本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種類肽，尤其涉及一種類肽及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種能夠檢測血清中β-淀粉樣蛋白含量的類肽及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默癥(Alzheimer’s Disease,AD)是一種由淀粉樣多肽的錯誤折疊和異常聚積造成的以進行性記憶力減退和認(rèn)知功能障礙為發(fā)病癥狀的老年期高發(fā)病率的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。根據(jù)國際阿爾茨海默病協(xié)會(Alzheimer’s Disease International,ADI)2015年發(fā)布的《2015年全球阿爾茨海默癥報告》顯示，估計目前全球共有約4680萬失智患者。這一數(shù)量將以每20年遞增一倍的速度逐漸增加，預(yù)計到2030年將達到7470萬，到2050年達1億3150萬人。這一估計比世界阿爾茨海默病2009年報告中增加了12％-13％。國際阿爾茨海默癥聯(lián)合會稱在中國，有900萬人患有癡呆癥。但這一數(shù)字可能人為偏低，因為農(nóng)村地區(qū)很多患者從未得到診斷。國際阿爾茨海默癥聯(lián)合會估計，到2050年，中國的患者數(shù)量估計將達到3000萬。我國作為全球人口第一大國，目前老齡化的社會現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，而且65歲以上的老人患阿爾茨海默癥病率為6.6％，在85歲以上的老人中發(fā)病率高達30％以上。因此阿爾茨海默癥成為我們必須要面對的重大社會問題。

AD的發(fā)病機制復(fù)雜，至今未有定論，目前人們提出幾種假說，如膽堿能神經(jīng)異常學(xué)說、淀粉樣蛋白級聯(lián)學(xué)說、自由基與凋亡學(xué)說、tau蛋白異常修飾學(xué)說、線粒體代謝障礙學(xué)說、興奮性氨基酸毒性學(xué)說及基因突變學(xué)說等。在眾多AD的致病機理假說中，淀粉樣蛋白級聯(lián)假說被越來越多的研究所證實。淀粉樣蛋白級聯(lián)假說認(rèn)為腦內(nèi)淀粉樣蛋白前體(amyloid protein precursor,APP)的異常代謝使得Aβ的產(chǎn)量增多、降解減少，引起Aβ的大量聚集，形成寡聚體、原纖維和纖維等聚集體，進而形成淀粉樣斑塊，即老年斑。Aβ雖然不是唯一的致病原因，但是Aβ在阿爾茲海默病的發(fā)展中起著核心的作用，要認(rèn)為大腦內(nèi)過量的β-淀粉樣蛋白及其聚集形成的聚集物是誘發(fā)AD的核心因素。并且Aβ會在大腦和血液間流通，因此血清中Aβ的含量可以作為檢測AD的標(biāo)志物。

目前，由于AD病因未明，診斷首先要根據(jù)臨床表現(xiàn)作出癡呆的診斷，然后對病史、病程的特點、體格檢查及神經(jīng)系統(tǒng)檢查、心理測試與輔助檢查的資料綜合分析，排除其他原因引起的癡呆，才能診斷為AD。最常用的有簡易智能狀態(tài)檢查，是一個非常簡單的測試工具。此外，阿爾茲海默病評定量表亦是國際通用的測試工具。這些檢測需要醫(yī)生具有豐富的經(jīng)驗和知識。還有一些其他的檢測手段，比如影像學(xué)檢查可見腦萎縮像，如側(cè)腦室、三腦室增大；PET、SPECT、MRI可見頂葉低代謝區(qū)；腦電圖檢查早期α節(jié)律喪失及電位降低，常見彌散性慢波，且腦電圖減慢的程度和癡呆嚴(yán)重程度相關(guān)；腦脊液檢測tau蛋白、β淀粉樣蛋白的提高等，這些方法都具有一些局限性。

如CN 106018827 A公開一種阿爾茨海默癥檢測標(biāo)志物及其檢測方法，所述提供的一組血清差異蛋白可用于阿爾茨海默癥檢測，但目前的方法缺乏準(zhǔn)確性和特異性，并且需要病人出現(xiàn)一定的病理特征才能夠檢測到。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種類肽及其制備方法和應(yīng)用，可以更簡便、更靈敏、更低成本、無創(chuàng)傷的方法檢測血液中β淀粉樣蛋白含量來診斷和監(jiān)控AD(阿爾茨海默癥)，能夠有效地通過血清中的Aβ來對病人和正常人血清進行區(qū)分。

為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種類肽，其特征在于，所述類肽包括乙二胺(Ⅰ)、4-苯基芐胺(Ⅱ)、β-苯乙胺(Ⅲ)、四亞甲基二胺(Ⅳ)、3,4-亞甲二氧基芐胺(Ⅴ)、異丁胺(Ⅵ)、R(+)-α-甲基芐胺(Ⅶ)、甘氨酸(Ⅷ)和3-氨基丙酸(Ⅸ)亞單位。

類肽(peptoid)是以N-取代甘氨酸為單元，與多肽結(jié)構(gòu)相似的非天然折疊體。它可以折疊成高生物活性和高特異性的功能單元，且其組成單元比多肽更豐富，并能夠耐受蛋白酶，因此，類肽化合物具有良好的生物活性和化學(xué)性質(zhì)。

所述各亞單位的分子式如下所示：

根據(jù)本發(fā)明，所述類肽包含的亞單位的順序為(Ⅰ-Ⅱ-Ⅰ-Ⅲ)_n-Ⅰ-Ⅱ-Ⅳ-Ⅴ-Ⅵ-Ⅳ-Ⅳ-Ⅶ-Ⅳ-Ⅷ-Ⅸ-Ⅲ-(Ⅸ-Ⅱ-Ⅸ-Ⅳ)_n，其中，所述n為3-7的正整數(shù)。

所述n例如可以是3、4、5、6或7，以及上述數(shù)值之間的具體點值，限于篇幅及出于簡明的考慮，本發(fā)明不再窮盡列舉所述范圍包括的具體點值。

本發(fā)明中，所設(shè)計合成的類肽是中間嵌有能特異性識別β淀粉樣蛋白的類肽嵌段的兩親性類肽，該兩親性類肽在氣-液界面上自組裝形成表面帶有特異性識別β淀粉樣蛋白的類肽環(huán)的類肽納米片層。特異性識別β淀粉樣蛋白的類肽環(huán)作為分子識別探針，可結(jié)合阿爾茲海默癥生物標(biāo)志物β淀粉樣蛋白，而類肽納米片層作為支架展示和支撐類肽環(huán)分子識別探針。利用該類肽納米片層，結(jié)合表面等離激元共振技術(shù)，可用于阿爾茲海默癥生化檢測。

優(yōu)選地，所述類肽具有式I所示的結(jié)構(gòu)：

其中，所述n為3-7的正整數(shù)。

第二方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的類肽的制備方法，其特征在于，所述制備方法通過固相亞單元合成法合成。

優(yōu)選地，所述制備方法包括以下步驟：

(1)溴乙酸在N,N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)的活化下與前一亞單位的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵；

(2)加入伯胺通過親核置換反應(yīng)替換掉溴原子；

(3)重復(fù)步驟(1)和(2)直至完成所有亞單位的合成。

第三方面，本發(fā)明提供一種檢測劑，所述檢測劑包含如第一方面所述的類肽。

優(yōu)選地，所述檢測劑還包含藥學(xué)上接受的輔料。

優(yōu)選地，所述輔料為賦形劑、稀釋劑、載體、調(diào)味劑、粘合劑和填充劑中的任意一種或至少兩種的組合。

第四方面，本發(fā)明如第一方面所述的類肽或如第三方面所述的檢測劑在制備檢測、診斷或監(jiān)控與β-淀粉樣蛋白相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述疾病包括阿爾茨海默病。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明的類肽與Aβ結(jié)合能力較強，通過表面等離基元共振技術(shù)得到的本發(fā)明的類肽與Aβ的結(jié)合動力學(xué)常數(shù)中的平衡解離常數(shù)K_D為10^-10摩爾/升數(shù)量級；

(2)本發(fā)明類肽對血清中β-淀粉樣蛋白具有高靈敏度，可以通過識別血清中的β-淀粉樣蛋白進而對病人和正常人血清進行有效地區(qū)分，可利用表面等離基元共振技術(shù)檢測類肽對AD病人與正常人血液信號強度，可以明顯區(qū)分病人與正常人；

(3)本發(fā)明的類肽在發(fā)病早期就可進行檢測，且無需給病人造成創(chuàng)傷，而且檢測準(zhǔn)確性高，特異性好；

(4)本發(fā)明類肽合成簡單，成本低。

附圖說明

圖1為類肽的熒光顯微圖像，其中，圖1(a)的標(biāo)尺是50μm，圖1(b)的標(biāo)尺是20μm；

圖2為類肽的原子力顯微圖像，其中，圖2(a)的標(biāo)尺是1μm，圖2(b)的標(biāo)尺是100nm；

圖3為本發(fā)明的類肽分子與β-淀粉樣蛋白結(jié)合的表面等離基元共振檢測的結(jié)果，其中，Aβ分別在2.2μM、4.6×10^-1μM、9.1×10^-2μM、1.8×10^-2μM和3.6×10^-3μM濃度下與類肽的結(jié)合過程；

圖4為本發(fā)明的類肽對AD病人與正常人血清信號的對比效果。

具體實施方式

下面通過具體實施方式來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中所述SPRi儀器為Plexera Kx5V2，Plexera Bioscience LLC,USA，該儀器主要裝配有660nmLED光源、CCD圖像采集器和帶微流通道的傳感芯片，儀器顯示每個監(jiān)測點上反射光強度隨時間的變化并記錄為SPR曲線。

除非特殊說明，本文中的“β-淀粉樣多肽”指的是全長的β-淀粉樣多肽Aβ1-42。

除非特殊說明，本文中的“AD病人”指的是阿爾茲海默癥患者。

除非特殊說明，本文中的“μM”指的是“μmol/L”，“mM”指的是“m mol/L”。

實施例1類肽的制備

本發(fā)明類肽通過固相亞單元合成法合成，所述方法包括以下步驟：

(1)將2M溴乙酸和3.2M N,N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)加入Rink amide AM樹脂(取代水平0.3mmol/g)中，在37℃下反應(yīng)30min，將樹脂末端的氨基酰化；

(2)再加入2M伯胺在37℃下反應(yīng)90min，通過親核取代反應(yīng)替換掉溴原子，完成一個亞單位的合成；

(3)重復(fù)步驟(1)和(2)直至完成其余單位的合成；

(4)待合成完畢后，側(cè)鏈保護基團被除去，并用95％三氟乙酸，2.5％超純水，2.5％三異丙基硅烷將類肽從樹脂上裂解下來備用。

制備得到的類肽的分子式如下：

本發(fā)明的類肽可以溶解到二甲基亞砜(DMSO)：水(2:1)混合溶液中，可以使類肽的母液濃度為2mM。

實施例2類肽的制備

本發(fā)明類肽通過固相亞單元合成法合成，所述方法包括以下步驟：

(1)將2M溴乙酸和3.2M N,N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)加入Rink amide AM樹脂(取代水平0.3mmol/g)中，在37℃下反應(yīng)30min，將樹脂末端的氨基?；?；

(2)再加入2M伯胺在37℃下反應(yīng)90min，通過親核取代反應(yīng)替換掉溴原子，完成一個亞單位的合成；

(3)重復(fù)步驟(1)和(2)直至完成其余單位的合成；

(4)待合成完畢后，側(cè)鏈保護基團被除去，并用95％三氟乙酸，2.5％超純水，2.5％三異丙基硅烷將類肽從樹脂上裂解下來備用。

制備得到的類肽的分子式如下：

本發(fā)明的類肽可以溶解到二甲基亞砜(DMSO)：水(2:1)混合溶液中，可以使類肽的母液濃度為2mM。

實施例3類肽的制備

本發(fā)明類肽通過固相亞單元合成法合成，所述方法包括以下步驟：

(1)將2M溴乙酸和3.2M N,N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)加入Rink amide AM樹脂(取代水平0.3mmol/g)中，在37℃下反應(yīng)30min，將樹脂末端的氨基?；?/p>

(2)再加入2M伯胺在37℃下反應(yīng)90min，通過親核取代反應(yīng)替換掉溴原子，完成一個亞單位的合成；

(3)重復(fù)步驟(1)和(2)直至完成其余單位的合成；

(4)待合成完畢后，側(cè)鏈保護基團被除去，并用95％三氟乙酸，2.5％超純水，2.5％三異丙基硅烷將類肽從樹脂上裂解下來備用。

制備得到的類肽的分子式如下：

本發(fā)明的類肽可以溶解到二甲基亞砜(DMSO)：水(2:1)混合溶液中，可以使類肽的母液濃度為2mM。

實驗例4類肽納米片層的形成

由于實施例1-3制備的類肽在檢測效果基本一致，本發(fā)明采用實施例1制備的類肽進行后續(xù)的實驗。

將類肽母液稀釋到片層形成緩沖液(10mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸,100mM氯化鈉,pH＝8.0)中，至最終濃度為1-100μM，優(yōu)選20μM。

(1)手動搖晃法：將類肽溶液在室溫下穩(wěn)定存放22小時，然后手動輕輕搖晃30秒，再穩(wěn)定1分鐘，重復(fù)搖晃-穩(wěn)定過程5次；

(2)機器搖晃法：將類肽溶液在管中自水平至垂直緩慢旋轉(zhuǎn)(0.6rpm)，每隔450秒旋轉(zhuǎn)一次；

將得到的類肽納米片層溶液加入尼羅紅，至最終濃度為1μM，將溶液放在1％瓊脂上，使用熒光顯微鏡(Vert.A1,Carl Zeiss Far East,Germany)觀察，結(jié)果如圖1(a)和圖1(b)所示，可以觀察到明顯的納米片層結(jié)構(gòu)。

將得到的類肽納米片層溶液溶液(1μM)滴加到云母基底上，25℃孵育5分鐘，然后小心用水沖洗，使用原子力顯微鏡(Bruker,MA,US)觀察，結(jié)果如圖2(a)和2(b)所示，可以觀察到納米片層表面是粗糙的，表面的突起物為特異性識別β淀粉樣蛋白的類肽所形成的類肽環(huán)。

實驗例5類肽與β-淀粉樣蛋白間結(jié)合能力

利用表面等離子體共振成像技術(shù)測試類肽與β-淀粉樣蛋白間結(jié)合能力的具體步驟如下：

(1)將類肽溶解到ddH₂O中，濃度為1-1000μM；

(2)將樣品點在一張3D芯片表面上，每種樣品重復(fù)3個點，4℃孵育12小時后，用10X PBS，1XPBS，超純水清洗干。然后將芯片用1M鹽酸氨基乙醇封閉30分鐘，然后用超純水清洗5次，最后用干凈氮氣吹干；

(3)將芯片安裝在SPRi儀器上，測定SPRi角并調(diào)節(jié)至最佳光學(xué)位置，在檢測區(qū)域選取相關(guān)檢測點，包括樣品點與空白點，設(shè)置實驗流速為2μL/s；

(4)選擇PBS為緩沖液通入流通池至基線穩(wěn)定后依次通過濃度為2.2μM、4.6×10^-1μM、9.1×10^-2μM、1.8×10^-2μM和3.6×10^-3μM進行檢測，結(jié)合時間為300秒，解離時間為300秒，每個濃度間通入磷酸進行重生。

檢測結(jié)果如圖3所示，經(jīng)擬合，平衡解離常數(shù)K_D為1.09×10^-10摩爾/升。

實驗例6類肽對血清信號的檢測

利用表面等離子體共振成像技術(shù)測試類肽檢測AD病人血清與正常人血清的具體步驟如下

(1)同實驗例5，制作同樣的3D芯片，安裝在在SPRi儀器上，測定SPRi角并調(diào)節(jié)至最佳光學(xué)位置，在檢測區(qū)域選取相關(guān)檢測點，包括樣品點與空白點，設(shè)置實驗流速為2μL/s；

(2)選擇PBS為緩沖液通入流通池至基線穩(wěn)定后，分別通入不同病人與正常人的血清(1:5000)稀釋，結(jié)合時間為300秒，解離時間為300秒，每個樣品間通入磷酸和蛋白酶K進行重生。

檢測結(jié)果如圖4所示，在環(huán)形類肽含量較高的情況下，可以明顯區(qū)分AD病人與正常人。

綜上所述，本發(fā)明的類肽是一種對血清中β-淀粉樣蛋白高靈敏度的類肽，為診斷和監(jiān)控阿爾茨海默癥疾病提供了新的選擇。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的工藝方法，但本發(fā)明并不局限于上述工藝步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述工藝步驟才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。