本發(fā)明屬于藥物領(lǐng)域，涉及一種肺炎鏈球菌莢膜多糖的純化方法。
背景技術(shù)：
肺炎鏈球菌是一種成雙排列成矛頭狀的革蘭氏陽性球菌，目前發(fā)現(xiàn)90多個血清型，其中約30個血清型的菌株對人類有致病性，常常引起兒童和老年人感染。人感染該致病菌后可導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生，包括癥狀較輕的中耳炎以及嚴重的肺炎、球血病、腦膜炎、敗血癥等侵襲型疾病。感染肺炎鏈球菌是5歲以下兒童的主要死因，世界衛(wèi)生組織估計，全球每年因感染肺炎鏈球菌而致死的人數(shù)為160萬，絕大多數(shù)死亡病例發(fā)生在低收入國家。此外，肺炎鏈球菌耐藥問題在全世界越來越嚴重，臨床治療也變得越來越困難。因此，肺炎鏈球菌疫苗在感染防治中的作用越來越突出。
肺炎鏈球菌有三層外膜包括質(zhì)膜層、細胞壁層和莢膜層。研究結(jié)果表明莢膜多糖是肺炎鏈球菌的主要毒力因子，也是人類發(fā)現(xiàn)的第一種非蛋白抗原，是開發(fā)肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗和蛋白結(jié)合疫苗的最佳抗原。
由于肺炎鏈球菌莢膜多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜且穩(wěn)定性較差，在莢膜多糖的純化過程中需注意分離方法以及除雜方法的選用。蛋白質(zhì)的去除通常是用酚-氯仿反復(fù)抽提，有時需要在酚-氯仿中加入少許異戊醇，以降低表面張力，從而減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡。眾所周知，苯酚對人體和環(huán)境均有危害，并且苯酚是強腐蝕性的物質(zhì)，操作不便，在制品中的殘留量有嚴格的要求；同時由于工藝繁瑣，加上苯酚溶解的部分水相損失了很多莢膜多糖，所以回收率很低。因此，減少苯酚的使用量是必然的趨勢。對核酸雜質(zhì)的去除可采用低濃度乙醇沉淀或使用核酸酶進行酶解。常使用終濃度為25％的乙醇以及單價陽離子如鈉離子來沉淀核酸，由于乙醇易燃，對廠房和設(shè)備要求很嚴格。核酸酶酶解法常用脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶去除核酸，使用該方法去除核酸一般比較徹底，但核酸酶的價格比較昂貴，限制了該方法的大規(guī)模使用。
通過傳統(tǒng)的肺炎鏈球菌莢膜多糖純化方法可以獲得比較好的莢膜多糖，但是由于各種各樣的原因影響了這些純化方法的使用，因此開發(fā)新的方法成為亟待解決的問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種肺炎鏈球菌莢膜多糖的純化方法。
本發(fā)明提供的純化肺炎鏈球菌莢膜多糖的方法，包括如下步驟：
1)取肺炎鏈球菌培養(yǎng)液，將菌體滅活，離心收集上清液；
2)超濾，收集所得濾液；
3)調(diào)節(jié)步驟2)所得濾液的ph值為3～5，離心收集上清液；
4)調(diào)節(jié)步驟3)所得上清液中加入鈣鹽，調(diào)節(jié)ph值為堿性后，離心收集上清液；
5)向步驟4)所得上清液中加入沉淀劑進行沉淀，收集所得沉淀，洗滌，干燥，完成所述肺炎鏈球菌莢膜多糖的純化。
上述方法的步驟1)中，肺炎鏈球菌培養(yǎng)液是本領(lǐng)域技術(shù)人員按照現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)得到的肺炎鏈球菌培養(yǎng)液；如可按照如下方式培養(yǎng)而得：將肺炎鏈球菌接種于10％脫纖維羊血普通瓊脂培養(yǎng)基，于5％的co2環(huán)境中36℃靜止培養(yǎng)8h而得；滅活步驟所用滅活劑為脫氧膽酸鈉(doc)，滅活的ph值為7.0；所述滅活劑的加入量為使得含有肺炎鏈球菌菌體的料液中滅活劑的終濃度為0.1％～0.5％，具體可為0.12％；所述濃度為質(zhì)量百分濃度；
所述方法還可包括如下步驟：在所述步驟1)滅活步驟之后，離心步驟之前，將滅活所得體系按照如下方式a或方式b進行攪拌：a、室溫攪拌過夜；b、先進行一次攪拌，調(diào)節(jié)體系的ph值為酸性后再進行二次攪拌，靜置；
具體的，所述方式b一次攪拌步驟中，攪拌溫度為室溫；時間為8～12h；所述調(diào)節(jié)體系的ph值步驟中，ph值為6.6；所述二次攪拌步驟中，攪拌溫度為室溫；攪拌時間為25-35min或30min；所述靜置步驟中，時間為12-24h。
所述步驟2)中，所用超濾膜的截留分子量為100kda；
超濾所用緩沖液為磷酸鹽緩沖液(pb)；所述緩沖液的濃度為0.1～0.5m，ph值為7.0。所述緩沖液更具體為濃度為0.1～0.5m，ph值為7.0的磷酸鹽緩沖液(pb)；
該步驟的目的是為了去除含有肺炎鏈球菌菌體的料液中的培養(yǎng)基以及小分子量的雜質(zhì)；
為了提高超濾效果，在超濾之前，可將步驟1)所得上清液進行預(yù)過濾；所述預(yù)過濾步驟中，所用濾膜的孔徑具體可為0.45～0.8μm；
所述步驟3)中，ph值為4.0。
該步驟的目的是采用降低ph值的方法以除去與蛋白和核酸結(jié)合的doc，以及等電點為該ph值的蛋白等雜質(zhì)；
所述方法還包括如下步驟：在所述步驟3)中調(diào)節(jié)步驟2)所得濾液的ph值為3～5步驟之后，離心步驟之前，將濾液進行攪拌；所述攪拌步驟中，溫度具體可為室溫；時間具體可為25-35min，更具體可為30min；
所述步驟4)中，所述鈣鹽為氯化鈣的水溶液，具體可為質(zhì)量百分濃度為15-25％的氯化鈣的水溶液，更具體可為質(zhì)量百分濃度為20％的氯化鈣的水溶液；
所述鈣鹽的用量為使得加入鈣鹽后的體系中鈣鹽的終濃度為2.5-3.5％，具體可為3％；所述濃度為質(zhì)量百分濃度；
所述調(diào)節(jié)ph值為堿性步驟中，ph值為9.0。
該步驟的目的是通過加入鈣鹽形成與核酸和蛋白質(zhì)具有針對性吸附的ca(oh)2沉淀；
所述步驟5)沉淀步驟中，所述沉淀劑的加入量為使得加入沉淀劑后的體系中沉淀劑的終濃度為75-85％，具體可為80％；
所述洗滌步驟中，所用溶劑為無水乙醇和丙酮中的至少一種；
所述干燥步驟中，干燥方式為壓縮空氣吹干。
所述方法還包括如下步驟：在所述步驟4)之后，所述步驟5)加入沉淀劑進行沉淀步驟之前，將步驟4)所得上清液進行超濾換液。
具體的，所述將步驟4)所得上清液進行超濾換液步驟中，超濾所用緩沖液為氯化鈉的水溶液，具體可為濃度為0.3m的氯化鈉的水溶液；
所用超濾膜的截留分子量可依據(jù)肺炎多糖的分子量大小進行適當選擇，如具體可為50kda-100kda；
所用超濾膜的截留分子量為50kda-100kda；
超濾倍數(shù)為900-1100倍，具體可為1000倍。
該超濾步驟可根據(jù)肺炎鏈球菌的血清型不同而定；如對于血清型為7f、12f和15b的肺炎鏈球菌可不進行該超濾操作；而對于血清型為14、18c和23f的肺炎鏈球菌可進行該超濾操作。
上述步驟1)-步驟5)中，離心步驟均在低溫高速條件下進行，具體可在冷凍離心機中進行；具體的，所述低溫為-5℃-5℃；轉(zhuǎn)速具體可為9000-10000rpm。
本發(fā)明的有益效果在于：
1)本發(fā)明采用簡單易行的肺炎鏈球菌滅活方法，該方法只需要將配制好的doc母液加入到發(fā)酵液中攪拌即可。該方法具有很好的可控性和重復(fù)性、制備過程簡單、低環(huán)境污染，有利于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。
2)本發(fā)明僅需要四個步驟，第一步為超濾膜除去培養(yǎng)基以及小分子量的雜質(zhì)；第二步為采用降低ph來除去與蛋白和核酸結(jié)合的doc，以及等電點為該ph值的蛋白等雜質(zhì)；第三步為加入cacl2，并調(diào)節(jié)ph值至堿性，形成與核酸和蛋白質(zhì)具有針對性吸附的ca(oh)2沉淀；第四步為加入乙醇至終濃度80％，沉淀多糖。
3)本發(fā)明所使用試劑溫和，避免使用酚，氯仿等有毒試劑，以及價格昂貴的蛋白酶，核酸酶等試劑，對環(huán)境和人體幾乎無損傷。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實施例。所述方法如無特別說明均為常規(guī)方法。離心步驟均在冷凍離心機中進行；離心溫度為-5℃，轉(zhuǎn)速為10000rpm。下述實施例所用肺炎鏈球菌培養(yǎng)液可按照各種現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)而得；具體可按照如下方式培養(yǎng)而得：將肺炎鏈球菌接種于10％脫纖維羊血普通瓊脂培養(yǎng)基、5％co2環(huán)境中36℃培養(yǎng)8h而得。所述原材料如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑獲得。
實施例1
1)取血清型為7f的肺炎鏈球菌培養(yǎng)液，加入終濃度為0.12％的脫氧膽酸鈉(doc)，攪拌過夜，離心去除大顆粒雜質(zhì)，收集上清液；
2)使用截留分子量為100kda的超濾膜進行超濾換液，在超濾前，使用0.45～0.8μm的濾器進行預(yù)先過濾，超濾緩沖液使用0.1m的磷酸鹽緩沖液，ph值為7.0；
3)將超濾后所得濾液調(diào)節(jié)ph至4.0，置于冷庫中攪拌30min，高速冷凍離心保留上清液；
4)向上清液中加入質(zhì)量百分濃度為20％的cacl2水溶液至其在體系中的終濃度為3％，攪拌10～30min，調(diào)節(jié)ph至9.0左右，置于冷庫中攪拌30min，高速冷凍離心保留上清液；
5)向上清液中加入乙醇至終濃度為80％，此時有大量的多糖沉淀，置于冷庫中攪拌1～2h，離心收集多糖沉淀，使用無水乙醇和丙酮洗滌，壓縮空氣吹干即得精制莢膜多糖。
實施例2
取血清型為12f的肺炎鏈球菌培養(yǎng)液，加入終濃度為0.12％的脫氧膽酸鈉(doc)，攪拌過夜，離心去除大顆粒雜質(zhì)，收集上清液；并使用截留分子量為100kda的超濾膜進行超濾換液，在超濾前，使用0.45～0.8μm的濾器進行預(yù)先過濾，超濾緩沖液使用0.1m的磷酸鹽緩沖液，ph值為7.0左右；將超濾后樣品調(diào)節(jié)ph至4.0，置于冷庫中攪拌30min，高速冷凍離心保留上清液；向上清液中加入終濃度為3％的cacl2溶液，攪拌10～30min，調(diào)節(jié)ph至9.0左右，置于冷庫中攪拌30min，高速冷凍離心保留上清液；然后向上清液中加入乙醇至終濃度為80％，此時有大量的多糖沉淀，置于冷庫中攪拌1～2h，離心收集多糖沉淀，使用無水乙醇和丙酮洗滌，壓縮空氣吹干即得精制莢膜多糖。
實施例3
取血清型為14的肺炎鏈球菌培養(yǎng)液，加入終濃度為0.12％的脫氧膽酸鈉(doc)，攪拌過夜，離心去除大顆粒雜質(zhì)，收集上清液；并使用截留分子量為100kda的超濾膜進行超濾換液，在超濾前，使用0.45～0.8μm的濾器進行預(yù)先過濾，超濾緩沖液使用0.1m的磷酸鹽緩沖液，ph值為7.0左右；將超濾后樣品調(diào)節(jié)ph至4.0，置于室溫中攪拌30min，高速冷凍離心保留上清液；向上清液中加入終濃度為3％的cacl2溶液，攪拌10～30min，調(diào)節(jié)ph至9.0左右，置于室溫中攪拌30min，高速冷凍離心保留上清液；濾液使用50kda膜包進行超濾濃縮，超濾洗濾倍數(shù)約為1000倍，所使用緩沖液為0.5m的氯化鈉，然后向上清液中加入乙醇至終濃度為80％，此時有大量的多糖沉淀，置于室溫中攪拌1～2h，離心收集多糖沉淀，使用無水乙醇和丙酮洗滌，壓縮空氣吹干即得精制莢膜多糖。
實施例4
取血清型為15b的肺炎鏈球菌培養(yǎng)液，加入終濃度為0.12％的脫氧膽酸鈉(doc)，攪拌過夜，離心去除大顆粒雜質(zhì)，收集上清液；并使用截留分子量為100kda的超濾膜進行超濾換液，在超濾前，使用0.45～0.8μm的濾器進行預(yù)先過濾，超濾緩沖液使用0.1m的磷酸鹽緩沖液，ph值為7.0左右；將超濾后樣品調(diào)節(jié)ph至4.0，置于冷庫中攪拌30min，高速冷凍離心保留上清液；向上清液中加入終濃度為3％的cacl2溶液，攪拌10～30min，調(diào)節(jié)ph至9.0左右，置于室溫中攪拌30min，高速冷凍離心保留上清液；上清液使用3um濾器過濾去除小顆粒雜質(zhì)，然后向上清液中加入乙醇至終濃度為80％，此時有大量的多糖沉淀，置于室溫中攪拌1～2h，離心收集多糖沉淀，沉淀使用無水乙醇和丙酮分別洗滌兩次，使用無水乙醇和丙酮洗滌，壓縮空氣吹干即得精制莢膜多糖。
實施例5
取血清型為18c的肺炎鏈球菌培養(yǎng)液，加入終濃度為0.12％的脫氧膽酸鈉(doc)，攪拌過夜，離心去除大顆粒雜質(zhì)，收集上清液；并使用截留分子量為100kda的超濾膜進行超濾換液，在超濾前，使用0.45～0.8μm的濾器進行預(yù)先過濾，超濾緩沖液使用0.1m的磷酸鹽緩沖液，ph值為7.0左右；將超濾后樣品調(diào)節(jié)ph至4.0，置于室溫下攪拌30min，高速冷凍離心保留上清液；向上清液中加入終濃度為3％的cacl2溶液，攪拌10～30min，調(diào)節(jié)ph至9.0左右，置于室溫下攪拌30min，高速冷凍離心保留上清液；濾液使用100kda膜包進行超濾濃縮，超濾洗濾倍數(shù)約為1000倍，所使用緩沖液為0.5m的氯化鈉，然后向上清液中加入乙醇至終濃度為80％，此時有大量的多糖沉淀，置于室溫中攪拌1～2h，離心收集多糖沉淀，使用無水乙醇和丙酮洗滌，壓縮空氣吹干即得精制莢膜多糖。
實施例6
取血清型為23f的肺炎鏈球菌培養(yǎng)液，加入終濃度為0.12％的脫氧膽酸鈉(doc)，攪拌過夜，離心去除大顆粒雜質(zhì)，收集上清液；并使用截留分子量為100kda的超濾膜進行超濾換液，在超濾前，使用0.45～0.8μm的濾器進行預(yù)先過濾，超濾緩沖液使用0.1m的磷酸鹽緩沖液，ph值為7.0左右；將超濾后樣品調(diào)節(jié)ph至4.0，置于冷庫中攪拌30min，高速冷凍離心保留上清液；向上清液中加入終濃度為3％的cacl2溶液，攪拌10～30min，調(diào)節(jié)ph至9.0左右，置于室溫中攪拌30min，高速冷凍離心保留上清液；濾液使用100kda膜包進行超濾濃縮，超濾洗濾倍數(shù)約為1000倍，所使用緩沖液為0.3m的氯化鈉，然后向上清液中加入乙醇至終濃度為80％，此時有大量的多糖沉淀，置于室溫中攪拌1～2h，離心收集多糖沉淀，使用無水乙醇和丙酮洗滌，壓縮空氣吹干即得精制莢膜多糖。
將上述實施例1-6所得精制莢膜多糖按照如下方法進行雜質(zhì)含量檢測：核酸含量檢測方法參見中國藥典三部附錄iia紫外-可見分光光度法；蛋白質(zhì)含量檢測方法按照中國藥典三部附錄viblowry法；總氮含量參見中國藥典三部附錄via凱氏定氮法；磷含量檢測方法參見中國藥典三部附錄viia比色法。甲基戊糖按照歐洲藥典所述方法進行檢測。所得精制莢膜多糖中各雜質(zhì)及多糖成分含量如表1至表6所示。
表1、實施例1實驗結(jié)果
表2、實施例2實驗結(jié)果
表3、實施例3實驗結(jié)果
表4、實施例4實驗結(jié)果
表5、實施例5實驗結(jié)果
表6、實施例6實驗結(jié)果
由表可知，按照本發(fā)明提供的方法對肺炎鏈球菌中的莢膜多糖進行純化，莢膜多糖中各雜質(zhì)成分含量的檢測結(jié)果均符合歐洲藥典中關(guān)于各成分含量的限定值，多糖含量均高于標準限定值，且該方法具有很好的可控性和重復(fù)性、制備過程簡單、低環(huán)境污染，有利于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。
上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。