∶0.1～1∶0.5高溫35～50℃培養(yǎng)種子。第三，把種子放入發(fā)酵罐內(nèi)，用含有麩皮3～8%，豆餅0.5～2%，MgSO40.05～0.2%，K2HPO40.05～0.2%，CoCl20.005～0.05%的培養(yǎng)基上通氣1∶0.1～1∶1高溫35～50℃發(fā)酵。第四步把前一步得到的發(fā)酵液過(guò)濾，得到清發(fā)酵液。第五步使清發(fā)酵液中的酶固定在載體上，特別是采用大孔強(qiáng)堿性苯乙烯系季胺基陰離子交換樹(shù)脂為載體吸附清發(fā)酵液中的酶，則得到了固定化葡萄糖異構(gòu)酶。
使用所說(shuō)的固定化酶接觸葡萄糖，則其部分被轉(zhuǎn)化為果糖。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是不用進(jìn)行胞內(nèi)酶釋出處理等工序，因此簡(jiǎn)化了工藝，減少了設(shè)備，并且轉(zhuǎn)化比高。
是本發(fā)明方法的具體工藝流程方框圖。
異構(gòu)酶菌經(jīng)育種、發(fā)酵、壓濾、掛酶后即得到固定化異構(gòu)酶。然后把固相酶裝入柱狀轉(zhuǎn)化器，使葡萄糖通過(guò)轉(zhuǎn)化柱進(jìn)入收集罐，載體樹(shù)脂經(jīng)一段時(shí)間使用后，還可再生，重新掛酶使用。
下面的例子用于說(shuō)明本發(fā)明，是本發(fā)明的最佳實(shí)施例，其工藝流程請(qǐng)參看附圖。
第一步用所說(shuō)的異構(gòu)酶菌在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分為淀粉2%、硝酸鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，氯化鈉0.05%，磷酸氫二鉀0.05%，硫酸亞鐵0.001%，溫度45～50℃，培養(yǎng)5～7天。
第二步把所說(shuō)的異構(gòu)酶菌放入種子罐中，在培養(yǎng)基上育種。培養(yǎng)基的成分為麩皮4%，豆餅1%，硫酸鎂0.1%，磷酸氫二鉀0.1%，氯化鈷0.024%，溫度40～42℃，通氣量1∶0.2～0.4，時(shí)間18小時(shí)。
第三步把種子放入發(fā)酵罐，用上一步同樣的培養(yǎng)基及條件發(fā)酵65小時(shí)，所得發(fā)酵液的酶活為350單位/毫升。
第四步把上一步所得發(fā)酵液不加助濾劑在40m2板框過(guò)濾機(jī)上過(guò)濾，每1m3發(fā)酵液過(guò)濾2～6小時(shí)，得清發(fā)酵液，其酶活占總酶活的90%。
第五步用大孔強(qiáng)堿性苯乙烯系季胺基陰離子交換樹(shù)脂直接吸附清濾液中的異構(gòu)酶，形成固定化葡萄糖異構(gòu)酶。
由此所得的異構(gòu)酶，其酶活可達(dá)8，000～10，000單位/g(干)，總酶的回收率可達(dá)65～70%。
用此固相酶裝入指定管內(nèi)形成柱狀轉(zhuǎn)化器，再在基質(zhì)酶法葡萄糖液DE95%以上，電阻率5，000～50，000Ωcm，濃度30～50%，溫度55～65℃的條件下，使此葡萄糖溶液通過(guò)轉(zhuǎn)化器，則有42%的葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖，酶的轉(zhuǎn)化比為1∶3，000再經(jīng)離子交換和真空濃縮后可得71%的干物質(zhì)。
補(bǔ)正 85100412文件名稱 頁(yè) 行 補(bǔ)正前 補(bǔ)正后說(shuō)明書(shū) 1 7 …昭49-42555 …昭49-42555及50-17560… 及昭50-17560…1 倒7 設(shè)備要求低，產(chǎn)率也較 設(shè)備要求多，產(chǎn)率也較低。 低。
權(quán)利要求
1.用嗜熱放線菌生產(chǎn)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的方法第一步把嗜熱放線菌放在含有淀粉、硝酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵的培養(yǎng)基上高溫培養(yǎng)。第二步把前一步得到的嗜熱放線菌放在含有麩皮、豆餅、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈷的培養(yǎng)基上通氣高溫培養(yǎng)種子。第三步把種子放入發(fā)酵罐內(nèi)，用含有麩皮、豆餅、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、氯化鈷的培養(yǎng)基上通氣高溫發(fā)酵。第四步把前一步得到的發(fā)酵液過(guò)濾，得清發(fā)酵液。第五步使清發(fā)酵液中的酶固定在載體上。其特征在于所說(shuō)的嗜熱放線菌是寄存在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心寄存號(hào)為CGMCC№·0032的嗜熱放線菌StreptomycesM1033。甲、所說(shuō)明菌其培養(yǎng)特征為(1)察氏培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好，氣絲從乳白色到深灰色，基絲由白到黃褐色，不形成可溶性色素。(2)淀粉瓊脂生長(zhǎng)良好，氣絲由白色到灰色，基絲由乳白色到淺黃色，不形成可溶性色素。(3)馬鈴薯浸汁生長(zhǎng)良好，氣絲由白色到灰褐色，基絲由金黃色到淺褐色，不形成可溶性色素。(4)馬鈴薯塊生長(zhǎng)一般，氣絲由白到淺灰色。(5)葡糖天冬素瓊脂生長(zhǎng)良好，氣絲由白色到灰色，基絲由乳白色到黃色，不形成可溶性色素。(6)葡糖蛋白胨瓊脂生長(zhǎng)良好，氣絲白到淺灰色，基內(nèi)菌絲由白色到淺褐色，不形成可溶性色素。乙、所說(shuō)明菌的形態(tài)特征為45°～50℃在高氏1號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)3天，氣絲由白色到灰色，培養(yǎng)3～5天，產(chǎn)生灰色胞子。菌落為園形，似傘狀，表面呈粉狀，胞子絲形狀為彎曲至形成螺旋，胞子形狀為園形、橢園形。丙、所說(shuō)明菌的生理生化特征為(1)明膠培養(yǎng)基生長(zhǎng)一般，液化明膠能力較弱。(2)牛奶培養(yǎng)基生長(zhǎng)一般，對(duì)牛奶的凝固胨化能力較差。(3)淀粉水解瓊脂生長(zhǎng)良好，能利用淀粉，氣生菌絲從白到灰白色，無(wú)可溶性色素形成。(4)酪氨酸瓊脂生長(zhǎng)困難，少數(shù)菌落，氣絲由白到灰褐色，不形成可溶性色素，酪氨酸酶為陰性。(5)碳源利用能夠很好地利用淀粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、甘露糖、肌糖。很難利用棉子糖。均一態(tài)葡萄糖異構(gòu)酶的某些性質(zhì)清發(fā)酵液經(jīng)(NH4)2SO4沉淀透析脫鹽，DEAE-Sephadex A50柱和Sephadex G150柱提純，得均一態(tài)葡萄糖異構(gòu)糖，園盤(pán)電泳為一個(gè)區(qū)帶。酶蛋白組成為天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、精氨酸等。比酶活為180·86單位/mg，米氏常數(shù)Km為0·56M。此酶不但能將D-葡糖和D-果糖相互可逆轉(zhuǎn)化，也可將D-木糖和D-木酮糖，D-核糖和D-核酮糖相互可逆轉(zhuǎn)化。
2.按照權(quán)利要求
1所說(shuō)的方法其特征在于以大孔強(qiáng)堿性苯乙烯系季胺基陰離子交換樹(shù)脂為載體，吸附清發(fā)酵液中的酶，形成固定化葡萄糖異構(gòu)酶。
3.按照權(quán)利要求
1和2所說(shuō)的方法，其特征在于所生產(chǎn)出的固定化葡萄糖異構(gòu)酶生產(chǎn)高果糖糖漿的方法。
專利摘要
用嗜熱放線菌生產(chǎn)固定化葡萄糖異構(gòu)酶的方法 及其用于高果糖漿的生產(chǎn)方法是一種制酶及酶法制 糖方法。該菌發(fā)酵條件粗放，較高溫不易污染，酶活 350單位/毫升，胞外酶占總酶90％。用離子交換樹(shù)脂 掛酶，酶活8,000～10,000單位/克(干)，總酶回收率 65～70％，用酶法葡萄糖制得42％高果糖漿轉(zhuǎn)化比 為1∶3000。
文檔編號(hào)C12P19/00GK85100412SQ85100412
公開(kāi)日1988年2月10日 申請(qǐng)日期1985年6月25日
發(fā)明者賀家明, 袁建國(guó) 申請(qǐng)人:山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan