本發(fā)明涉及一種用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針及其制備方法。

背景技術(shù)：

銅是一種非常重要的過渡金屬元素。在生命體中對調(diào)節(jié)生理機(jī)制、維持生理平衡發(fā)揮了重要的作用；在自然界中，銅是人類最早使用的金屬之一，環(huán)境中常?？梢詸z測出Cu²⁺離子的存在。然而，過量存在的Cu²⁺對生物體和環(huán)境均有不利影響，比如，神經(jīng)退行性疾病就與人體中過量的Cu²⁺有關(guān)；而飲用水中如果Cu²⁺過量，則會引起人的胃腸功能紊亂，因此對Cu²⁺進(jìn)行檢測具有非常重要的意義。近年來，越來越多科研工作者開始了Cu²⁺熒光探針的研究工作。米小龍等人在《高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報》2016第37卷第10期的1784～1791頁報道了兩種羅丹明類衍生物Cu²⁺的熒光探針，日光下，Cu²⁺可以使這兩種羅丹明類衍生物由無色變?yōu)殚偕蚍奂t色；2015年，《高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報》2015年第36卷第2期第287～292頁報道了兩種新型水溶性氮茚衍生物Cu²⁺的熒光探針，研究發(fā)現(xiàn)Cu²⁺可以選擇性萃滅這兩種氮茚衍生物的熒光?！禦SC進(jìn)展》(RSC Advances)在2014年的4期的22613–22616頁公開的文章《一種基于吡啶類苯乙烯菁染料的對銅離子和鉛離子具有不同反應(yīng)的新型熒光探針》(A new fluorescent probe based on styrylcyanine dye containing pyridine:dissimilar fluorescent response to Cu²⁺and Pb²⁺和在46800–46805頁公開的文章《檢測活細(xì)胞中鎂離子和銅離子的熒光探針》(A fluorescent probe for the detection of Mg(II)and Cu(II)and its application for imaging in living cells)都是關(guān)于Cu²⁺識別的技術(shù)。這兩篇文章中，主體化合物除了可以識別Cu²⁺外，還分別對Pb²⁺和Mg²⁺具有識別性能。

根據(jù)目前文獻(xiàn)報道的對于Cu²⁺熒光探針的研究，主要存在以下兩個缺陷：

1.Cu²⁺對主體化合物的熒光只能進(jìn)行萃滅或增強的一次性的識別性能，而沒有可逆識別性能；

2.主體化合物除了能夠識別Cu²⁺外，還對其他金屬離子有識別性能，所以，易受其他金屬離子干擾，識別不具有專一性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是要解決現(xiàn)有的熒光分子探針對Cu²⁺的檢測可逆性差、易受其他金屬離子干擾的技術(shù)問題，而提供的主體化合物對Cu²⁺具有專一識別性能并實現(xiàn)可逆(off-on-off)熒光信號響應(yīng)檢測的一種用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針及其制備方法與應(yīng)用。

本發(fā)明的用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：

上述的用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、中間體化合物I的合成：

將菲醌、鄰硝基苯甲醛和乙酸銨按照1∶1.5∶2的摩爾比投入到反應(yīng)器中，再加入冰乙酸作為溶劑，升溫至90～110℃并攪拌6～10h后，反應(yīng)停止，冷卻至室溫，向反應(yīng)器中加入水，再用10％的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至8～10，抽濾，得到黃色固體；干燥后，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，再抽濾、干燥，得到中間體化合物I；

二、中間體化合物II的合成：

稱取中間體化合物I、雷尼鎳、乙醇、質(zhì)量百分濃度為80％的水合肼溶液；其中中間體化合物I的物質(zhì)的量與雷尼鎳的質(zhì)量的比為1mmol：(0.15～2)g；中間體化合物I的物質(zhì)的量與乙醇的體積的比為1mmol：(25～40)mL；中間體化合物I的物質(zhì)的量與質(zhì)量百分濃度為80％的水合肼溶液的體積的比為1mmol：3～4mL；將中間體化合物I和雷尼鎳加入到反應(yīng)器中，再加入乙醇作為溶劑，通入氮氣保護(hù)，在攪拌條件下，滴加質(zhì)量百分濃度為80％的水合肼溶液，滴加完畢后，升溫至65～85℃，反應(yīng)5～9h，冷卻至室溫，抽濾，用乙酸乙酯洗滌，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除濾液后，得到灰色固體，干燥后，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，再抽濾、干燥，得到中間體化合物II；

三、Cu²⁺熒光探針的合成：

按照1：(1～3)的摩爾比稱取中間體化合物II和水楊醛，加入到反應(yīng)器中，再向其中加入酸性介質(zhì)作為溶劑，攪拌反應(yīng)1～4h，反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，再用10％氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至8～10，析出固體；然后進(jìn)行抽濾，濾餅用水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，得到用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針。

步驟三中所述的酸性介質(zhì)進(jìn)一步優(yōu)選為質(zhì)量百分濃度為98％的濃硫酸、質(zhì)量百分濃度為65～68％的濃硝酸、冰乙酸或甲酸。

本發(fā)明的用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針的應(yīng)用是將該菲并咪唑可逆熒光探針用于Cu²⁺和/或Cr³⁺的相繼檢測或單獨檢測。

利用菲并咪唑可逆熒光探針檢測Cu²⁺的方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、將pH＝6.8～7.4、濃度為0.01mol/L的HEPES緩沖溶液與DMF按體積比為1：1混合均勻，得到溶劑；

二、將用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針用步驟一得到的溶液配制濃度為1.0×10^-5mol/L的溶液，得到主體溶液；

三、將待測溶液加入到主體溶液中，得到混合液；

四、在激發(fā)波長為360nm、激發(fā)狹縫寬度為10的條件下，檢測主體溶液和混合液的熒光發(fā)射光譜，如果混合液的熒光強度萃滅，則可判定待測溶液中含有Cu²⁺。

利用菲并咪唑可逆熒光探針檢測Cr³⁺的方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、將pH＝6.8～7.4、濃度為0.01mol/L的HEPES緩沖溶液與DMF按體積比為1：1混合均勻，得到溶劑；

二、將用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針用步驟一得到的溶液配制濃度為1.0×10^-5mol/L的溶液，得到主體溶液；

三、在主體溶液中分別加入濃度為0.10mol/L的Cu²⁺，充分混合后靜置5min，得到菲并咪唑熒光分子-Cu²⁺絡(luò)合物溶液；

四、將待測溶液加入到菲并咪唑熒光分子-Cu²⁺絡(luò)合物溶液中，得到混合液；

五、在激發(fā)波長為360nm、激發(fā)狹縫寬度為10的條件下，檢測主體溶液、菲并咪唑熒光分子-Cu²⁺絡(luò)合物溶液和混合液的熒光發(fā)射光譜，如果混合液相對于菲并咪唑熒光分子-Cu²⁺絡(luò)合物溶液的熒光強度增強，則可判定待測溶液中含有Cr³⁺。

本發(fā)明的合成過程可用下面的式子表示：

本發(fā)明的用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針是一種在水相體系中，pH為6.8～7.4的環(huán)境內(nèi)，具有高選擇性、高靈敏性的可逆菲并咪唑Cu²⁺熒光探針。該熒光探針能選擇性識別Cu²⁺，識別性能專一。利用菲并咪唑可逆熒光探針檢測Cu²⁺的過程中，菲并咪唑與Cu²⁺形成了絡(luò)合物，記為菲并咪唑熒光分子-Cu²⁺絡(luò)合物，該絡(luò)合物使菲并咪唑熒光分子的熒光強度萃滅，用來檢測Cu²⁺；菲并咪唑熒光分子-Cu²⁺絡(luò)合物繼續(xù)與Cr³⁺絡(luò)合后，熒光強度可在一定程度上恢復(fù)，用來對Cr³⁺進(jìn)行識別檢驗，完成該熒光分子探針的可逆(off-on-off)熒光信號響應(yīng)。

附圖說明

圖1是試驗1制備的用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針對不同金屬離子的紫外吸收光譜圖；

圖2是試驗1制備的用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針對不同金屬離子的熒光發(fā)射光譜圖；

圖3是試驗1制備的用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針在其他金屬離子存在的情況下，Cu²⁺熒光探針的熒光發(fā)射光譜圖；

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式的可逆菲并咪唑Cu²⁺熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：

具體實施方式二：制備具體實施方式一的所述的用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針的方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、中間體化合物I的合成：

將菲醌、鄰硝基苯甲醛和乙酸銨按照1∶1.5∶2的摩爾比投入到反應(yīng)器中，再加入冰乙酸作為溶劑，升溫至90～110℃并攪拌6～10h后，反應(yīng)停止，冷卻至室溫，向反應(yīng)器中加入水，再用10％的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至8～10，抽濾，得到黃色固體；干燥后，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，再抽濾、干燥，得到中間體化合物I；

二、中間體化合物II的合成：

稱取中間體化合物I、雷尼鎳、乙醇、質(zhì)量百分濃度為80％的水合肼溶液；其中中間體化合物I的物質(zhì)的量與雷尼鎳的質(zhì)量的比為1mmol：(0.15～2)g；中間體化合物I的物質(zhì)的量與乙醇的體積的比為1mmol：(25～40)mL；中間體化合物I的物質(zhì)的量與質(zhì)量百分濃度為80％的水合肼溶液的體積的比為1mmol：3～4mL；將中間體化合物I和雷尼鎳加入到反應(yīng)器中，再加入乙醇作為溶劑，通入氮氣保護(hù)，在攪拌條件下，滴加質(zhì)量百分濃度為80％的水合肼溶液，滴加完畢后，升溫至65～85℃，反應(yīng)5～9h，冷卻至室溫，抽濾，用乙酸乙酯洗滌，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除濾液后，得到灰色固體，干燥后，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，再抽濾、干燥，得到中間體化合物II；

三、Cu²⁺熒光探針的合成：

按照1：(1～3)的摩爾比稱取中間體化合物II和水楊醛，加入到反應(yīng)器中，再向其中加入酸性介質(zhì)作為溶劑，攪拌反應(yīng)1～4h，反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，再用10％氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至8～10，析出固體；然后進(jìn)行抽濾，濾餅用水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，得到用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式二不同的是步驟三中所述的酸性介質(zhì)為質(zhì)量百分濃度為98％的濃硫酸、質(zhì)量百分濃度為65～68％的濃硝酸、冰乙酸或甲酸。其它與具體實施方式二相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式二或三不同的是步驟一中的反應(yīng)溫度為95℃，反應(yīng)時間為8h。其它與具體實施方式二或三相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式二至四之一不同的是步驟一中的pH值至9。其它與具體實施方式二至四之一相同。

具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式二至五之一不同的是步驟二中反應(yīng)溫度為78℃，反應(yīng)時間為8h。其它與具體實施方式二至五之一相同。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式二至六之一不同的是步驟三中攪拌反應(yīng)2h。其它與具體實施方式二至六之一相同。

具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式二至七之一不同的是步驟三中pH值為9。其它與具體實施方式二至七之一相同。

具體實施方式九：本實施方式與具體實施方式二至八之一不同的是步驟三中中間體化合物II與水楊醛反應(yīng)物的摩爾比為1∶2.5。其它與具體實施方式二至八之一相同。

具體實施方式十：具體實施方式一所述的用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針的應(yīng)用是將該菲并咪唑可逆熒光探針用于Cu²⁺和/或Cr³⁺的相繼檢測或單獨檢測。

具體實施方式十一：利用菲并咪唑可逆熒光探針檢測Cu²⁺的方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、將pH＝6.8～7.4、濃度為0.01mol/L的HEPES緩沖溶液與DMF按體積比為1：1混合均勻，得到溶劑；

二、將用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針用步驟一得到的溶液配制濃度為1.0×10^-5mol/L的溶液，得到主體溶液；

三、將待測溶液加入到主體溶液中，得到混合液；

四、在激發(fā)波長為360nm、激發(fā)狹縫寬度為10的條件下，檢測主體溶液和混合液的熒光發(fā)射光譜，如果混合液的熒光強度萃滅，則可判定待測溶液中含有Cu²⁺。

具體實施方式十二：實施方式與具體實施方式十一不同的是步驟四中所述的熒光強度萃滅是指熒光強度降低50％以上。其它與具體實施方式十一相同。

具體實施方式十三：利用菲并咪唑可逆熒光探針檢測Cr³⁺的方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、將pH＝6.8～7.4、濃度為0.01mol/L的HEPES緩沖溶液與DMF按體積比為1：1混合均勻，得到溶劑；

二、將用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針用步驟一得到的溶液配制濃度為1.0×10^-5mol/L的溶液，得到主體溶液；

三、在主體溶液中分別加入濃度為0.10mol/L的Cu²⁺，充分混合后靜置5min，得到菲并咪唑熒光分子-Cu²⁺絡(luò)合物溶液；

四、將待測溶液加入到菲并咪唑熒光分子-Cu²⁺絡(luò)合物溶液中，得到混合液；

五、在激發(fā)波長為360nm、激發(fā)狹縫寬度為10的條件下，檢測主體溶液、菲并咪唑熒光分子-Cu²⁺絡(luò)合物溶液和混合液的熒光發(fā)射光譜，如果混合液相對于菲并咪唑熒光分子-Cu²⁺絡(luò)合物溶液的熒光強度增強，則可判定待測溶液中含有Cr³⁺。

具體實施方式十四：本實施方式與具體實施方式十三不同的是步驟五中所述的熒光強度增強是指熒光強度提高50％以上。其它與具體實施方式十三相同。

用以下實例驗證本發(fā)明的有益效果：

試驗1：本試驗的用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：

一、中間體化合物I的合成：

稱取菲醌5mmol、鄰硝基苯甲醛7.5mmol、乙酸銨10mmol加入到50mL的三口瓶中，并向其中加入30mL的冰乙酸作為溶劑，升溫至110℃，并不斷攪拌，在反應(yīng)過程中，用TLC跟蹤檢測(展開劑為乙酸乙酯和石油醚，V_{(乙酸乙酯)}：V_(石油醚)＝3∶7)，反應(yīng)進(jìn)行10h后，反應(yīng)基本完全，停止反應(yīng)，冷卻至室溫，在三口瓶內(nèi)加入50mL水，并置于200mL的燒杯中，用10％的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至9，抽濾，得到黃色固體，干燥；干燥后，再溶于25mL的乙酸乙酯中，加熱攪拌2h后，冷卻至室溫，有大量固體析出，抽濾、干燥，得到中間體化合物I；

本步驟得到的中間體化合物I的產(chǎn)率為92％，熔點：258～260℃。用紅外光譜、核磁氫譜和核磁碳譜表征該中間體化合物I，得到的結(jié)果如下：

IR(KBr,cm^–1)：3074,1616,1575,1537,1453,1364,781,754,734.¹H NMR(600MHz,DMSO)δ:14.33(s,H,OH)，9.28(s,H,NH)，8.90(d,J＝8.40Hz,2H,ArH)，8.53(d,J＝7.80Hz,2H,ArH),8.25(d,J＝8.40Hz,H,ArH),7.80(t,J＝7.20Hz,3H,ArH),7.71(t,J＝7.80Hz,2H,ArH),7.26(d,J＝9.0Hz,H,ArH).¹³C NMR(150MHz,DMSO)δ:149.4,132.8,131.3,130.4,128.0,127.5,125.7,125.3,124.6,124.4,122.4.

從表征結(jié)果知該中間體化合物I的結(jié)構(gòu)式為

二、中間體化合物II的合成：

在50mL的三口燒瓶中加入2.0mmol中間體化合物I、0.32g雷尼鎳和30mL的乙醇溶劑，在通入2min氮氣后，攪拌，并用恒壓滴液漏斗慢慢滴加7.5mL質(zhì)量百分濃度為80％的水合肼溶液，滴加完畢后，升溫至80℃回流反應(yīng)5h后，用TLC跟蹤檢測(展開劑為V_{(乙酸乙酯)}：V_(石油醚)＝3∶7)，反應(yīng)基本完全，冷卻至室溫后，抽濾，用乙酸乙酯洗滌五次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濾液，得到褐色固體并干燥。再用乙酸乙酯重結(jié)晶，加熱攪拌2.5h后，冷卻至室溫，有大量固體析出，抽濾、干燥，中間體化合物II。

本步驟得到的中間體化合物II的產(chǎn)率為85％，熔點：183～185℃；

用紅外光譜、核磁氫譜和核磁碳譜進(jìn)行表征，得到的結(jié)果如下：

IR(KBr,cm^–1)：3370,1616,1600,1543,1514,1487,1455,760,751,722,546.¹H NMR(600MHz,DMSO)δ:13.35(s,H,NH),8.85(d,J＝8.40Hz 2H,ArH),8.58(d,J＝8.40Hz,2H,ArH),7.72(t,J＝7.20Hz,2H,ArH),7.62(t,J＝7.20Hz,2H,ArH),7.57(s,H,ArH),7.45(d,J＝7.80Hz,H,ArH),7.23(t,J＝7.80Hz,H,ArH),6.69(d,J＝7.80Hz,H,ArH),5.33(s,2H,NH₂).¹³C NMR(150MHz,DMSO)δ:150.8,148.1,130.4,127.9,127.6,125.6,124.4,122.5,116.6,115.5,111.2.

從表征結(jié)果知該中間體化合物II的結(jié)構(gòu)式為

三、Cu²⁺熒光探針的合成：

依次向三口瓶中加入0.62g(2.0mmol)中間體化合物II、0.24g(2.0mmol)水楊醛，再將20mL的冰乙酸加入三口瓶中作為溶劑，常溫攪拌反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，再置于200mL的燒杯中，用10％氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至10，然后進(jìn)行抽濾，濾餅水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，收集固體，干燥后，得到用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針。本步驟中，該用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針的產(chǎn)率為80％。

本試驗的用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針的熔點為289～291℃。熔程為2℃，說明純度較高，質(zhì)量百分純度大于95％。

用紅外光譜及核磁共振譜進(jìn)行表征，得到的結(jié)果如下：

IR(KBr,cm^–1)：3055,2937,3058,1613,1592,1486,1460,748,720.¹H NMR(600MHz,DMSO)δ:10.50(s,H,OH),8.89(d,J＝7.20Hz,H,ArH),8.83(d,J＝7.80Hz,H,ArH),8.69(d,J＝7.80Hz,H,ArH),8.08(d,J＝7.20Hz,2H,ArH),7.92(s,H,NH),7.77(t,J＝7.20Hz,H,ArH),7.66(t,J＝7.20Hz,H,ArH),7.56(s,2H,ArH),7.22(s,H,CH),7.18(t,J＝7.20Hz,H,ArH),7.04(t,J＝7.20Hz,H,ArH),6.98(d,J＝8.40Hz,H,ArH),6.91(d,J＝7.80Hz,H,ArH),6.85(t,J＝7.20Hz,H,ArH),6.43(d,J＝6.20Hz,H,ArH).¹³C NMR(150MHz,DMSO)δ:153.9,146.5,141.8,138.5,131.3,130.2,128.5,128.1,127.8,127.5,127.0,126.7,126.2,125.6,125.4,124.9,124.5,124.4,124.1,122.9,122.6,121.2,119.7,118.9,116.3,115.8,113.5,64.8.

從以上的表征結(jié)果可知，用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：

將本試驗制備的用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針進(jìn)行光譜性能測試，步驟如下：

一、儲備液的配置

將用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針以N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑配制成濃度為1.0×10^–4mol/L的主體化合物溶液，備用；

陽離子儲備液的配制：用金屬氯化鹽和硝酸鹽配制成濃度為0.10mol/L的陽離子溶液，備用；

HEPES緩沖溶液：秤取0.60g的N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸加入250mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，配成0.01mol/L的溶液并搖勻，靜止2h后，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值，配成pH值為7.4緩沖溶液。搖勻，備用。

二、光譜性能測試

先考察用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針對金屬離子的選擇性識別。向10.0mL的容量瓶中加入濃度為1.0×10^–4mol/L的主體化合物溶液1.0mL，再分別加入濃度為0.10mol/L的K⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Al³⁺和Hg²⁺金屬離子溶液，用體積比是1∶1的DMF/HEPES的混合溶液(其中，HEPES緩沖溶液的濃度為0.01mol/L，pH＝7.4)定容，此時，主體化合物與金屬離子的摩爾濃度比為1∶10，恒溫2h后，分別測定紫外吸收光譜，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可知，加入不同金屬離子后，K⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Ag⁺、Al³⁺和Fe³⁺與主體的紫外吸收光譜曲線形狀類似。而加入Cu²⁺后，在紫外吸收波譜中，波長為420nm處，明顯有一個新的紫外吸收峰出現(xiàn)。因此，從紫外吸收光譜圖中可以初步推測，主體化合物(PA)對Cu²⁺具有選擇識別特性。

為了進(jìn)一步驗證本試驗制備的用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針對Cu²⁺具有選擇性識別的特性，以體積比是1∶1的DMF/HEPES的混合溶液(其中，HEPES緩沖溶液的濃度為0.01mol/L，pH＝7.4)為溶劑，配制濃度為1.0×10^-5mol/L的主體溶液，在主體溶液中分別加入濃度為0.10mol/L的K⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Al³⁺和Fe³⁺金屬離子溶液。并在激發(fā)波長為360nm，激發(fā)狹縫寬度為10的情況下，對其進(jìn)行熒光發(fā)射光譜的測試，得到的熒光發(fā)射光譜強度，結(jié)果如圖2所示。從圖2中可知，主體化合物的熒光發(fā)射波長為420nm，熒光強度為780a.u左右.。加入不同金屬離子后，K⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Ag⁺、Al³⁺和Fe³⁺與對主體的熒光強度影響不大，強度均在770a.u.左右。而加入Cu²⁺時，熒光強度明顯萃滅至100a.u.左右，萃滅程度為主體熒光強度的7倍。因此，從熒光發(fā)射光譜可以確定，主體化合物對Cu²⁺具有選擇識別特性。

再考察熒光分子-Cu²⁺絡(luò)合物對Cr³⁺具有選擇性識別特性，選用的溶劑為體積比是1∶1的DMF/HEPES的混合溶液(其中，HEPES緩沖溶液的濃度為0.01mol/L，pH＝7.4)為溶劑，配制濃度為1.0×10^-5mol/L的主體溶液。在主體溶液中分別加入濃度為0.10mol/L的Cu²⁺，充分混合后靜置5min。再分別加入0.10mol/L的K⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Ag⁺、Al³⁺和Fe³溶液，混合均勻。隨后對其進(jìn)行熒光發(fā)射光譜的測試。測試結(jié)果如圖3所示，其他金屬離子(K⁺、Ba²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Ag⁺、Al³⁺和Fe³)的加入對該熒光探針識別Cu²⁺幾乎無影響，但加入Cr³⁺后熒光強度從100a.u.增強至710a.u.左右，說明熒光分子-Cu²⁺絡(luò)合物對Cr³⁺具有選擇性識別作用，完成該熒光分子探針的可逆(off-on-off)熒光信號響應(yīng)。這個結(jié)果在主體化合物的實際應(yīng)用中具有重要的意義。

本試驗制備的用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針，通過以上試驗說明在以體積比是1∶1的DMF/H₂O的混合溶液(HEPES緩沖溶液的濃度為0.01mol/L，pH＝7.4)為溶劑的體系中，該主體化合物對Cu²⁺有選擇性識別的作用，而對其他金屬離子無識別特性，且該熒光分子-Cu²⁺絡(luò)合物還可以對Cr³⁺進(jìn)行選擇性識別。

試驗2：本試驗與試驗1不同的是試驗1的步驟三用以下的操作代替：依次向三口瓶中加入中間體化合物II 0.62g(2.0mmol)、水楊醛0.31g(2.5mmol)和30mL的98％的濃硫酸作為溶劑，常溫攪拌反應(yīng)3.5h，反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，并置于200mL的燒杯中，用10％氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至10，然后進(jìn)行抽濾，濾餅水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，收集固體，干燥后得到可逆菲并咪唑Cu²⁺熒光探針。本試驗得到的用于Cu²⁺檢測的菲并咪唑可逆熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：

產(chǎn)率為65％。

試驗3：本試驗與試驗1不同的是試驗1的步驟三用以下的操作代替：依次向三口瓶中加入中間體化合物II 0.62g(2.0mmol)、水楊醛0.34g(2.8mmol)，和28mL的甲酸作為溶劑，常溫攪拌反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，并置于200mL的燒杯中，用10％氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至9，然后進(jìn)行抽濾，濾餅水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，收集固體，干燥后得到可逆菲并咪唑Cu²⁺熒光探針。本試驗得到的可逆菲并咪唑Cu²⁺熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：

產(chǎn)率為63％。

試驗4：本試驗與試驗1不同的是試驗1的步驟三用以下的操作代替：依次向三口瓶中加入中間體化合物II 0.62g(2.0mmol)、水楊醛0.37g(3.0mmol)，和20mL的65％的濃硝酸作為溶劑，常溫攪拌反應(yīng)4h，反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入水淬滅反應(yīng)，并置于200mL的燒杯中，用10％氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至10，然后進(jìn)行抽濾，濾餅水洗至中性，干燥，再用乙酸乙酯重結(jié)晶，收集固體，干燥后得到可逆菲并咪唑Cu²⁺熒光探針。本試驗得到的可逆菲并咪唑Cu²⁺熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：

產(chǎn)率為75％。