本發(fā)明屬于納米技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種形貌和粒徑可控型淀粉納米顆粒的制備方法。

背景技術(shù)：

淀粉納米顆粒是一種粒徑小于300nm的淀粉顆粒，目前淀粉納米顆粒的制備主要采用化學(xué)法和物理法，以酸解法最為常見，主要是利用H₂SO₄或者HCl水解淀粉顆粒的無定形區(qū)，獲得淀粉納米晶。淀粉納米顆粒還可以通過反溶劑、高壓均質(zhì)、交聯(lián)微乳化等方法制備，但上述方法產(chǎn)率低，耗能大，成本較高。通過生物酶脫枝處理得到短直鏈淀粉，經(jīng)自組裝制備淀粉納米顆粒，得率高、能耗小，且綠色安全。但該方法制備的納米顆粒粒徑分布較廣，因此納米顆粒之間裝載的活性物質(zhì)的量差異較大，不利于對活性物質(zhì)的精確定量；且形貌多為球形，較為單一，在一些領(lǐng)域的應(yīng)用受限，限制了其運載的活性物質(zhì)的生物利用率。據(jù)文獻報道，空心的納米顆粒對活性物質(zhì)的包埋率要顯著高于實心的納米顆粒，而棒狀的納米顆粒能夠隨血管方向流動，提高其作為壁材運載的活性物質(zhì)的生物利用率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有方法制備的納米顆粒粒徑分布廣、粒徑及形貌不可控的問題，本發(fā)明旨在提供一種形貌和粒徑可控型淀粉納米顆粒的制備方法。

一種形貌和粒徑可控型淀粉納米顆粒的制備方法，其制備步驟為：

(1)配制緩沖溶液：配制pH＝4-6的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液；

(2)普魯藍酶預(yù)處理：用蒸餾水將普魯藍酶稀釋至120-150NPUN/mL，降低普魯藍酶的稠度，利于其在糊化淀粉中均勻分散；

(3)制備淀粉乳：用磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液配制質(zhì)量體積濃度10-20％的淀粉乳液；

(4)糊化：將配制的淀粉乳在100℃水浴20-60min，使淀粉完全糊化，隨后降溫至55-65℃；

(5)酶解：向糊化后的膠質(zhì)淀粉溶液中加入預(yù)處理好的普魯藍酶液，酶液與淀粉干基的比例為0.1mL/g，55-65℃酶解6-8h；

(6)低速離心：將得到的酶解液趁熱以2500-3500r/min的轉(zhuǎn)速離心3-5min，以去除長直鏈淀粉；

(7)滅酶：繼續(xù)加熱，使溫度升高至90℃以上，并保持10-15min，使酶徹底失活，2500-3500r/min下離心2-5min，脫去變性的酶，制得短直鏈淀粉，水洗、真空冷凍干燥得到短直鏈淀粉干粉；

(8)原位添加多糖模板：將短直鏈淀粉用磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液制備成質(zhì)量體積比5-15％的溶液，并向溶液中添加天然多糖，短直鏈淀粉與天然多糖的質(zhì)量比為4-10:1；

(9)自組裝制備淀粉納米顆粒：將添加天然多糖的短直鏈淀粉溶液置于0-8℃下回生處理10-15h獲得淀粉納米顆粒懸液，水洗、真空冷凍干燥得到淀粉納米顆粒。

進一步地，所述天然多糖為殼聚糖、瓜爾膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、松香膠中的任一種。

進一步地，步驟(9)中回生處理過程進行攪拌，攪拌的轉(zhuǎn)速為200-300r/min。

進一步地，步驟(3)中配制淀粉乳所用是支鏈淀粉含量高的淀粉，包括蠟質(zhì)玉米淀粉、芋頭淀粉、大米淀粉、黃米淀粉中的一種或幾種。

進一步地，步驟(7)、(9)中水洗的具體操作為：5000-7000r/min離心5-15min，水洗4-5次.

進一步地，步驟(7)、(9)中真空冷凍干燥的溫度為-90--80℃，壓力為0-1Pa，時間為48-72h。

本發(fā)明方法具有以下優(yōu)勢：

本發(fā)明采用的天然多糖綠色、安全，生物相容性好，且具有線性、樹枝狀等不同分子結(jié)構(gòu)，將天然多糖作為模板原位添加到短直鏈淀粉溶液中，短直鏈淀粉將在不同結(jié)構(gòu)的多糖分子鏈表面堆疊，形成特定的納米結(jié)構(gòu)，然后經(jīng)過進一步聚集、組裝，能夠有效的控制淀粉納米顆粒的形貌(空心、紡錘體、球體)和粒徑(20-120nm)。空心的納米顆粒，其內(nèi)部空腔能夠完全填充活性物質(zhì)，對活性物質(zhì)的裝載率高。球體的納米顆粒，其比表面積最大，顆粒越小，越有利于吸附一些小分子，可固定酶分子，提高酶的作用活性。紡錘體的納米顆粒，其具有細長的納米結(jié)構(gòu)，有利于其在光電化學(xué)領(lǐng)域以及作為材料增強劑方面的應(yīng)用。

本發(fā)明原位添加的方法不同于現(xiàn)有技術(shù)中后包裹的方法，后包裹是在制備成納米顆粒之后，再在外面涂層一層多糖。本發(fā)明中添加的天然多糖起到乳化劑的作用，通過原位添加，在納米顆粒形成之前可以作為模板，也就是多糖分子鏈作為模板，從而形成形貌不同、粒徑較小的納米顆粒結(jié)構(gòu)。形成納米顆粒之后，多余的多糖還可以包裹在外面形成涂層。

本發(fā)明設(shè)備要求低，工藝簡單，操作簡便，反應(yīng)溫和，反應(yīng)時間短，效率高，適合大規(guī)模生產(chǎn)。

本發(fā)明制備成本低，能源消耗少，沒有有害廢棄物產(chǎn)生，符合“綠色生產(chǎn)，環(huán)保節(jié)能”的現(xiàn)代化生產(chǎn)要求。

附圖說明

圖1未添加多糖(A)、原位添加殼聚糖(B)、瓜爾膠(C)、阿拉伯膠(D)、海藻酸鈉(E)和松香膠(F)制備的淀粉納米顆粒透射電鏡圖；

圖2未添加多糖(A)、原位添加殼聚糖(B)、瓜爾膠(C)、阿拉伯膠(D)、海藻酸鈉(E)和松香膠(F)制備的淀粉納米顆粒粒徑分布圖；

圖3未添加多糖、原位添加殼聚糖、瓜爾膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉和松香膠制備的淀粉納米顆粒的X-衍射圖。

圖4未添加多糖(◇)、原位添加殼聚糖(□)、瓜爾膠(△)、阿拉伯膠(×)、海藻酸鈉(*)和松香膠(○)制備的淀粉納米顆粒在不同pH處理下的粒徑；

圖5未添加多糖(◇)、原位添加殼聚糖(□)、瓜爾膠(△)、阿拉伯膠(×)、海藻酸鈉(*)和松香膠(○)制備的淀粉納米顆粒在不同溫度處理下的粒徑；

圖6未添加多糖(◇)、原位添加殼聚糖(□)、瓜爾膠(△)、阿拉伯膠(×)、海藻酸鈉(*)和松香膠(○)制備的淀粉納米顆粒在不同鹽離子濃度處理下的粒徑；

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實施例中所用材料、試劑及儀器、設(shè)備如下：

實施例1

按照以下步驟分別制備不同形貌和粒徑的淀粉納米顆粒：

(1)配制緩沖溶液：準確稱取3.27g磷酸氫二鈉和2.24g檸檬酸溶于200mL蒸餾水中，攪拌使其充分溶解，待用；

(2)普魯藍酶預(yù)處理：準確量取1mL濃度為1350NPUN/mL的普魯藍酶滴入10mL蒸餾水中，攪拌使之充分混合，待用；

(3)制備淀粉乳：稱取15g蠟質(zhì)玉米淀粉加入100mL緩沖溶液中，制得質(zhì)量體積比15％的淀粉乳液；

(4)糊化：將配制的淀粉乳在100℃水浴20min，使淀粉完全糊化，隨后降溫至58℃；

(5)酶解：向糊化后的膠質(zhì)淀粉溶液中加入處理好的普魯藍酶1.5mL，58℃酶解6h；

(6)低速離心：將得到的溶液趁熱以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心3min，以去除長直鏈淀粉；

(7)滅酶：繼續(xù)加熱，使溫度升高至100℃，保持10min，使酶徹底失去活性，3000r/min下離心3min，脫去變性的酶，制得短直鏈淀粉，6000r/min離心水洗4次(10min/次)，將沉淀部分在-86℃真空冷凍干燥得到短直鏈淀粉干粉；

(8)原位添加多糖模板：將短直鏈淀粉用磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液制備成質(zhì)量體積比10％的溶液，分成6份，分別向5份短直鏈淀粉溶液中添加殼聚糖、瓜爾膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉和松香膠，短直鏈淀粉與殼聚糖、瓜爾膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉和松香膠與阿拉伯膠的質(zhì)量比均為10:1，剩余1份短直鏈淀粉溶液中未添加多糖，作為對照。

(9)自組裝制備淀粉納米顆粒：將添加天然多糖的短直鏈淀粉溶液置于4℃下攪拌回生處理12h獲得淀粉納米顆粒懸液。6000r/min離心水洗5次(10min/次)，將沉淀部分在-86℃真空冷凍干燥48h得到淀粉納米顆粒。

對上述制備得到的6種淀粉納米顆粒進行以下性能檢測：

①納米顆粒形貌及粒徑檢測

納米顆粒透射電鏡測定：將納米顆粒溶于超純水中，使其充分分散均勻后，滴于帶有碳支持膜的銅網(wǎng)上，并將多余的溶液用濾紙吸走，再對銅網(wǎng)普通干燥，將干燥后的樣品放入透射電子顯微鏡系統(tǒng)中，抽真空5min，在2kv加速電壓下觀察，拍照。

動態(tài)光散射測定納米顆粒粒徑的大?。簩⒓{米顆粒溶于超純水中，使其充分分散均勻后，用移液槍取1mL懸液，沿比色皿邊緣一角緩緩注入后，放入測試臺中測試，每個樣品分別測試三次，取平均值。

如圖1A、2A所示，未添加多糖制備的淀粉納米顆粒呈球形，粒徑主要分布在70-90nm之間。

如圖1B、2B所示，原位添加殼聚糖制備的淀粉納米顆粒呈球形，非常小，粒徑在20-50nm之間，并且大部分殼聚糖納米顆粒呈均勻的核殼結(jié)構(gòu)，內(nèi)部存在一定的空腔，有利于活性物質(zhì)的包埋。

如圖1C、2C所示，原位添加瓜爾膠制備的淀粉納米顆粒呈不規(guī)則的球狀顆粒，聚集現(xiàn)象明顯，粒徑在90-150nm之間。

如圖1D、2D所示，原位添加阿拉伯膠制備的淀粉納米顆粒呈均勻的核殼結(jié)構(gòu)，其中部分是空心的，粒徑主要分布在40-70nm之間。

如圖1E、2E所示，原位添加海藻酸鈉制備的淀粉納米顆粒呈均勻分散的紡錘形，長度主要分布在120-170nm之間，直徑主要分布在40-70nm之間。

如圖1F、2F所示，原位添加松香膠制備的淀粉納米顆粒呈不規(guī)則的球形，并且納米顆粒表面有許多小顆粒聚集。粒徑很小，在30-50nm之間。

②熱特性測定

稱取9±1mg淀粉納米顆粒樣品，與蒸餾水通過質(zhì)量比為1：2的比例混合均勻，將混合均勻的樣品放在在鋁坩堝中平衡30min，然后以10℃/min的速率進行升溫，溫度范圍為25～120℃，分別測定其T_o(起始糊化溫度)、T_p(峰值糊化溫度)、T_c(末值糊化溫度)及焓值(△H)的變化情況。

如表1所示，原位添加天然多糖顯著提高了淀粉納米顆粒的峰值糊化溫度，而其末值糊化溫度和起始糊化溫度的差值減小，這說明添加天然多糖制備的淀粉納米顆粒結(jié)晶更完善，結(jié)晶大小更加均勻。原位添加海藻酸鈉制備的納米顆粒具有最高的峰值糊化溫度，熱穩(wěn)定性最好。

表1天然多糖為模板制備的淀粉納米顆粒的熱特性

③X-射線衍射測定

將淀粉納米顆粒樣品干燥磨碎后，平衡水分至20％，采用X-衍射專用窗片制片。X-射線管為銅-鈷放，波長范圍為1.54nm；管壓40kV，管流40mA，掃描區(qū)域為衍射角為3°～60°；衍射速度為0.02°衍射角/3s。通過軟件MDI Jade 5.0計算結(jié)晶度。

如圖3所示的淀粉納米顆粒的X-衍射圖譜，所有的納米顆粒樣品在2θ為5.6°、15.3°、17.1°、22.5°和24.3°有衍射峰，說明淀粉納米顆粒的晶形為B型。原位添加天然多糖制備的淀粉納米顆粒在2θ為5.6°、15.3°、17.1°處的衍射峰強度顯著增強。原位添加天然多糖制備的淀粉納米顆粒的結(jié)晶度升高，主要是由于短直鏈淀粉分子之間的相互作用力增強，而當(dāng)天然多糖作為模板時，短直鏈淀粉分子在模板表面定向排列，有序性增強導(dǎo)致的。并且原位添加松香膠制備的淀粉納米顆粒的結(jié)晶度明顯高于其他幾種納米顆粒樣品，這說明松香膠是一種良好的模板，可以控制晶核和淀粉分子的定向排列，增加其排列有序性。有序性的增加有利于形成更為緊實的納米結(jié)構(gòu)外殼，作為納米載體應(yīng)用之后，可以更為有效地保護活性物質(zhì)免受破壞，同時減緩活性物質(zhì)的釋放，達到緩釋，提高藥物利用率的效果。

④納米顆粒酸堿穩(wěn)定性分析

將蒸餾水分別用0.05M的HCl和NaOH調(diào)制成不同pH(pH＝3、4、5、6、7、8、9、10)的水溶液，然后再加入淀粉納米顆粒制成質(zhì)量體積比0.1％的懸液，超聲分散，靜置半小時，搖勻后測量粒徑大小。

如圖4所示，以天然多糖為模板制備的淀粉納米顆粒的酸堿穩(wěn)定性得到明顯提高，尤其是松香膠和殼聚糖為模板制備的淀粉納米顆粒在pH值為3-10的范圍內(nèi)均能保持較為穩(wěn)定的粒徑。

⑤納米顆粒熱穩(wěn)定性分析

用pH為7的蒸餾水將淀粉納米顆粒制成質(zhì)量體積比0.1％的懸液，超聲分散，置于不同溫度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)的水浴中靜置半小時后測量粒徑大小。

如圖5所示，以天然多糖為模板制備的淀粉納米顆粒的熱特性得到明顯提高，使得納米顆粒在80℃下，仍能夠保持較高的穩(wěn)定性。

⑥納米顆粒鹽離子穩(wěn)定性分析

分別用不同濃度(100mM、200mM、300mM、400mM、500mM)的NaCl溶液配制質(zhì)量體積比0.1％的淀粉納米顆粒懸液，超聲分散，靜置半小時，搖勻后測量粒徑大小。

如圖6所示，以天然多糖為模板制備的淀粉納米顆粒對鹽離子的穩(wěn)定性得到明顯提高，尤其是松香膠在鹽離子濃度高達500mM時，仍能保持較高的穩(wěn)定性。

實施例2

(1)配制緩沖溶液：準確稱取1.635g磷酸氫二鈉和1.12g檸檬酸溶于100mL蒸餾水中，攪拌使其充分溶解，待用；

(2)普魯藍酶預(yù)處理：準確量取1mL濃度為1350NPUN/mL的普魯藍酶滴入9mL蒸餾水中，攪拌使之充分混合，待用；

(3)制備淀粉乳：稱取10g蠟質(zhì)玉米淀粉加入100mL緩沖溶液中，制得質(zhì)量體積比15％的淀粉乳液；

(4)糊化：將配制的淀粉乳在100℃水浴40min，使淀粉完全糊化，隨后降溫至55℃；

(5)酶解：向糊化后的膠質(zhì)淀粉溶液中加入處理好的普魯藍酶1mL，55℃酶解6h；

(6)低速離心：將得到的溶液趁熱以2500r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，以去除長直鏈淀粉；

(7)滅酶：繼續(xù)加熱，使溫度升高至95℃，保持15min，使酶徹底失去活性，2500r/min下離心5min，脫去變性的酶，制得短直鏈淀粉，5000r/min離心水洗4次(15min/次)，將沉淀部分在-80℃真空冷凍干燥得到短直鏈淀粉干粉；

(8)原位添加多糖模板：將短直鏈淀粉用磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液制備成質(zhì)量體積比10％的溶液，并向短直鏈淀粉溶液中添加松香膠，短直鏈淀粉與松香膠的質(zhì)量比為6:1。

(9)自組裝制備淀粉納米顆粒：將添加松香膠的短直鏈淀粉溶液置于0℃下攪拌回生處理10h獲得淀粉納米顆粒懸液。5000r/min離心水洗4次(15min/次)，將沉淀部分在-80℃真空冷凍干燥60h得到淀粉納米顆粒。

對上述淀粉納米顆粒進行形貌和粒徑的檢測，結(jié)果顯示其呈球形，粒徑大小為20-40nm。

實施例3

(1)配制緩沖溶液：準確稱取6.54g磷酸氫二鈉和4.48g檸檬酸溶于400mL蒸餾水中，攪拌使其充分溶解，待用；

(2)普魯藍酶預(yù)處理：準確量取1mL濃度為1350NPUN/mL的普魯藍酶滴入8mL蒸餾水中，攪拌使之充分混合，待用；

(3)制備淀粉乳：稱取20g蠟質(zhì)玉米淀粉加入100mL緩沖溶液中，制得質(zhì)量體積比20％的淀粉乳液；

(4)糊化：將配制的淀粉乳在100℃水浴50min，使淀粉完全糊化，隨后降溫至60℃；

(5)酶解：向糊化后的膠質(zhì)淀粉溶液中加入處理好的普魯藍酶2mL，60℃酶解6h；

(6)低速離心：將得到的溶液趁熱以3500r/min的轉(zhuǎn)速離心3min，以去除長直鏈淀粉；

(7)滅酶：繼續(xù)加熱，使溫度升高至100℃，保持10min，使酶徹底失去活性，3500r/min下離心3min，脫去變性的酶，制得短直鏈淀粉，7000r/min離心水洗5次(5min/次)，將沉淀部分在-90℃真空冷凍干燥得到短直鏈淀粉干粉；

(8)原位添加多糖模板：將短直鏈淀粉用磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液制備成質(zhì)量體積比5％的溶液，并向短直鏈淀粉溶液中添加海藻酸鈉，短直鏈淀粉與海藻酸鈉的質(zhì)量比為9:1。

(9)自組裝制備淀粉納米顆粒：將添加海藻酸鈉的短直鏈淀粉溶液置于8℃下攪拌回生處理15h獲得淀粉納米顆粒懸液。7000r/min離心水洗5次(5min/次)，將沉淀部分在-90℃真空冷凍干燥72h得到淀粉納米顆粒。

對上述淀粉納米顆粒進行形貌和粒徑的檢測，結(jié)果顯示其呈紡錘形，長度主要分布在90-120nm之間，直徑主要分布在30-50nm之間。

應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。