本發(fā)明涉及高分子載體材料領(lǐng)域和藥物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯及其制備方法和作為藥物載體的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

透明質(zhì)酸(Hyaluronan，HA)是一種由N-乙酰-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸經(jīng)β-1，4糖苷鍵連接而成的天然線性多糖。HA具有良好的水溶性，生物相容性好，容易進(jìn)行化學(xué)修飾，已作為多種藥物載體被廣泛應(yīng)用。腫瘤細(xì)胞表面的HA受體CD44有過(guò)量表達(dá)，透明質(zhì)酸與受體之間可以特異性結(jié)合，可以使納米粒靶向到腫瘤，同時(shí)由CD44介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用可以使藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，增加難溶性藥物的生物利用度。但是不同分子量的HA本身對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移的影響可能表現(xiàn)為促進(jìn)，也可能表現(xiàn)為抑制，所以HA衍生物材料對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響有待進(jìn)一步研究。

Anaid Benitez等發(fā)現(xiàn)硫酸化透明質(zhì)酸可以抑制前列腺癌細(xì)胞如LNCaP，LNCaP-Al，DU145，LAPC-4的增殖、遷移和入侵。(Anaid Benitez，et al.，Targeting Hyaluronidase for Cancer Therapy：Antitumor Activity of Sulfated Hyaluronic Acid in Prostate Cancer Cells，Cancer Research，2011，71(12)；4085-95)。Stephanie等合成硫酸化透明質(zhì)酸，作用于I型皰疹病毒，說(shuō)明其有抗病毒活性，且抗病毒活性隨著硫酸化程度的提高而增強(qiáng)(Stephanie Michaela，et al，Synthesis and Antiherpetic Activity of Carboxymethylated and Sulfated Hyaluronan Derivatives.Carbohydrate Polymers，2012，90(2012)：608-615)。但是上述的硫酸化透明質(zhì)酸仍舊是親水性的，不適用于難溶性藥物的包封及選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)。

兩親性聚合物膠束由其疏水端聚集形成的內(nèi)核，包載難溶性藥物，增強(qiáng)脂溶性藥物的溶解度；親水端聚合形成的外殼能夠有效防止藥物被人體網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬，使藥物順利運(yùn)送到病灶部位，提高生物利用度，減少藥物對(duì)正常組織的毒副作用。目前兩親性聚合物膠束材料主要有線性聚合物和非線性聚合物，研究表明，線性聚合物疏水鏈分子量越大，疏水鏈越長(zhǎng)，納米粒通過(guò)疏水作用的載藥量就越高，但同時(shí)膠束的粒徑也會(huì)隨之增大，當(dāng)粒徑過(guò)大時(shí)容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)捕獲，也很難通過(guò)EPR效應(yīng)實(shí)現(xiàn)腫瘤部位的藥物釋放，限制了膠束作為藥物載體的應(yīng)用。此時(shí)具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的非線性聚合物的出現(xiàn)有望解決膠束載藥和粒徑不可兼得的問(wèn)題。由于線性聚合物與非線性聚合物的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同，當(dāng)它們具有相同的相對(duì)分子質(zhì)量時(shí)，非線性聚合物組裝形成的納米載體粒徑要比線性聚合物形成的納米載體粒徑要小的多，可以實(shí)現(xiàn)在不增加納米載體粒徑的同時(shí)攜載更多的疏水性藥物(Svenson S.Dendrimers as versatile platform in drug delivery applications.Eur J Pharm Biopharm，2009，71(3)：445-462)。

本發(fā)明是將透明質(zhì)酸上的羥基進(jìn)行硫酸化，并在HA羧基上接枝Y型化合物2-辛基十二醇，得到硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯。它是兩親性聚合物納米材料，引入的硫酸根有利于改善材料本身的親水性，形成親水性外殼，提高藥物對(duì)癌細(xì)胞的靶向作用；通過(guò)接枝Y形基團(tuán)2-辛基十二醇，形成非線性聚合物膠束，相比于線型聚合物膠束，更有利于形成疏水內(nèi)核，形成更大的疏水空腔，可以包裹更多的藥物；同時(shí)硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯有利于提高HA的抗腫瘤活性，且無(wú)毒，生物相容性好。

目前尚沒(méi)有將硫酸化透明質(zhì)酸接枝Y型脂肪醇酯作為抗腫瘤納米材料的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明描述并要求一種新型硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯、其制備方法以及作為藥物納米載體的應(yīng)用；它是一種安全性好、可生物降解、臨界膠束濃度低的兩親性聚合物，可在水中自組裝形成聚合物納米粒，作為納米藥物傳遞系統(tǒng)，同時(shí)材料本身具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

本發(fā)明的目的在于提供一種硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯及其制備方法。

本發(fā)明的目的在于提供硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯在藥物制劑領(lǐng)域的應(yīng)用。

本發(fā)明涉及的硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯，其特征是在透明質(zhì)酸骨架上接枝疏水的Y形基團(tuán)2-辛基十二烷醇以及親水基團(tuán)硫酸根，使其具有兩親性，可在水中自組裝形成聚合物膠束，作為難溶性藥物的載體。

本發(fā)明所述的硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯，其特征是將疏水的Y形基團(tuán)2-辛基十二烷醇通過(guò)酯鍵接枝到透明質(zhì)酸中葡萄糖醛酸-N乙酰葡萄糖胺重復(fù)單元的羧基上，親水性基團(tuán)硫酸根取代透明質(zhì)酸重復(fù)單元上的羥基。

本發(fā)明所述的硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯，其中接枝的疏水Y型基團(tuán)2-辛基十二烷醇的總?cè)〈葹?％～30％。

本發(fā)明所述的硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯，其中硫酸化率為1～13％。

本發(fā)明所述的硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯，其特征在于選用的HA分子量為5×10³～5×10⁵Da，優(yōu)選5×10³Da。

具體地，本發(fā)明提供了一種硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯的制備方法，包括以下過(guò)程：

透明質(zhì)酸四丁銨鹽(HA-TeBA)的制備：稱取適量透明質(zhì)酸鈉(HA-Na)溶于雙蒸水中，磁力攪拌溶解；稱取一定量的DowexWX8陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(四丁銨型)加入HA-Na中，室溫下磁力攪拌3h，過(guò)濾，冷凍真空干燥24h，40℃真空干燥12h，即得；

硫酸化透明質(zhì)酸(sHA)的制備：精密稱取適量HA-TeBA溶于N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)中，50℃磁力攪拌2h使其溶解；另精密稱取一定量的硫酸化試劑(三氧化硫N，N’-二甲基甲酰胺絡(luò)合物)溶于DMF中，室溫下攪拌溶解后，加入上述HA-TeBA溶液中，充氮?dú)獗Ｗo(hù)，0℃冰浴下磁力攪拌1h；1M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，加入2-3倍體積乙醇靜置過(guò)夜，離心后取沉淀，蒸餾水透析1d，冷凍真空干燥24h；

硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯(sHA-OCD)的制備：精密稱取適量sHA溶于甲酰胺中，室溫磁力攪拌溶解，然后冰浴，加一定量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，冰浴下攪拌2h；另精密量取一定量2-辛基十二烷醇(OCD)溶于DMF中，將其逐滴加入sHA溶液中，35℃磁力攪拌24h；反應(yīng)液加入乙醇沉淀離心，沉淀用水溶解后蒸餾水透析，冷凍真空干燥。

本發(fā)明所述的硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯，可包載難溶性藥物(如多西紫杉醇等)，制成載藥聚合物膠束。

本發(fā)明所述的載藥聚合物納米粒是將硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯溶于雙蒸水，自組裝成濃度為2～8mg/mL的空白膠束溶液，將難溶或微溶性藥物溶于少量有機(jī)溶劑后，逐滴加入上述的空白膠束溶液中，經(jīng)超聲處理后，置于雙蒸水中透析除去有機(jī)溶劑，透析液經(jīng)離心、過(guò)濾后，制得粒徑為100～300nm的聚合物載藥膠束，載藥量可達(dá)1％～19％，包封率均在80％以上。

上述硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯，具有抑制腫瘤生長(zhǎng)，易形成載藥納米粒，制備工藝簡(jiǎn)便，膠束穩(wěn)定性好，包封率高，給藥途徑多等特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1硫酸化透明質(zhì)酸的IR圖譜

圖2硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯的¹H-NMR圖譜

圖3硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯的I₃₇₁/I₃₈₂與聚合物對(duì)數(shù)濃度關(guān)系圖

圖4硫酸化透明質(zhì)酸的細(xì)胞抑制作用圖

圖5硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯空白納米粒及其載藥納米粒的細(xì)胞抑制作用圖

具體實(shí)施方式

通過(guò)下面實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍，不局限于此。

實(shí)施例1透明質(zhì)酸四丁銨鹽的制備

透明質(zhì)酸鈉(MW5000，HA-Na，2.0g)溶于400mL雙蒸水中，室溫下磁力攪拌過(guò)夜；另稱取20gDowexWX8陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(四丁銨型)加入HA-Na中，室溫下磁力攪拌過(guò)夜，過(guò)濾，冷凍真空干燥，40℃下真空干燥，得透明質(zhì)酸四丁銨鹽(HA-TeBA)。

實(shí)施例2硫酸化透明質(zhì)酸(sHA)的制備

精密稱取實(shí)施例1中的HA-TeBA(MW5000，1000mg)溶于50mlN，N’-二甲基甲酰胺(DMF)中，50℃磁力攪拌2h使其溶解；另精密稱取1540mg的硫酸化劑三氧化硫DMF絡(luò)合物(SO₃·DMF)溶于50mLDMF中，室溫下攪拌至溶解后，加入HA-TeBA中，充氮?dú)獗Ｗo(hù)，冰浴后磁力攪拌1h；1M NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性，加入乙醇沉淀、離心，蒸餾水透析2d，冷凍真空干燥，得硫酸化透明質(zhì)酸(sHA)。IR圖譜確認(rèn)sHA結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)。元素分析法測(cè)定硫酸化程度，硫含量(S％)為4.392％。

實(shí)施例3硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯(sHA-OCD)的制備

精密稱取實(shí)施例2中的sHA(100mg)溶于5ml甲酰胺中，室溫磁力攪拌20min使其溶解，然后冰浴，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，95mg)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，58mg)，冰浴下反應(yīng)2h；另精密量取一定量2-辛基十二烷醇(OCD)溶于9mLDMF中，將其逐滴加入sHA溶液中，35℃磁力攪拌24h；反應(yīng)液加入乙醇沉淀、離心，沉淀用水溶解后蒸餾水透析2d，冷凍真空干燥得硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯(sHA-OCD)。¹H-NMR圖譜(見(jiàn)圖2)確認(rèn)sHA-OCD結(jié)構(gòu)，取代度約為10％。

實(shí)施例4sHA-ODA臨界膠束濃度的測(cè)定

精密稱取10mg sHA-ODA，分散于少量蒸餾水中，磁力攪拌24h，冰浴超聲30min(超聲功率195W，工作2s，間歇3s)，定容至10mL，得1mg/mL的空白膠束溶液；將1mg/mL的空白膠束溶液稀釋至sHA-OCD濃度(C)為1×10^-3、2.5×10^-3、5×10^-3、1×10^-2、2.5×10^-2、5×10^-2、1×10^-1、2.5×10^-1、5×10^-1mg/mL的系列膠束溶液，分別加入定量的芘(終濃度為5×10^-6mol/L)中，混合液超聲30min，40℃避光水浴過(guò)夜，利用熒光分光光度計(jì)測(cè)定芘的熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)為334nm，發(fā)射波長(zhǎng)I₁為371nm，I₃為382nm，狹縫寬度E_X為5nm，E_M為5nm。

以1gC(g/L)與芘在371nm和382nm出的熒光強(qiáng)度比值(I₃₇₁/I₃₈₂)作圖(見(jiàn)圖3)，曲線的拐點(diǎn)對(duì)應(yīng)的聚合物濃度即為該聚合物材料的臨界膠束濃度(CMC)。計(jì)算得sHA-OCD的CMC值為31.62μg/mL。由此表明sHA-OCD膠束的臨界膠束濃度比較小，說(shuō)明制備的載藥膠束具有較好的稀釋穩(wěn)定性。

實(shí)施例5sHA-OCD納米粒的制備

按2～8mg/mL的濃度稱取適量sHA-OCD溶于一定體積的蒸餾水中，經(jīng)超聲處理制備成粒徑為100～300nm的空白膠束納米粒溶液(sHA-OCD NPs)。

實(shí)施例6載藥sHA-OCD納米粒的制備

16mg sHA-OCD溶于蒸餾水制得濃度4mg/mL的空白膠束溶液，將2.0mg的多西紫杉醇(DTX)溶于400μL甲醇中，逐滴加入到上述空白膠束溶液中，冰浴超聲30min(超聲功率195W，工作2s，間歇3s)，置于蒸餾水中透析除去甲醇，透析液經(jīng)離心，過(guò)濾后，制得粒徑為100～300nm的載藥sHA-OCD膠束納米粒(DTX-sHA-OCD NPs)。表1是DTX-sHA-OCD納米粒及空白納米粒的一些性質(zhì)。

表1 載藥納米粒(DTX-sHA-OCD NPs)和空白納米粒(sHA-OCD NPs)的性質(zhì)

結(jié)果顯示，硫酸化透明質(zhì)酸2-辛基十二醇酯(sHA-OCD)這種兩親性材料，可在水中自發(fā)形成膠束，且納米粒粒徑小于250nm，藥物包封率高(＞80％)，對(duì)多西紫杉醇有明顯的增溶作用。

實(shí)施例7sHA和DTX-sHA-OCD NPs體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用

納米制劑組：DTX-sHA-OCD NPs，培養(yǎng)液稀釋至濃度為0.1μg/mL～80μg/mL。

原料藥組：多西紫杉醇溶液(DTX)，培養(yǎng)液稀釋至濃度為0.1μg/mL～80μg/mL。

空白納米粒組：sHA-ODA NPs，培養(yǎng)液稀釋至上述相同濃度。

硫酸化透明質(zhì)酸組：sHA，培養(yǎng)基稀釋至濃度為20～320μg/mL。

透明質(zhì)酸對(duì)照組：HA，培養(yǎng)基稀釋至濃度為20～320μg/mL。

取處于指數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使貼壁細(xì)胞脫落，計(jì)數(shù)制成細(xì)胞懸液；分別以6×10³～1×10⁴個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，置CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；按上述實(shí)驗(yàn)方案分別給予所需濃度的納米制劑組、原料藥組、空白納米粒溶液、sHA組、HA對(duì)照組，每一濃度平行6孔，繼續(xù)培養(yǎng)。48h后，向每孔加入10μLMTT液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4h后，向每孔加入150μLDMSO，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490nm處吸光度。處理數(shù)據(jù)，繪制圖表(見(jiàn)圖4、5)，計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC₅₀值(見(jiàn)表2)。

表2 體外對(duì)人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞增殖的抑制作用(IC₅₀值)

結(jié)果顯示，sHA以及sHA-OCD空白納米粒組對(duì)于RKO細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。DTX-sHA-OCD NPs制劑組的IC₅₀小于多烯紫杉醇原料藥，說(shuō)明載藥sHA-OCD NPs能使多西紫杉醇對(duì)RKO毒性明顯增強(qiáng)，可能是通過(guò)CD44受體介導(dǎo)的主動(dòng)靶向作用將藥物遞送至腫瘤細(xì)胞，提高抗腫瘤活性。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。