本發(fā)明涉及藥物制備領(lǐng)域，特別涉及達(dá)托霉素RS-5/6及RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)的制備方法，具體的說(shuō)涉及一種采用達(dá)托霉素一定條件轉(zhuǎn)換及制備色譜方法制備高純度達(dá)托霉素RS-5/6及RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)。

背景技術(shù)：

隨著抗生素的發(fā)展及抗生素的濫用，病原菌對(duì)抗生素的耐藥性是當(dāng)今社會(huì)面臨的最嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。除了控制抗生素濫用外，目前尋找一種有效的對(duì)抗耐藥菌的抗生素成了解決這一問(wèn)題的最佳途徑，萬(wàn)古霉素曾被認(rèn)為是對(duì)抗革蘭氏陽(yáng)性菌的最后一道防線，但現(xiàn)在全世界臨床已發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的耐此藥菌。

達(dá)托霉素(Daptomycin)是由Lilly(禮來(lái))公司最初研究，Cubist制藥公司開(kāi)發(fā)的一環(huán)脂肽類抗生素。應(yīng)病人對(duì)新型耐藥抗生素的迫切需求，2003年底，美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)經(jīng)過(guò)快速審理程序批準(zhǔn)注射用達(dá)托霉素(Daptomycin)(商品名cubicin)用于治療由一些革蘭氏陽(yáng)性敏感菌株引起的并發(fā)性皮膚及皮膚結(jié)構(gòu)感染，如膿腫、手術(shù)切口感染和皮膚潰瘍。達(dá)托霉素的作用機(jī)制與其他抗生素不同，它通過(guò)擾亂細(xì)胞膜對(duì)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的生物合成，改變細(xì)胞質(zhì)膜的性質(zhì)；另外，它還能通過(guò)破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，使其內(nèi)容物外泄而達(dá)到殺菌的目的，因此細(xì)菌對(duì)達(dá)托霉素產(chǎn)生耐藥性可能會(huì)比較困難。

達(dá)托霉素雖然已經(jīng)在美國(guó)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但在達(dá)托霉素產(chǎn)品中常包含有脫水達(dá)托霉素、異構(gòu)達(dá)托霉素、達(dá)托霉素內(nèi)酯水解物等雜質(zhì)，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量，為此能夠單獨(dú)分離純化出達(dá)托霉素中的雜質(zhì)并進(jìn)行研究是非常必要的。

現(xiàn)有的達(dá)托霉素RS-5/6及RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)提取方法，例如歐洲專利1586580A2所描述的達(dá)托霉素雜質(zhì)歸屬，并未具體涉及達(dá)托霉素雜質(zhì)分離方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉且能快速得到高純度達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)的制備方法。

根據(jù)歐洲專利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公開(kāi)的方法對(duì)達(dá)托霉素進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合歐洲專利1586580A2所描述的達(dá)托霉素雜質(zhì)歸屬， 對(duì)達(dá)托霉素雜質(zhì)歸屬命名和定位情況如圖1所示，圖1中DT代表達(dá)托霉素，并標(biāo)示出了達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)峰、RS-7雜質(zhì)峰和RS-7a/7b雜質(zhì)峰的位置。

本發(fā)明提供的達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)的制備方法，包括如下步驟：

1)將達(dá)托霉素用堿溶液溶解，放置8小時(shí)到4天，得到含較高濃度達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)的溶液；

2)該溶液經(jīng)過(guò)制備色譜柱分離純化，得色譜純度>90％的達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)、RS-7雜質(zhì)和RS-7a/7b雜質(zhì)的制備液；

3)分別將步驟2)所得達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)、RS-7雜質(zhì)和RS-7a/7b雜質(zhì)的制備液凍干，得到固體達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)、RS-7雜質(zhì)和RS-7a/7b雜質(zhì)。

上述步驟1)中采用的達(dá)托霉素色譜純度>80％，優(yōu)選>90％。

上述步驟1)所述堿溶液的堿可選自NaOH、Na₂CO₃、NaHCO₃、NH₄HCO₃等一系列無(wú)機(jī)堿，所述堿溶液的pH>8。在本發(fā)明的實(shí)施例中，采用了這些無(wú)機(jī)堿的飽和水溶液作為所述堿溶液。

上述步驟1)中優(yōu)選將達(dá)托霉素用堿溶液溶解成30～50mg/mL的溶液；放置溫度一般在4～30℃，優(yōu)選為4～20℃；放置時(shí)間8小時(shí)到4天，優(yōu)選8～24小時(shí)。

上述步驟2)采用制備色譜分離系統(tǒng)分離純化達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)，流動(dòng)相采用乙腈和三氟乙酸溶液的混合液，具體色譜條件是：

色譜柱：Ib-SitC₈/6045-1、250×10.00mm

波長(zhǎng)：214nm

流動(dòng)相：乙腈、三氟乙酸溶液

流速：5mL/min

柱溫：20～30℃室溫

其中，三氟乙酸溶液濃度為0.01％～0.2％，優(yōu)選0.01％～0.05％；

流動(dòng)相比例為乙腈:三氟乙酸溶液＝40:60～60:40(體積比，下同)，優(yōu)選50:50～60:40。

在本發(fā)明方法中，達(dá)托霉素破壞液制備色譜分離系統(tǒng)處理后，得到的達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)及RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)其色譜純度在95％以上。該方法簡(jiǎn)單易行，成本低廉。

附圖說(shuō)明

圖1是達(dá)托霉素HPLC檢測(cè)圖譜，其中顯示了達(dá)托霉素各雜質(zhì)的歸屬和定位情況。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

色譜純度90％達(dá)托霉素成品用飽和氫氧化鈉溶液溶解成50mg/mL溶液，4℃冰箱保溫8h，得到主要含達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)的破壞液。

該溶液經(jīng)制備色譜(流動(dòng)相為乙腈:0.01％三氟乙酸＝53:47)分離純化，并用高效液相跟蹤檢測(cè)(檢測(cè)條件與歐洲專利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公開(kāi)的方法相同)，分別收集色譜純度>90％的達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)制備液、RS-7雜質(zhì)制備液和RS-7a/7b雜質(zhì)制備液。

制備液真空凍干，所得固體達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)采用高效液相色譜法(檢測(cè)條件與歐洲專利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公開(kāi)的方法相同)檢測(cè)達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)純度98％，RS-7雜質(zhì)的色譜純度98％和RS-7a/7b純度99％。

實(shí)施例2

色譜純度90％達(dá)托霉素成品用飽和Na₂CO₃溶液溶解成50mg/mL溶液，20℃保溫1天，得到主要含達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)的破壞液。

該溶液經(jīng)制備色譜(流動(dòng)相為乙腈:0.01％三氟乙酸＝53:47)分離純化，并用高效液相跟蹤檢測(cè)(檢測(cè)條件與歐洲專利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公開(kāi)的方法相同)，分別收集色譜純度>90％的達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)制備液、RS-7雜質(zhì)制備液和RS-7a/7b雜質(zhì)制備液。

制備液真空凍干，所得固體達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)采用高效液相色譜法(檢測(cè)條件與歐洲專利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公開(kāi)的方法相同)檢測(cè)達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)純度97％，RS-7雜質(zhì)的色譜純度97％和RS-7a/7b純度98％。

實(shí)施例3

色譜純度90％達(dá)托霉素成品用飽和NH₄HCO₃溶液溶解成50mg/mL溶液，20℃保溫1天，得到主要含達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)的破壞液。

該溶液經(jīng)制備色譜(流動(dòng)相為乙腈:0.01％三氟乙酸＝53:47)分離純化，并用高效液相跟蹤檢測(cè)(檢測(cè)條件與歐洲專利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公開(kāi)的方法相同)，分別收集色譜純度>90％的達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)制備液、 RS-7雜質(zhì)制備液和RS-7a/7b雜質(zhì)制備液。

制備液真空凍干，所得固體達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)采用高效液相色譜法(檢測(cè)條件與歐洲專利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公開(kāi)的方法相同)檢測(cè)達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)純度96％，RS-7雜質(zhì)的色譜純度94％和RS-7a/7b純度97％。

實(shí)施例4

色譜純度90％達(dá)托霉素成品用飽和NaHCO₃溶液溶解成50mg/mL溶液，20℃保溫1天，得到主要含達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)的破壞液。

該溶液經(jīng)制備色譜(流動(dòng)相為乙腈:0.01％三氟乙酸＝53:47)分離純化，并用高效液相跟蹤檢測(cè)(檢測(cè)條件與歐洲專利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公開(kāi)的方法相同)，分別收集色譜純度>90％的達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)制備液、RS-7雜質(zhì)制備液和RS-7a/7b雜質(zhì)制備液。

制備液真空凍干，所得固體達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)采用高效液相色譜法(檢測(cè)條件與歐洲專利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公開(kāi)的方法相同)檢測(cè)達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)純度95％，RS-7雜質(zhì)的色譜純度95％和RS-7a/7b純度97％。

實(shí)施例5

色譜純度90％達(dá)托霉素成品用飽和氫氧化鈉溶液溶解成50mg/mL溶液，4℃冰箱保溫8h，得到主要含達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)的破壞液。

該溶液經(jīng)制備色譜(流動(dòng)相為乙腈:0.01％三氟乙酸＝55:45)分離純化，并用高效液相跟蹤檢測(cè)(檢測(cè)條件與歐洲專利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公開(kāi)的方法相同)，分別收集色譜純度>90％的達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)制備液、RS-7雜質(zhì)制備液和RS-7a/7b雜質(zhì)制備液。

制備液真空凍干，所得固體達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)采用高效液相色譜法(檢測(cè)條件與歐洲專利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公開(kāi)的方法相同)檢測(cè)達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)純度96％，RS-7雜質(zhì)的色譜純度95％和RS-7a/7b純度98％。

實(shí)施例6

色譜純度90％達(dá)托霉素成品用飽和氫氧化鈉溶液溶解成50mg/mL溶液，4℃冰箱保溫8h，得到主要含達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)的破壞液。

該溶液經(jīng)制備色譜(流動(dòng)相為乙腈:0.01％三氟乙酸＝50:50)分離純化，并用高效液相跟蹤檢測(cè)(檢測(cè)條件與歐洲專利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公開(kāi)的方法相同)，分別收集色譜純度>90％的達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)制備液、RS-7雜質(zhì)制備液和RS-7a/7b雜質(zhì)制備液。

制備液真空凍干，所得固體達(dá)托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)采用高效液相色譜法(檢測(cè)條件與歐洲專利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580 A2)公開(kāi)的方法相同)檢測(cè)達(dá)托霉素RS-5/6雜質(zhì)純度97％，RS-7雜質(zhì)的色譜純度96％和RS-7a/7b純度97％。

本發(fā)明采用堿破壞方法及制備色譜技術(shù)提供一種快速簡(jiǎn)便、成本低廉的制備高純度達(dá)托霉素RS-5/6及RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)的工藝技術(shù)。堿破壞方法及制備流動(dòng)相中乙腈和三氟乙酸溶液比例及三氟乙酸濃度更是高純度達(dá)托霉素RS-5/6及RS-7和RS-7a/7b雜質(zhì)制備的關(guān)鍵工藝控制點(diǎn)。雖然本文已經(jīng)對(duì)該發(fā)明進(jìn)行了詳盡的描述，但可以理解，在不違背本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以做一些修改或變動(dòng)，這些修改或變動(dòng)均在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。