本發(fā)明屬于β-欖香烯衍生物的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一氧化氮供體型β-欖香烯衍生物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

β-欖香烯是從溫莪術(shù)(C.Wenchowensis)的根莖中分離出來(lái)的具有抗腫瘤活性的倍半萜烯化合物，其分子式為C₁₅H₂₄，結(jié)構(gòu)式如下式(1)：

以β-欖香烯為主要成分的乳劑已于2008年被衛(wèi)生部批準(zhǔn)為國(guó)家二類抗癌新藥進(jìn)入二期臨床研究，這種新的抗腫瘤天然產(chǎn)物在各種腫瘤中逐步表現(xiàn)出很強(qiáng)的臨床治療作用。目前，在臨床上主要用于惡性漿膜腔積液、肺癌、消化道腫瘤、腦瘤以及其它淺表性腫瘤的化療，對(duì)食管癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、膀胱癌等亦有一定療效。研究表明，欖香烯類化合物幾乎不產(chǎn)生副作用，對(duì)腎、肝的功能都不產(chǎn)生藥物誘導(dǎo)毒性，特別是對(duì)脊髓沒(méi)有抑制作用。(張殊佳，周鵬段，華鑫，袁韓?；瘜W(xué)通報(bào).2010,6:499.)

但是，由于β-欖香烯屬于揮發(fā)油類，不溶于水，生物利用度很低，嚴(yán)重限制了它的臨床應(yīng)用。因此，如何提高其水溶性一直備受關(guān)注?，F(xiàn)有技術(shù)中，以通過(guò)合成β-欖香烯衍生物從而提高水溶性的工作為主。如賈衛(wèi)民在其論文《抗癌新藥β-欖香烯及其衍生物的合成、結(jié)構(gòu)和構(gòu)效研究》中合成了雙取代的酯、醇、醚和疊氮衍生物并對(duì)β-欖香烯的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果表明，β-欖香烯的抗癌活性和三個(gè)孤立雙鍵及整個(gè)骨架結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，其衍生物的抗癌活性隨水溶性增大而增強(qiáng)。又如中國(guó)專利申請(qǐng)200710037160.3公開(kāi)了β-欖香烯二胺類衍生物及其合成方法。中國(guó)專利申請(qǐng)02121674.6公開(kāi)了β-欖香烯氮雜環(huán)衍生物及其合成方法。中國(guó)專利申請(qǐng)200710181826.2公開(kāi)了β-欖香烯氨基酸衍生物及其合成方法。

一氧化氮(NO)氣體分子在不同條件下具有促瘤和抗瘤的作用，這種雙重作用取決于NO的生成濃度、時(shí)間和效應(yīng)部位。持續(xù)低濃度的NO可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，高濃度的NO則通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞毒性而發(fā)揮抗腫瘤活性。呋咱氮氧化物在體內(nèi)能夠持續(xù)釋放較高濃度的NO(Kerwin J.F.,Heller.M.Med.Res.Rev.1994,14:23.)。為獲得性能優(yōu)異的新型抗腫瘤活性化合物，通過(guò)分子設(shè)計(jì)的方法，選擇性地在β-欖香烯結(jié)構(gòu)中引入NO釋放單元，使β-欖香烯衍生物兼具優(yōu)異的水溶性和較高的生物利用度，從而進(jìn)一步擴(kuò)充其臨床應(yīng)用。值得注意的是，目前現(xiàn)有技術(shù)中并未見(jiàn)將NO供體與β-欖香烯結(jié)合制備衍生物的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一類NO供體與β-欖香烯結(jié)合的一氧化氮供體型β-欖香烯衍生物及其可藥用鹽。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供制備上述一氧化氮供體型β-欖香烯衍生物及其可藥用鹽的方法。

本申請(qǐng)的又一個(gè)目的是提供一種包含上述一氧化氮供體型β-欖香烯衍生物及其可藥用鹽的藥物組合物。

本申請(qǐng)的再一個(gè)目的是提供上述一氧化氮供體型β-欖香烯衍生物及其可藥用鹽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案提供了一類NO供體與β-欖香烯結(jié)合的一氧化氮供體型β-欖香烯衍生物及其可藥用鹽，其中，一氧化氮供體型β-欖香烯衍生物具有如下通式M：

或者溶劑化物，或者其對(duì)映異構(gòu)體或非對(duì)映異構(gòu)體，且其中，X為O；或同時(shí)含有酯基和胺基的基團(tuán)，即同時(shí)含有-COO-和-NH-基團(tuán)；

R¹代表不含或任選地含有一個(gè)至三個(gè)取代基的C_1-10烷基，C_6-12環(huán)烷基，C_6-12芳基，C_2-10烯基，C_2-10炔基或C_2-10醚基；

R²代表不含或任選地含有一個(gè)至三個(gè)取代基的C_1-10烷基，C_6-12環(huán)烷基，C_6-12芳基，C_2-10烯基，C_2-10炔基或C_4-22的醚基；其中，所述的烷基、環(huán)烷基、芳基、烯基、炔基和醚基包括直鏈的或帶支鏈的烷基、直鏈的或帶支鏈的環(huán)烷基、直鏈的或帶支鏈的芳基、直鏈的或帶支鏈的烯基、直鏈的或帶支鏈的炔基和直鏈的或帶支鏈的醚基。

優(yōu)選地，X為O，所述一氧化氮供體型β-欖香烯衍生物的通式如下式(I)；

所述取代基任意代表胺基、鹵原子、羧基、C_1-3烷氧基、C_1-3鹵代烷基、硝基或羥基；

優(yōu)選地，X為同時(shí)含有酯基和胺基的基團(tuán)，所述一氧化氮供體型β-欖香烯衍生物的通式如下式(II)；

其中，R³代表不含或任選地含有一個(gè)至三個(gè)取代基的C_1-10烷基，C_6-12環(huán)烷基或C_6-12芳基；所述烷基、環(huán)烷基和烷基包括直鏈的或帶支鏈的烷基、直鏈的或帶支鏈的環(huán)烷基、直鏈的或帶支鏈的芳基。

所述取代基任意代表胺基、鹵原子、羧基、C_1-3烷氧基、C_1-3鹵代烷基、硝基或羥基；所述取代基是指R¹、R²、R³的中C_1-10烷基，C_6-12環(huán)烷基或C_6-12芳基上含有的取代基；

進(jìn)一步優(yōu)選地，R¹代表不含或任選地含有一個(gè)取代基的C_1-5烷基，C_6-8環(huán)烷基，C_6-10芳基，C_2-6烯基，C_2-6炔基或C_2-6醚基；

R²代表不含或任選地含有一個(gè)取代基的C_1-6烷基，C_6-8環(huán)烷基，C_6-10芳基，C_2-6烯基，C_2-6炔基或C_4-8醚基；

R³代表不含或任選地含有一個(gè)取代基的C_1-5烷基，C_6-8環(huán)烷基或C_6-10芳基；

所述取代基任意優(yōu)選為-NH₂、-F、-Cl、-Br、-I、-COOH、-OCH₃、-CF₃、-NO₂或-OH。

更進(jìn)一步優(yōu)選地，R¹代表不含或任選地含有一個(gè)-NH₂的C_1-5烷基，不含取代基的C_6-8環(huán)烷基，C_6-8芳基，C_2-4烯基，C_2-4炔基或C_2-4醚基；

R²代表任選地不含取代基的C_1-6烷基，C_4-6炔基或C_4-6醚基；

R³代表任選地含有一個(gè)-COOH或-NH₂的C_1-5烷基，不含取代基的C_6-8芳基。

又進(jìn)一步優(yōu)選地，R¹代表任選地含有一個(gè)-NH₂的C_2-3烷基，不含取代基的C_2-5烷基，C_6-8芳基，C_2-4烯基或C_2-4醚基；例如：-(CH₂)₂-，-(CH₂)₃-，-CH₂C(CH₃)₂CH₂-，-CH(NH₂)CH₂-，-CH(NH₂)(CH₂)₂-，-C₆H₄-，-CH＝CH-或-CH₂OCH₂-；最優(yōu)選為-(CH₂)₂-或-CH(NH₂)CH₂-；

R²代表任選地不含取代基的C_1-6烷基，C_4-6炔基或C_4-6醚基；例如：-(CH₂)₂-，-(CH₂)₃-，-(CH₂)₄-、-(CH₂)₆-、-CH₂CH(CH₃)-，-(CH₂)₂CH(CH₃)-，-(CH₂)₂O(CH₂)₂-或-CH₂CH≡CHCH₂-；最優(yōu)選為-(CH₂)₂-、-CH₂CH≡CHCH₂-、-(CH₂)₂O(CH₂)₂-；

R³代表任選地含有一個(gè)-COOH的C_2-4烷基，含有一個(gè)-NH₂的C_2-4烷基，不含取代基C_1-5烷基，不含取代基的C_6-8芳基；例如：-CH(NH₂)(CH₂)₃-、-CH(COOH)CH₂-，-CH(COOH)(CH₂)₂-，-CH₂-，-(CH₂)₂-，-(CH₂)₃-，-CH(CH₃)-，-(CH₃)CH(CH₂CH₃)-或-CH(CH₂Ph)-；最優(yōu)選為-CH₂-，-(CH₂)₂-，-(CH₂)₃-，-CH(CH₃)-，-CH((CH₃)CH(CH₂CH₃))-或-CH(CH₂Ph)-。

本申請(qǐng)所述的“β-欖香烯衍生物的可藥用鹽”是指常規(guī)的有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸的加成鹽，其保留了β-欖香烯衍生物的生物有效性和特性。所述酸為鹽酸，氫溴酸，氫碘酸，硫酸，磷酸，硝酸，乙酸，酒石酸，水楊酸，甲磺酸，苯磺酸，對(duì)甲苯磺酸，鄰苯二甲酸，丁二酸，己二酸，丙酮酸，羥基丁酸，檸檬酸，蘋果酸，乳酸，富馬酸，馬來(lái)酸和琥珀酸中的一種；優(yōu)選為鹽酸，氫溴酸，氫碘酸，富馬酸，馬來(lái)酸，甲磺酸，檸檬酸和酒石酸中一種。

本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)方案提供了上述一氧化氮供體型β-欖香烯衍生物及其可藥用鹽的制備方法，其中，通式M所示結(jié)構(gòu)化合物的制備包括下列步驟：

將如下式(Ⅲ)或(Ⅳ)所示結(jié)構(gòu)的化合物與13-β-欖香醇，或與13-β-欖香醇氨基酸酯經(jīng)催化酯化反應(yīng)制得通式M所示結(jié)構(gòu)化合物；

其中，所述R¹代表不含或任選地含有一個(gè)至三個(gè)取代基的C_1-10烷基，C_6-12環(huán)烷基，C_6-12芳基，C_2-10烯基，C_2-10炔基或C_2-10醚基；

R²代表不含或任選地含有一個(gè)至三個(gè)取代基的C_1-10烷基，C_6-12環(huán)烷基，C_6-12芳基，C_2-10烯基，C_2-10炔基或C_4-22的醚基；

Y代表-OH或-Cl。

優(yōu)選地，所述Y代表-OH，所述式(Ⅳ)由以下反應(yīng)制得：

優(yōu)選地，所述Y代表-Cl，可由含羥基的式(Ⅳ)與草酰氯反應(yīng)制得酰氯中間體，然后將酰氯中間體與13-β-欖香醇，或與13-β-欖香醇氨基酸酯經(jīng)催化酯化反應(yīng)制得通式M所示結(jié)構(gòu)化合物。

優(yōu)選地，制備中間體1的操作具體如下：

a.將苯硫酚溶于5M NaOH水溶液，加入氯乙酸，回流2h，調(diào)節(jié)pH值至1-2，過(guò)濾得固體1；其中，苯硫酚、NaOH和氯乙酸的摩爾比為＝1:2:1.1；

b.將步驟a所得固體1溶于冰醋酸，所得固體1的冰醋酸溶液的濃度為1.0-1.5mol/L，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30％的H₂O₂水溶液，攪拌3h后緩慢滴加發(fā)煙硝酸，在冰水浴條件下1h內(nèi)滴完，然后升溫至100℃，繼續(xù)反應(yīng)3h，冷卻至室溫，過(guò)濾得固體2，即中間體1；其中，所述固體1與H₂O₂的摩爾比為1:2；所述固體1與發(fā)煙硝酸的摩爾比為1:6。

優(yōu)選地，制備所述式(Ⅲ)的操作具體如下：

將所述中間體1溶于四氫呋喃，依次加入二羥基化合物R₂(OH)₂和5M NaOH水溶液，攪拌1h后，萃取，柱層析得3-苯磺?；?4-羥基醚-1,2,5-噁二唑-2-氧化物，即式(Ⅲ)；其中，中間體1的四氫呋喃溶液的摩爾濃度為0.1-0.5mol/L；所述中間體1：二羥基化合物和NaOH的摩爾比為1:(3-6):(1.2-2)；優(yōu)選為1:(4-6):(1.3-2)；更優(yōu)選為1:(5-6):(1.5-2)；例如1:5:1.5。

優(yōu)選地，Y為-OH，制備所述式由(Ⅳ)結(jié)構(gòu)的化合物的具體操作如下：

將式(Ⅲ)所示結(jié)構(gòu)的3-苯磺酰基-4-羥基醚-1,2,5-噁二唑-2-氧化物溶解，依次加入二酸酐化合物、DMAP、三乙胺，室溫?cái)嚢?-4h后過(guò)濾，純化即得(3-苯磺酰基-4-氧-1,2,5-噁二唑-2-氧化物)二酸單酯化合物，即式(Ⅳ)。

進(jìn)一步優(yōu)選地，溶解式(Ⅲ)所示結(jié)構(gòu)的3-苯磺酰基-4-羥基醚-1,2,5-噁二唑-2-氧化物所用溶劑可以為二氯甲烷、三氯甲烷、四氫呋喃和N,N-二甲基甲酰胺中的一種；更進(jìn)一步優(yōu)選為二氯甲烷；

所述式(Ⅲ)：二酸酐：DMAP：三乙胺的摩爾比為1:(1.1-2)：(0.1-0.5):(1.3-3)；更進(jìn)一步優(yōu)選為1:(1.2-2)：(0.1-0.3):(1.3-2)；最優(yōu)選為：

1:(1.2-1.5)：(0.1-0.3):(1.3-1.8)；如1：1.2：0.1:1.5。

優(yōu)選地，Y為-OH，通式M所示結(jié)構(gòu)化合物由式(Ⅳ)所示結(jié)構(gòu)的化合物與13-β-欖香醇經(jīng)催化酯化反應(yīng)制得，具體步驟為：將式(Ⅳ)化合物和13-β-欖香醇，溶于二氯甲烷，加入EDCI和DMAP室溫?cái)嚢?-10h，反應(yīng)結(jié)束后，萃取，柱層析即得產(chǎn)物；其中，所述式(Ⅳ)化合物、13-β-欖香醇、EDCI和DMAP的摩爾比為(1-3):1:(1.1-3):(0.1-0.5)，進(jìn)一步優(yōu)選為(1.2-2):1:(1.1-2):(0.1-0.3)，更優(yōu)選為(1.2-1.5):1:(1.2-1.8):(0.1-0.3)，如1.2:1:1.2:0.1。

優(yōu)選地，Y為-OH，通式M所示結(jié)構(gòu)化合物由式(Ⅲ)所示結(jié)構(gòu)的化合物與13-β-欖香醇氨基酸酯經(jīng)催化酯化反應(yīng)制得，具體步驟為：

將式(Ⅲ)化合物、13-β-欖香醇氨基酸酯溶于二氯甲烷，加入EDCI和DMAP，室溫?cái)嚢?-10h，反應(yīng)結(jié)束后，萃取，柱層析即得產(chǎn)物；其中，所述式(Ⅲ)化合物、13-β-欖香醇氨基酸酯、EDCI和DMAP的摩爾比為(1.1-3):1:(1.1-3):(0.1-0.5)；優(yōu)選為(1.2-1.5):1:(1.2-2):(0.1-0.3)。更優(yōu)選為(1.2-1.5):1:(1.2-1.5):(0.1-0.3)，如1.2:1:1.2:0.1。

優(yōu)選地，Y為-OH，通式M所示結(jié)構(gòu)化合物由式(Ⅳ)所示結(jié)構(gòu)的化合物與13-β-欖香醇氨基酸酯經(jīng)催化酯化反應(yīng)制得，具體步驟為：將式(Ⅳ)化合物、13-β-欖香醇氨基酸酯溶于二氯甲烷，加入EDCI和HOBt，室溫?cái)嚢?-8h，反應(yīng)結(jié)束后，萃取，柱層析即得產(chǎn)物；其中，所述式(Ⅳ)化合物、13-β-欖香醇氨基酸酯、EDCI和HOBt的摩爾比為(1.1-3):1:(1.1-3):(1.1-3)；優(yōu)選為(1.2-1.5):1:(1.2-2):(1.2-2)。更優(yōu)選為(1.2-1.5):1:(1.2-1.5):(1.2-1.5)，如1.2:1:1.2:1.2。

優(yōu)選地，Y為-Cl，通式M所示結(jié)構(gòu)化合物由式(Ⅳ)所示結(jié)構(gòu)的化合物與13-β-欖香醇氨基酸酯經(jīng)催化酯化反應(yīng)制得，具體步驟為：

將式13-β-欖香醇氨基酸酯、DMAP和三乙胺溶于二氯甲烷，室溫?cái)嚢柘戮徛氐渭邮?Ⅳ)化合物的二氯甲烷溶液，滴畢繼續(xù)反應(yīng)1-3h，反應(yīng)結(jié)束后，萃取，柱層析即得產(chǎn)物；其中，所述式(Ⅳ)：13-β-欖香醇氨基酸酯：DMAP：三乙胺的摩爾比為(1.1-3):1：(0.1-0.5):(1.3-3)；更進(jìn)一步優(yōu)選為(1.2-2)：1:(0.1-0.3):(1.3-2)；最優(yōu)選為：(1.2-1.5)：1:(0.1-0.3):(1.3-1.8)；如1.2：1：0.1:1.5。

其中，13-β-欖香醇氨基酸酯由13-β-欖香醇和Boc-氨基酸催化酯化制得的中間體再經(jīng)有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸,優(yōu)選為有機(jī)酸三氟乙酸脫保護(hù)制得,具體步驟為：

1)13-β-欖香醇和Boc-氨基酸溶于二氯甲烷，加入EDCI和DMAP，室溫?cái)嚢?-10h，反應(yīng)結(jié)束后，萃取，柱層析制得中間體13-β-欖香醇Boc-氨基酸酯；其中，所述式13-β-欖香醇、Boc-氨基酸、EDCI和DMAP的摩爾比為(1.1-5):1:(1.1-3):(0.1-0.5)；優(yōu)選為(1.2-3):1:(1.2-2):(0.1-0.3)；更優(yōu)選為(1.2-2):1:(1.2-1.5):(0.1-0.3)，如1.2:1:1.2:0.1；

2)13-β-欖香醇Boc-氨基酸酯溶于二氯甲烷，加入三氟乙酸，室溫?cái)嚢?-3h，反應(yīng)結(jié)束后，萃取，柱層析即得產(chǎn)物13-β-欖香醇氨基酸酯；其中，所述13-β-欖香醇Boc-氨基酸和三氟乙酸的摩爾比為1:(5-20)；優(yōu)選為1:(10-15)。

優(yōu)選地，所述Boc-氨基酸選自Boc-L-天冬氨酸、Boc-L-谷氨酸，Boc-甘氨酸、Boc-L-苯丙氨酸、Boc-L-異亮氨酸、Boc-L-亮氨酸、Boc-L-纈氨酸、Boc-L-丙氨酸、Boc-L-脯氨酸、Boc-L-絲氨酸、Boc-L-半胱氨酸、Boc-L-蘇氨酸、Boc-L-蛋氨酸、Boc-L-色氨酸、Boc-L-賴氨酸、Boc-L-精氨酸、Boc-L-組氨酸和Boc-β-丙氨酸中的一種；

進(jìn)一步優(yōu)選為Boc-L-天冬氨酸、Boc-甘氨酸、Boc-L-苯丙氨酸、Boc-L-異亮氨酸、Boc-L-丙氨酸、Boc-L-脯氨酸、Boc-L-絲氨酸和Boc-β-丙氨酸中的一種。

優(yōu)選地，所述的13-β-欖香醇的制備方法如下：

將β-欖香烯溶于二氯甲烷和乙酸混合溶液中，冰水浴條件下向混合溶液中加入含有活性氯的次氯酸鈉溶液，反應(yīng)4-8h后分液，萃取，合并并濃縮有機(jī)相得粗品，將所述粗品溶解后，攪拌下加入無(wú)水醋酸鈉，于90-120℃反應(yīng)5-8h后進(jìn)行抽濾，萃取，合并并濃縮有機(jī)相得黃色液體，將黃色液體溶解后，加入氫氧化鈉或氫氧化鉀回流2-4h，過(guò)濾，濃縮濾液后柱層析即得。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的13-β-欖香醇的制備步驟中所述二氯甲烷和乙酸的體積比為(1-5):1；

所述次氯酸鈉溶液中次氯酸鈉與β-欖香烯的摩爾比為(1.1-2):1。

本申請(qǐng)的又一個(gè)技術(shù)方案提供了一種含有上述一氧化氮供體型β-欖香烯衍生物及其可藥用鹽的藥物組合物，其包括通式M所示結(jié)構(gòu)的化合物或其可藥用鹽，及可藥用載體。

本申請(qǐng)的又一個(gè)技術(shù)方案提供了上述一氧化氮供體型β-欖香烯衍生物及其可藥用鹽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本申請(qǐng)具有如下有益效果：

在β-欖香烯結(jié)構(gòu)中引入含有極性基團(tuán)的呋咱氮氧化物，一方面提高了β-欖香烯衍生物的水溶性；另一方面，呋咱氮氧化物作為一氧化氮釋放單元可釋放出NO，與β-欖香烯起協(xié)同抗腫瘤作用；而且豐富了抗腫瘤藥物β-欖香烯衍生物的分子庫(kù)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。這些實(shí)施例僅是出于解釋說(shuō)明的目的，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受其限制。

中間體13-β-欖香醇的制備

將100mmolβ-欖香烯溶于20mL二氯甲烷和乙酸混合溶液中(V:V＝2:1)，冰浴條件下緩慢滴入含有180mmol活性氯的次氯酸鈉溶液，冰浴反應(yīng)4h后分液，水層以二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷濃縮得淡黃色液體粗品，液體粗品溶于15mL無(wú)水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，攪拌下加入200mmol無(wú)水醋酸鈉，于100℃反應(yīng)7h；反應(yīng)液以200目硅膠抽濾，濾液中加入15mL飽和食鹽水，然后用石油醚萃取3次，合并并濃縮石油醚得黃色液體，以8mL甲醇和8mL氯仿的混合溶液溶解黃色液體，加入200mmol氫氧化鉀回流反應(yīng)2h。過(guò)濾，濾液濃縮后以石油醚：乙酸乙酯＝10:1(V:V)柱層析，得到無(wú)色液體產(chǎn)物，總產(chǎn)率為15％。

所述13-β-欖香醇的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果如下：

¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ:1.01(s,3H),1.41-1.67(m,6H),1.71(s,3H),1.97-2.05(m,2H),4.13(s,2H),4.59(s,1H),4.82(t,J＝1.7Hz,1H),4.88(s,1H),4.91-4.94(m,2H),5.05(d,J＝1.3Hz,1H),5.81(dd,J₁＝17.8Hz,J₂＝10.5Hz,1H).

¹³C NMR(CDCl₃,300MHz)δ:153.7,150.0,147.4,112.1,109.9,107.9,65.1,52.7,41.4,39.8,39.7,33.2,27.2,24.7,16.5.

實(shí)施例1

13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)乙酯)-β-欖香烯的制備方法如下：

1)3，4-二苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物(中間體1)的制備

將苯硫酚(50ml,0.50mol)加入裝有機(jī)械攪拌的反應(yīng)瓶中，室溫?cái)嚢柘录尤?M NaOH水溶液200mL，15min后加入氯乙酸(53g,0.55mol)，反應(yīng)液中有大量白色沉淀析出；升溫至140℃后加熱回流2h，反應(yīng)液變澄清，冷卻后呈白色糊狀；在冰浴條件下緩慢滴加6N HCl調(diào)pH至1，過(guò)濾，干燥后得粗品，粗品用H₂O重結(jié)晶，得白色固體68g(收率97％):mp.60-62℃。

2)3-苯磺酰基-4-羥乙基醚-1,2,5-噁二唑-2-氧化物(式(Ⅲ))的制備

將乙二醇(1.12mL,20mmol)和3,4-二苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化(733mg,4.0mmol)溶于10mL四氫呋喃中，滴入5M NaOH水溶液(6.0ml,30mmol)，反應(yīng)1h后將反應(yīng)液傾入20mL H₂O中，用乙酸乙酯萃取三次，每次20mL，有機(jī)層合并后用飽和食鹽水洗一次，用無(wú)水Na₂SO₄干燥，過(guò)濾，濾液濃縮，柱層析(石油醚：乙酸乙酯＝4：1)，得白色固體0.58g(收率50％):mp.161-163℃；MS(ESI)m/z:287.0[M+H]⁺,304.1[M+NH₄]⁺。

3)(3-苯磺酰基-4-氧-1,2,5-噁二唑-2-氧化物)丁二酸單乙酯化合物(式(Ⅳ))的制備

將3-苯磺?；?4-羥乙基醚-1,2,5-噁二唑-2-氧化物(0.58g,2.0mmol)溶于10ml二氯甲烷中，加入丁二酸酐(0.24g,2.4mmol)，依次加入DMAP(24mg,0.1mmol)和三乙胺(0.42ml,3.0mmol),室溫?cái)嚢?h，反應(yīng)液用質(zhì)量濃度為10％的鹽酸洗滌，無(wú)水Na₂SO₄干燥，過(guò)濾，濾液濃縮,柱層析(二氯甲烷：甲醇＝40:1)，得白色固體0.70g(收率91％)。

¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ2.71(s,4H),4.52(t,J＝7.8Hz,2H),4.62(t,J＝7.8Hz,2H),7.60(t,J＝7.5Hz,2H),7.74(t,J＝7.5Hz,1H),8.06(t,J＝8.1Hz,2H)；MS(ESI)m/z:387.0[M+H]⁺,404.1[M+NH₄]⁺。

4)13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)乙酯)-β-欖香烯的制備

將1mmol 13-β-欖香醇溶于10mL無(wú)水二氯甲烷中，依次加入1.2mmol 3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧丁二酸單乙酯、1.2mmol EDCI和0.1mmolDMAP，常溫反應(yīng)4h。反應(yīng)液以10％鹽酸洗滌3次后濃縮二氯甲烷層得淡黃色液體；然后以石油醚：乙酸乙酯＝4:1(V:V)柱層析，得到無(wú)色液體產(chǎn)物，產(chǎn)率為84％。

所述13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)乙酯)-β-欖香烯的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.13–8.01(m,2H),7.77(t,J＝7.5Hz,1H),7.64(t,J＝7.7Hz,2H),5.81(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.05(s,1H),5.01(s,1H),4.93(d,J＝3.3Hz,1H),4.88(d,J＝1.2Hz,1H),4.82(s,1H),4.66–4.57(m,5H),4.56–4.50(m,2H),2.72(s,4H),2.10–1.95(m,2H),1.71(s,3H),1.69–1.55(m,3H),1.53–1.40(m,3H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ171.53,171.38,158.18,149.50,147.70,146.88,137.51,135.19,129.20,128.14,111.77,110.43,109.56,68.35,65.93,60.92,52.10,41.21,39.28(2),32.48,28.49,28.40,26.51,24.33,16.07.

實(shí)施例2

13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的制備方法基本同實(shí)施例1，區(qū)別在于，將實(shí)施例1的步驟2)中的乙二醇替換為丁二醇。

本實(shí)施例制得無(wú)色液體產(chǎn)物，產(chǎn)率為85％。

所述13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.12–8.01(m,2H),7.77(dd,J＝10.7,4.3Hz,1H),7.63(t,J＝7.7Hz,2H),5.81(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.05(s,1H),5.01(s,1H),4.93(d,J＝3.4Hz,1H),4.88(d,J＝1.0Hz,1H),4.82(s,1H),4.61(s,2H),4.58(s,1H),4.46(t,J＝6.2Hz,2H),4.20(t,J＝6.2Hz,2H),2.76–2.62(m,4H),2.08–1.91(m,4H),1.90–1.75(m,3H),1.71(s,3H),1.69–1.55(m,3H),1.53–1.41(m,3H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ171.77,171.52,158.42,149.50,147.72,146.88,137.52,135.16,129.20,128.05,111.77,110.41,109.56,70.44,65.88,63.41,52.10,41.21,39.28(2),32.50,28.61,28.53,26.52,24.69,24.49,24.34,16.07.

實(shí)施例3

13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-6-氧)己酯)-β-欖香烯的制備方法基本同實(shí)施例1，區(qū)別在于，將實(shí)施例1的步驟2)中的乙二醇替換為己二醇。

本實(shí)施例制得無(wú)色液體產(chǎn)物，產(chǎn)率為87％。

所述13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-6-氧)己酯)-β-欖香烯的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.06(d,J＝7.5Hz,2H),7.76(t,J＝7.5Hz,1H),7.62(t,J＝7.9Hz,2H),5.81(dd,J＝17.7,10.5Hz,1H),5.05(s,1H),5.01(s,1H),4.93(d,J＝4.5Hz,1H),4.88(s,1H),4.82(s,1H),4.60(s,2H),4.58(s,1H),4.42(t,J＝6.5Hz,2H),4.12(t,J＝6.5Hz,2H),2.72–2.61(m,4H),2.09–1.96(m,2H),1.94–1.82(m,2H),1.71(s,3H),1.69–1.57(m,6H),1.51–1.42(m,6H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ172.19,171.92,158.93,149.90,148.17,147.26,138.07,135.50,129.55,128.42,112.17,110.86,109.94,71.33,66.26,64.45,52.57,41.67,39.71,39.64,32.94,29.09,29.01,28.37,28.23,26.95,25.36,25.18,24.70,16.51.

實(shí)施例4

13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)乙氧基乙酯)-β-欖香烯的制備方法基本同實(shí)施例1，區(qū)別在于，將實(shí)施例1的步驟2)中的乙二醇替換為二乙二醇。

本實(shí)施例制得無(wú)色液體產(chǎn)物，產(chǎn)率為82％。

所述13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)乙氧基乙酯)-β-欖香烯的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.14–8.03(m,2H),7.77(t,J＝7.5Hz,1H),7.63(t,J＝7.7Hz,2H),5.81(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.04(s,1H),5.00(s,1H),4.93(d,J＝3.6Hz,1H),4.88(s,1H),4.82(s,1H),4.65–4.52(m,5H),4.30(t,J＝4.7Hz,2H),3.92(t,J＝4.4Hz,2H),3.80(t,J＝4.7Hz,2H),2.69(s,4H),2.08–1.96(m,2H),1.71(s,3H),1.69–1.56(m,3H),1.54–1.41(m,3H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ171.79,171.48,158.41,149.51,147.72,146.87,137.51,135.18,129.19,128.08,111.76,110.38,109.55,70.03,68.86,67.84,65.83, 63.19,52.08,41.17,39.27(2),32.48,28.55,28.43,26.50,24.35,16.06.

實(shí)施例5

13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)-2-丁炔酯)-β-欖香烯的制備方法基本同實(shí)施例1，區(qū)別在于，將實(shí)施例1的步驟2)中的乙二醇替換為1,4-丁炔二醇。

本實(shí)施例制得無(wú)色液體產(chǎn)物，產(chǎn)率為76％。

所述13-O-(4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)-2-丁炔酯)-β-欖香烯的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.08(d,J＝7.9Hz,2H),7.77(t,J＝6.8Hz,1H),7.64(t,J＝7.1Hz,2H),5.82(dd,J＝17.2,10.7Hz,1H),5.10(s,2H),5.05(s,1H),5.02(s,1H),4.93(d,J＝3.8Hz,1H),4.88(s,1H),4.83(s,1H),4.77(s,2H),4.62(s,2H),4.59(s,1H),2.71(s,4H),2.09–1.95(m,2H),1.71(s,3H),1.64–1.54(m,3H),1.53–1.41(m,3H),1.01(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ171.65,171.35,157.86,149.91,148.14,147.27,137.81,135.64,129.64,128.57,112.20,110.95,109.97,83.74,78.61,66.39,58.52,52.59,52.04,41.70,39.73,39.66,32.96,28.90,28.74,26.97,24.70,16.53.

實(shí)施例6

13-O-(2-甲酰苯甲酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的制備方法基本同實(shí)施例1，區(qū)別在于，將實(shí)施例1的步驟2)中的乙二醇替換為丁二醇，將實(shí)施例1的步驟3)中的丁二酸酐替換為鄰苯二甲酸酐。

本實(shí)施例制得無(wú)色液體產(chǎn)物，得到無(wú)色液體產(chǎn)物，產(chǎn)率為81％。

所述13-O-(2-甲酰苯甲酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.16–7.99(m,2H),7.86–7.77(m,1H),7.77–7.65(m,2H),7.67–7.53(m,4H),5.82(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.15(s,1H), 5.07(s,1H),4.94(d,J＝3.4Hz,1H),4.89(d,J＝1.0Hz,1H),4.84(s,3H),4.59(s,1H),4.48(t,J＝5.9Hz,2H),4.41(t,J＝5.9Hz,2H),2.16–1.88(m,6H),1.71(s,3H),1.70–1.56(m,3H),1.55–1.42(m,3H),1.01(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ167.23,166.53,158.42,149.47,147.52,146.87,137.53,135.15,131.96,131.10,130.87,130.58,129.20,128.55,128.28,128.03,111.78,110.79,109.59,70.43,66.77,64.39,52.10,41.22,39.26(2),32.53,26.52,24.80,24.43,24.35,16.07.

實(shí)施例7

13-O-(S-3-氨基-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的制備方法如下：

1)中間體1、式(Ⅲ，3-苯磺?；?4-羥丁基醚-1,2,5-噁二唑-2-氧化物)的制備方法基本同實(shí)施例1，區(qū)別在于，將實(shí)施例1的步驟2)中的乙二醇替換為丁二醇；

2)將1mmol 13-β-欖香醇溶于10mL無(wú)水二氯甲烷，依次加入5mmol Boc-L-天冬氨酸、1.2mmol EDCI和0.1mmol DMAP，常溫?cái)嚢柘路磻?yīng)8h；反應(yīng)液以10％鹽酸洗滌3次，濃縮二氯甲烷層得中間體粗品，柱層析純化中間體粗品后將其溶于10mL無(wú)水二氯甲烷，依次加入1.1mmol 3-苯磺?；?4-羥丁基醚-1,2,5-噁二唑-2-氧化物、1.2mmol EDCI和0.1mmol DMAP，常溫反應(yīng)4h，反應(yīng)液以10％鹽酸洗滌3次，濃縮二氯甲烷層，柱層析純化后加入0.1ml三氟乙酸常溫反應(yīng)1h，減壓濃縮反應(yīng)液，所得產(chǎn)物粗品以二氯甲烷：甲醇＝50:1(V:V)柱層析純化，得到淡黃色液體產(chǎn)物，產(chǎn)率為42％。

所述13-O-(S-3-氨基-4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.12–8.00(m,2H),7.77(t,J＝7.5Hz,1H),7.63(t,J＝7.7Hz,2H),5.81(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.05(s,1H),5.03(s,1H),4.93(d,J＝3.1Hz,1H),4.88(d,J＝1.4Hz,1H),4.83(s,1H),4.64(s,2H),4.58(s, 1H),4.46(t,J＝6.1Hz,2H),4.21(t,J＝6.2Hz,2H),3.95–3.85(m,1H),2.92–2.71(m,2H),2.05(s,2H),2.03–1.90(m,4H),1.89–1.77(m,2H),1.71(s,3H),1.68–1.56(m,3H),1.54–1.42(m,3H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ173.28,170.63,158.42,149.41,147.46,146.83,137.50,135.16,129.20,128.04,111.79,110.77,109.61,70.41,66.43,63.55,52.10,50.77,41.25,39.24(2),38.25,32.50,26.51,24.69,24.47,24.34,16.07.

實(shí)施例8

13-O-(4-(3-氧代乙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的制備方法如下：

1)3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧丁二酸單丁酯(式Ⅳ))的制備同實(shí)施例2；

2)將1mmol 13-β-欖香醇溶于10mL無(wú)水二氯甲烷中，依次加入1.2mmolBoc-β-甘氨酸、1.2mmol EDCI和0.1mmol DMAP，常溫反應(yīng)6h后反應(yīng)液以10％鹽酸洗滌3次，濃縮二氯甲烷層，柱層析濃縮物，然后加入0.1ml三氟乙酸常溫反應(yīng)1h，減壓濃縮反應(yīng)液，將濃縮所得中間體溶于10mL無(wú)水二氯甲烷中，依次加入1.2mmol 3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧丁二酸單丁酯、1.2mmol EDCI和1.2mmol HBOt，常溫反應(yīng)4h，反應(yīng)液以10％鹽酸洗滌3次后濃縮二氯甲烷層，最后以石油醚：乙酸乙酯＝2:1(V:V)柱層析純化濃縮物，得到淡黃色液體產(chǎn)物，產(chǎn)率為45％。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.06(d,J＝7.3Hz,2H),7.76(t,J＝7.4Hz,1H),7.63(t,J＝7.6Hz,2H),6.19(s,1H),5.81(dd,J＝17.8,10.6Hz,1H),5.05(s,1H),5.03(s,1H),4.93(d,J＝3.3Hz,1H),4.88(s,1H),4.83(s,1H),4.65(s,2H),4.58(s,1H),4.46(t,J＝6.1Hz,2H),4.19(t,J＝6.2Hz,2H),4.08(d,J＝5.0Hz,2H),2.70(t,J＝6.4Hz,2H),2.58(t,J＝6.5Hz,2H),2.06–1.91(m,4H),1.87–1.81(m,2H),1.71(s,3H),1.68–1.55(m,3H),1.53–1.40(s,3H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ172.68,171.46,169.60,158.86,149.84,147.69,147.22,138.01,135.55,129.60,128.45,112.22,111.54,110.00,70.91,66.95,63.81,52.56,41.61,41.37,39.69,39.63,32.96,30.51,29.26,26.97,25.14,24.89,24.71,16.52.

實(shí)施例9

13-O-(4-(3-氧代丙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的制備方法基本同實(shí)施例8，區(qū)別在于，將步驟(2)中Boc-甘氨酸替換為Boc-β-丙氨酸。

本實(shí)施例制得淡黃色液體產(chǎn)物，產(chǎn)率為37％。

所述13-O-(4-(3-氧代丙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.14–7.99(m,2H),7.77(t,J＝7.5Hz,1H),7.64(t,J＝7.7Hz,2H),6.24(s,1H),5.81(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.04(s,1H),5.02(s,1H),4.93(d,J＝3.1Hz,1H),4.88(d,J＝1.4Hz,1H),4.83(s,1H),4.61(s,2H),4.58(s,1H),4.46(t,J＝6.2Hz,2H),4.18(t,J＝6.2Hz,2H),3.54(dd,J＝11.9,6.0Hz,2H),2.68(t,J＝6.7Hz,2H),2.59(t,J＝5.9Hz,2H),2.48(t,J＝6.7Hz,2H),2.06–1.91(m,4H),1.90–1.78(m,2H),1.71(s,3H),1.70–1.54(m,3H),1.53–1.40(m,3H),1.01(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ172.33,171.85,170.76,158.43,149.43,147.62,146.85,137.51,135.16,129.20,128.04,111.79,110.63,109.60,70.46,65.87,63.32,52.11,41.23,39.26(2),34.39,33.52,32.51,30.34,28.87,26.52,24.72,24.47,24.33,16.07.

實(shí)施例10

13-O-(4-(S-α-甲基)氧代乙胺-4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的制備方法基本同實(shí)施例8，區(qū)別在于，將步驟(2)中Boc-甘氨酸替換為Boc-L-丙氨酸。

本實(shí)施例制得淡黃色液體產(chǎn)物，產(chǎn)率為51％。

所述13-O-(4-(S-1-甲基)氧代乙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.06(d,J＝7.6Hz,2H),7.76(t,J＝7.4Hz,1H),7.63(t,J＝7.7Hz,2H),6.28(d,J＝6.9Hz,1H),5.81(dd,J＝17.7,10.6Hz,1H),5.05(s,1H),5.02(s,1H),4.93(d,J＝3.6Hz,1H),4.88(s,1H),4.82(s,1H),4.70–4.57(m,4H),4.46(t,J＝6.1Hz,2H),4.19(t,J＝6.0Hz,2H),2.73–2.63(m,2H),2.55(t,J＝6.5Hz,2H),2.03–1.93(m,4H),1.86–1.80(m,2H),1.70(s,3H),1.67–1.52(m,3H),1.49–1.41(m,6H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ172.59,172.53,170.85,158.74,149.72,147.67,147.09,137.88,135.47,129.51,128.31,112.10,111.16,109.88,70.81,66.76,63.67,52.47,48.03,41.55,39.58,39.51,32.84,30.47,29.16,26.87,25.01,24.77,24.60,18.15,16.42.

實(shí)施例11

13-O-(4-(S-1-(S-2-丁基)-2-氧代乙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的制備方法基本同實(shí)施例8，區(qū)別在于，將步驟(2)中Boc-甘氨酸替換為Boc-L-異亮氨酸。

本實(shí)施例制得淡黃色液體產(chǎn)物，產(chǎn)率為65％。

所述13-O-(4-(S-1-(S-2-丁基)-2-氧代乙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺酰基-1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.13–7.99(m,2H),7.77(t,J＝7.5Hz,1H),7.64(t,J＝7.7Hz,2H),6.25(d,J＝8.6Hz,1H),5.81(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.07(s,1H),5.03(s,1H),4.93(d,J＝3.4Hz,1H),4.88(d,J＝0.9Hz,1H),4.83(s,1H),4.72–4.61(m,3H),4.58(s,1H),4.45(t,J＝6.2Hz,2H),4.19(t,J＝6.2Hz,2H),2.81–2.64(m,2H),2.64–2.54(m,2H),2.11–1.78(m,7H),1.71(s,3H),1.67–1.53(m,3H),1.53–1.37(m,3H),1.32–1.11(m,2H),1.01(s,3H),0.96–0.88(m,6H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ172.31,171.26,170.62,158.42,149.43,147.27,146.81,137.51,135.17,129.20,128.03,111.79,111.27,109.60,70.46,66.45,63.37,56.01,52.15,41.00,39.26(2),37.51,32.45,30.34,28.90,26.46,24.70,24.57,24.46,24.34,16.06,14.98,11.18.

實(shí)施例12

13-O-(4-(S-1-芐基)-2-氧代乙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的制備方法基本同實(shí)施例8，區(qū)別在于，

將步驟(2)中Boc-甘氨酸替換為Boc-L-苯丙氨酸。

本實(shí)施例制得淡黃色液體產(chǎn)物，產(chǎn)率為58％。

所述13-O-(4-(S-1-芐基)-2-氧代乙胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.09–7.98(m,2H),7.76(t,J＝7.5Hz,1H),7.62(t,J＝7.7Hz,2H),7.35–7.18(m,3H),7.16–7.07(m,2H),6.17(d,J＝7.7Hz,1H),5.81(dd,J＝17.8,10.5Hz,1H),5.03(s,2H),4.99–4.80(m,4H),4.71–4.52(m,3H),4.45(t,J＝6.2Hz,2H),4.17(t,J＝6.2Hz,2H),3.22–3.06(m,2H),2.70–2.60(m,2H),2.51(t,J＝6.6Hz,2H),2.05–1.91(m,4H),1.88–1.72(m,2H),1.71(s,3H),1.69–1.55(m,3H),1.54–1.39(m,3H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ172.21,170.78,170.35,158.43,149.44,147.09,146.83,137.53,135.29,135.17,129.21,128.82,128.08,128.04,126.64,111.84,111.42,109.62,70.47,66.65,63.38,52.75,52.06,41.02,39.23(2),37.41,32.47,30.18,28.73,26.47,24.71,24.46,24.36,16.07.

實(shí)施例13

13-O-(4-(2-氧代-S-環(huán)戊胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的制備方法如下：

1)3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧丁二酸單丁酯(式(Ⅲ))的制備同實(shí)施例2；

2)將1.5mmol的3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧丁二酸單丁酯溶于10mL無(wú)水二氯甲烷中，依次加入2mmol草酰氯和1滴DMF，常溫反應(yīng)1.5h后濃縮反應(yīng)液，制得酰氯中間體；

3)將1mmol 13-β-欖香醇溶于10mL無(wú)水二氯甲烷中，依次加入1.2mmolBoc-L-脯氨酸、1.2mmol EDCI和0.1mmol DMAP，常溫反應(yīng)6h后反應(yīng)液以10％鹽酸洗滌3次，濃縮二氯甲烷層，柱層析濃縮物，然后加入0.1ml三氟乙酸常溫反應(yīng)1h，減壓濃縮反應(yīng)液，將濃縮所得中間體溶于10mL無(wú)水二氯甲烷中，依次加入1.5mmol三乙胺，0.1mmol DMAP和步驟(2)中制得的酰氯中間體，常溫反應(yīng)2h，反應(yīng)液以10％鹽酸洗滌3次后濃縮二氯甲烷層，最后以石油醚：乙酸乙酯＝2:1(V:V)柱層析純化濃縮物，得到淡黃色液體產(chǎn)物，產(chǎn)率為45％。

所述13-O-(4-(2-氧代-S-環(huán)戊胺)-4-氧代丁酸-(3-苯磺?；?1,2,5-噁二唑-2-氧化物-4-氧)丁酯)-β-欖香烯的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果如下：

¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.06(d,J＝7.4Hz,2H),7.76(t,J＝7.2Hz,1H),7.63(t,J＝7.7Hz,2H),5.81(dd,J＝17.7,10.5Hz,1H),5.04(s,1H),4.99(s,1H),4.92(d,J＝4.0Hz,1H),4.88(s,1H),4.82(s,1H),4.69–4.63(m,1H),4.61–4.52(m,3H),4.45(t,J＝6.1Hz,2H),4.18(t,J＝6.0Hz,2H),3.68–3.54(m,2H),2.83–2.54(m,4H),2.26–2.14(s,1H),2.07–1.90(m,7H),1.85–1.79(m,2H),1.70(s,3H),1.67–1.53(m,3H),1.52–1.39(m,3H),1.00(s,3H).

¹³C NMR(75MHz,CDCl₃)δ172.85,171.84,169.95,158.82,149.90,148.05,147.25,138.03,135.53,129.59,128.41,112.15,110.80,109.90,70.92,66.52,63.60,58.72,52.60,46.78,41.66,39.71,39.66,32.96,29.13,29.05,28.76,26.99,25.11,24.87,24.66,24.58,16.51.

藥效學(xué)試驗(yàn)

1體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)試驗(yàn)

1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑

儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州艾可林凈化設(shè)備有限公司)

恒溫CO₂培養(yǎng)箱(日本SANYO)

酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)BIO-RAD)

倒置生物顯微鏡(日本OLYMPUS)

試劑 青、鏈霉素混合液(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)

胰蛋白酶消化液(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)

PBS(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)

Calf Serum(杭州四季青生物工程材料有限公司)

DMEM(GIBCO)

MTT(BIOSHARP)

DMSO(SIGMA)

細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞SGC-7901(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)

人宮頸癌細(xì)胞HeLa(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)

人惡性膠質(zhì)瘤U87(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的受試細(xì)胞，經(jīng)消化、計(jì)數(shù)，以5×10⁴個(gè)/mL的濃度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔內(nèi)100μL(每孔4×10³個(gè)細(xì)胞)，于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)；

2)用10％Calf Serum/DMEM完全培養(yǎng)基稀釋待測(cè)藥物至不同濃度，每孔加入100μL相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組，溶媒對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組；于37℃繼續(xù)培養(yǎng)72h；

3)每孔加入20μL MTT(5mg/mL)溶液后于37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去上清液，每孔加入150μL DMSO溶解，室溫振蕩10分鐘后在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)量每個(gè)孔的吸光度值(OD值)，設(shè)A1(含200μL DMSO)為空白對(duì)照孔，以順鉑(CP)為陽(yáng)性對(duì)照孔；利用下列公式(1)求得腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率；所求結(jié)果代入IC₅₀計(jì)算軟件SPSS17.0，求出IC₅₀值，其IC₅₀結(jié)果如表1所示。

式(1)

1.3試驗(yàn)結(jié)果

表1實(shí)施例1-13的衍生物對(duì)3種人類癌細(xì)胞株抗增殖活性的IC₅₀值(μM)

體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)顯示，通過(guò)對(duì)β-欖香烯進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，所得衍生物對(duì)受試細(xì)胞系表現(xiàn)出了較好的抑制活性，所有衍生物活性均明顯強(qiáng)于欖香烯母核，并且大多化合物的活性強(qiáng)于陽(yáng)性藥順鉑。

2.一氧化氮體外釋放試驗(yàn)

2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑

儀器 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)BIO-RAD)

臥式恒溫?fù)u床(金壇市城西春蘭儀器廠)

試劑 磷酸二氫鉀(貨號(hào)10017628，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)

磷酸氫二鉀(貨號(hào)20032118，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)

磺胺(貨號(hào)30172216，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)

N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽(貨號(hào)80088013，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)

85％磷酸(貨號(hào)10015408，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)

亞硝酸鈉(貨號(hào)10020028，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)

L-半胱氨酸(貨號(hào)62007234，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)

DMSO(SIGMA)

2.2溶液的配制

1)pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)：50mM KH₂PO₄和50mM Na₂HPO₄溶于500mL蒸餾水中混勻；

2)空白溶液：10mL DMSO和190mL PBS混合；

3)Griess試劑：磺胺(sulfanilamide)4.0g、N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽0.2g和10mL 85％的H₃PO₄溶于90mL蒸餾水中，攪拌至澄清溶液；

4)L-半胱氨酸溶液：半胱氨酸精確稱量后，加入一定量的PBS，配制成200μM的溶液；

5)受試化合物溶液：受試化合物精確稱量，用DMSO溶解并稀釋至濃度為1mM，然后用PBS稀釋，使其濃度為200μM；

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

用空白溶液分別配制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度:0，0.78,1.56,3.13,6.25,12.5,25,50,100μmol/L，各個(gè)濃度每次取150μL，分別加入50μL的Griess試劑混勻，在37℃恒溫?fù)u床中孵化30min小時(shí)后，酶標(biāo)儀于540nm處測(cè)定各管吸光度，分別減去空白溶液讀數(shù)后回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

2.4試驗(yàn)方法

將配好的受試化合物溶液和L-半胱氨酸溶液各取2.5mL混合，在37℃恒溫?fù)u床中孵化120min，每個(gè)15min各取混合液150μL，分別加入50μL的Griess試劑混勻，在37℃恒溫?fù)u床中再孵化30min后，酶標(biāo)儀于540nm處測(cè)定各管吸光度，分別減去空白溶液讀數(shù)后將數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即求得NO釋放量。

2.5試驗(yàn)結(jié)果

記錄并統(tǒng)計(jì)實(shí)施例1-13制得的β-欖香烯衍生物于不同時(shí)間點(diǎn)的NO體外釋放結(jié)果(如下表2)。

表2實(shí)施例1-13制得的β-欖香烯衍生物的NO體外釋放結(jié)果

由表2數(shù)據(jù)可以看出，實(shí)施例1-13制得的β-欖香烯衍生物均具有優(yōu)異的體外NO釋放活性。

3體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)

3.1試驗(yàn)材料

雄性ICR小鼠5周,體重18-22g由上海靈暢生物科技有限公司提供

H22小鼠肝癌細(xì)胞 由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供

3.2試驗(yàn)方法

取ICR小鼠32只，收集培養(yǎng)的H22肝癌細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整使細(xì)胞懸液濃度為1.0×10⁷個(gè)/mL，于裸小鼠右側(cè)腋窩皮下每只接種0.1mL細(xì)胞懸液；將接種后的小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別記為模型組、β-欖香烯組、試驗(yàn)組(實(shí)施例1和實(shí)施例7)；所有小鼠均在接種第二天開(kāi)始以尾靜脈注射方式給藥，每天1次，持續(xù)21次，給藥21天后處理小鼠，通過(guò)手術(shù)剝離瘤塊，稱重。計(jì)算腫瘤抑制率(％)，用SPSS17.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，組間用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，其計(jì)算公式如下式(2)

式(2)

其中，β-欖香烯組和試驗(yàn)組溶液的配制方法如下：受試化合物用DMF溶解并配制成濃度為60mg/mL的母液，再將母液用溶媒(生理鹽水：DMF：Tween80＝88:10:2)稀釋至6mg/ml；

模型組是對(duì)小鼠注射同體積的溶媒；

β-欖香烯組是對(duì)小鼠注射β-欖香烯60mg/kg；

試驗(yàn)組是分別對(duì)小鼠注射由實(shí)施例1,實(shí)施例7制得的β-欖香烯衍生物60mg/kg。

3.3試驗(yàn)結(jié)果

各組小鼠體外抗腫瘤活性試驗(yàn)結(jié)果如下表3，

表3實(shí)施例1，實(shí)施例7制得的β-欖香烯衍生物體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)結(jié)果

由表3的數(shù)據(jù)明顯可以看出，本申請(qǐng)實(shí)施例1,實(shí)施例7制得的β-欖香烯衍生物具有優(yōu)異的體內(nèi)抗腫瘤活性，在相同給藥量的情況下，活性明顯優(yōu)于β-欖香烯；腫瘤生長(zhǎng)抑制率可超過(guò)61％。

上述實(shí)施例僅作為說(shuō)明的目的，本發(fā)明的范圍并不受此限制。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)進(jìn)行修改是顯而易見(jiàn)的，本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求范圍的限制。