本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及藥理學(xué)，具體是指一種靶向血小板膜糖蛋白gpibα的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的單克隆抗體及其篩選方法。

背景技術(shù)：

血小板能夠促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，其促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的第一步及關(guān)鍵點(diǎn)是腫瘤細(xì)胞激活血小板形成瘤栓。血小板表面的多種粘附分子例如糖蛋白(glycoprotein,gp)ib-ix-v、gpiib-iiia等相互作用從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與血小板的粘附。其中g(shù)pibα是gpib-ix-v復(fù)合物中最大也是最重要的組成部分。有研究表明，敲除gpibα基因或替換gpibα胞外區(qū)的小鼠模型可顯著減少小鼠肺癌的肺部轉(zhuǎn)移，但會(huì)并發(fā)血小板減少癥(jains,zukam,liuj,etal.procnatlacadsciusa,2007,104(21))。另有研究表明，抗gpiib/iiia單克隆抗體可以有效阻斷血小板與腫瘤細(xì)胞的粘附和聚集，但存在潛在的出血并發(fā)癥也限制了這類單克隆抗體的應(yīng)用(amirkhosravia,mousasa,amayam,etal.thrombhaemost,2003,90(3):549-554))。因此，確立以gpibα為靶點(diǎn)，篩選出靶向gpibα抑制腫瘤轉(zhuǎn)移而不影響血小板數(shù)量及功能的抗體藥物，可能為腫瘤轉(zhuǎn)移帶來新的治療方法。

靶向血小板膜蛋白腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑的篩選模型是利用藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)：酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)，流式細(xì)胞術(shù)(fcm)等，建立篩選模型，以篩選出抑制腫瘤轉(zhuǎn)移而不影響血小板數(shù)量和功能的靶向血小板膜蛋白腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑。在對靶向血小板膜蛋白腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑的研究過程中至關(guān)重要。

在以往的的研究中，已有部分模型建立并應(yīng)用，但大部分模型是應(yīng)用于已明確其腫瘤轉(zhuǎn)移抑制功能的抑制劑的功能檢測，并不適用于在抑制劑篩選過程中的應(yīng)用。例如：在靶向血小板膜糖蛋白gpibα胞外區(qū)抗體a11(zhangw,dangs,hongt,etal.journalofthrombosis&haemostasis,2012,120(14))的研究中，利用熒光標(biāo)記腫瘤細(xì)胞建立檢測模型來檢測抗體作用下對血小板與腫瘤細(xì)胞粘附的影響。然而此模型未建立腫瘤細(xì)胞的乏氧-復(fù)氧模型來激活腫瘤細(xì)胞，模擬腫瘤細(xì)胞微環(huán)境，無法真實(shí)的模擬血小板與腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的粘附情況。另外，此模型是應(yīng)用于已確定抑制作用的抑制劑的功能檢測，未能應(yīng)用于待確定抑制作用抑制劑的篩選，需要進(jìn)行優(yōu)化，以建立篩選模型。另外，在靶向血小板膜糖蛋白gpibα胞外區(qū)抗體5g6(liangx,russellsr,estelles,etal.journalofthrombosis&haemostasis,2013,11(10))的研究中，已經(jīng)利用elisa建立了篩選模型以篩選特異性結(jié)合gpibα的抑制劑。然而此模型只適用于可以獲得大量人源血小板從而可以制備出純化gpibα的前提下，針對目前國內(nèi)的研究環(huán)境，大量人源血小板難以獲得，從而無法得到純化的血小板膜蛋白，因此此模型需要改進(jìn)。

建立靶向血小板膜蛋白gpibα腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑的篩選模型，可以在抑制劑的研發(fā)過程中，將無效樣品及早發(fā)現(xiàn)去除，增加研發(fā)效率，減少研發(fā)工作量。為了更好地建立篩選模型，更準(zhǔn)確的模擬血小板與腫瘤細(xì)胞作用微環(huán)境，以更方便精準(zhǔn)的篩選出抑制劑，需要對現(xiàn)有模型進(jìn)行優(yōu)化，克服其需要大量人源血小板，以及無法準(zhǔn)確模擬腫瘤微環(huán)境等缺點(diǎn)。另外需要從初步篩選，二次篩選，到功能驗(yàn)證，建立一系列完整的篩選模型，使篩選過程更加系統(tǒng)規(guī)范。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服上述缺陷和不足，提供了一種可顯著減少在獲得靶向血小板膜糖蛋白gpibα抑制劑過程中對人源血小板的需求、并最大程度在體外實(shí)驗(yàn)中活化腫瘤細(xì)胞模擬腫瘤細(xì)胞微環(huán)境、提高篩選準(zhǔn)確性、具有很好地臨床應(yīng)用前景的靶向血小板膜糖蛋白gpibα的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的單克隆抗體及其篩選方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明一方面提供了一種靶向血小板膜糖蛋白gpibα的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的單克隆抗體，其特點(diǎn)是，所述的單克隆抗體為特異性結(jié)合血小板膜蛋白gpibα的單克隆抗體。

較佳的，所述的單克隆抗體抑制腫瘤轉(zhuǎn)移且不影響血小板功能。

本發(fā)明另一方面提供了一種用于篩選靶向血小板膜糖蛋白gpibα的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑的方法，其主要特點(diǎn)是，所述的方法包括：

第一篩選模型，利用酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)初步篩選出靶向gpib-ix復(fù)合物的樣品；

第二篩選模型，利用免疫印跡法，在篩選所述的第一篩選模型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選出靶向gpibα的樣品；

第三篩選模型，利用連續(xù)光譜熒光儀測定樣品對血小板與腫瘤細(xì)胞粘附作用的影響，篩選出對兩者粘附具有抑制作用的抑制劑；

第四篩選模型，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測樣品對腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血小板活化的影響，以篩選出具有抑制作用的抑制劑；

第五篩選模型，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板活性蛋白表達(dá)，以篩選出不影響血小板數(shù)量及功能的抑制劑。

較佳的，所述的第一篩選模型具體包括：

采用elisa技術(shù)，依照雙抗體夾心法原理，首先將靶向血小板膜糖蛋白gpix的單克隆抗體吸附于酶標(biāo)板上，加入微量血小板裂解液，使其抓取其中的gpib-ix復(fù)合物，之后加入待篩選樣品，使其中的靶向gpib-ix復(fù)合物的樣品結(jié)合，最后加入酶標(biāo)記抗體后顯色，最終通過酶標(biāo)儀讀取od值，選取目標(biāo)孔，即初步篩選出靶向gpib-ix復(fù)合物的樣品。

較佳的，所述的第二篩選模型中通過最終條帶位置確定待篩選樣品與血小板裂解液的結(jié)合位置，篩選出靶向gpibα的樣品。

較佳的，所述的第三篩選模型中的腫瘤細(xì)胞為結(jié)腸癌細(xì)胞hct116、乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-231及肺癌細(xì)胞系a549，并且所述的腫瘤細(xì)胞經(jīng)缺氧24小時(shí)復(fù)氧2小時(shí)培養(yǎng)活化后與熒光染料標(biāo)記的血小板共孵育。

較佳的，所述的第四篩選模型中的血小板活化包括血小板活性蛋白p-selectin及pac-1的表達(dá)。

較佳的，所述的第五篩選模型中的血小板活性蛋白為血小板活性蛋白p-selectin及pac-1。

本發(fā)明的有益效果具體在于：

1)、靶向血小板膜糖蛋白gpibα的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑(yq3)可以有效抑制腫瘤細(xì)胞與血小板在體外的粘附，具有潛在的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，且yq3不影響血小板的正常狀態(tài)下的活化。

2)、第一篩選模型解決了對人源血小板大量需求的問題，在本發(fā)明提供的第一篩選模型中，單次篩選(篩選樣品數(shù)量為96個(gè))的人全血用量基本控制在3ml以內(nèi)，并且結(jié)合第二篩選模型，僅兩個(gè)實(shí)驗(yàn)就可準(zhǔn)確篩選出靶向血小板膜糖蛋白gpibα的樣品。

3)、第三篩選模型中腫瘤細(xì)胞在體外通過缺氧-復(fù)氧處理，模擬體內(nèi)的缺血-再灌注損傷。缺氧會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞活化及腫瘤血管生成，復(fù)氧過程會(huì)繼發(fā)細(xì)胞活化，產(chǎn)生自由基，生長因子，細(xì)胞因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶等產(chǎn)物，腫瘤細(xì)胞通過缺氧-復(fù)氧處理后，與血小板發(fā)生粘附作用更符合其體內(nèi)作用過程。

4)、第三篩選模型中將以往的通過熒光顯微鏡成像技術(shù)觀察熒光，更改為通過連續(xù)光譜熒光儀掃描讀數(shù)，使結(jié)果更加直觀，減少實(shí)驗(yàn)誤差，也避免了由于曝光時(shí)間過長而造成的熒光猝滅現(xiàn)象。

5)、本發(fā)明建立了一系列的篩選模型，可以將其整體應(yīng)用于之后所有的靶向血小板膜糖蛋白gpibα腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑的研究，其中五個(gè)獨(dú)立的篩選模型也可以分別應(yīng)用于篩選；第一篩選模型為利用酶聯(lián)免疫吸附測定建立的初步篩選模型，可獨(dú)立應(yīng)用于篩選出結(jié)合于血小板膜受體上的樣品，第二篩選模型為利用免疫印跡法建立的二次篩選模型，可獨(dú)立應(yīng)用于確定篩選樣品的靶向性，第三、第四篩選模型是利用流式細(xì)胞儀及連續(xù)光譜熒光儀建立的功能檢測模型，可聯(lián)合應(yīng)用于篩選出在體外實(shí)驗(yàn)中抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的樣品，第五篩選模型是利用流式細(xì)胞儀建立的功能檢測模型，可以獨(dú)立應(yīng)用于對不影響血小板正常活化的樣品的篩選。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的篩選方法流程圖。

圖2為本發(fā)明的yq3與人血小板膜糖蛋白gpib-ix復(fù)合物的結(jié)合示意圖。

圖3為本發(fā)明的yq3與人血小板膜糖蛋白gpibα的結(jié)合示意圖。

圖4為本發(fā)明的yq3對血小板與腫瘤細(xì)胞粘附的抑制作用示意圖。

圖5為本發(fā)明的yq3對腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血小板活化的抑制作用示意圖。

圖6a和圖6b為本發(fā)明的yq3對血小板正?；罨挠绊懯疽鈭D。

圖7為本發(fā)明的yq3抗體純度示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

為了能夠更清楚的理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說明。

經(jīng)建立的靶向血小板膜蛋白gpibα腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑篩選模型篩選，對分泌不同抗體的雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行檢測，最終篩選出靶向gpibα抗腫瘤轉(zhuǎn)移但不影響血小板正常功能的抗體yq3，抗體純化后純度如圖7所示，純度較高，具體方法包括：

第一篩選模型(初次篩選)：以酶聯(lián)免疫吸附(elisa)法為基礎(chǔ)，檢測樣品對血小板gpib-ix復(fù)合物的結(jié)合能力。以小鼠抗人血小板膜糖蛋白gpibα單克隆抗體vm16d為陽性對照，以血小板膜糖蛋白cd42a(gpix)單克隆抗體抓取血小板裂解液中g(shù)pib復(fù)合物作為抗原，以分泌不同抗體的雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗，以hrp標(biāo)記的山羊抗小鼠igg為二抗，a450波長下檢測吸光度。如圖2結(jié)果顯示，空白對照組為rpmi-164010％fbs培養(yǎng)基，陽性對照組為小鼠抗人血小板膜糖蛋白gpibα抗體vm16d單克隆抗體，pbs組作為vm16d組的空白對照。從圖2中可以看出，yq3與gpib-ix結(jié)合能力較強(qiáng)，其他待篩選抗體的結(jié)合能力均較弱，故數(shù)據(jù)未給出。

具體模型創(chuàng)建步驟為：

(1)、碳酸鹽緩沖液稀釋cd42c抗體至2μg/ml，4℃以下過夜(50μl/孔)；

(2)、用封閉緩沖液在室溫中封閉2h(200μl/孔)；

(3)、用洗滌緩沖液洗滌封閉板3次，200μl/孔，每次靜置3min；

(4)、加入100μl血小板裂解物，室溫下孵育2h；

(5)、洗滌緩沖液洗滌3次200μl/孔，每次靜置3min；

(6)、加入不同待篩選樣品，室溫孵育1小時(shí)；

(7)、洗滌緩沖液洗滌3次，200μl/孔，每次靜置3min；

(8)、用hrp-羊抗小鼠的lgg(1:5000，pbs稀釋，50μl/孔)在室溫下孵育1h；

(9)、洗滌緩沖液洗滌2次，200μl/孔，每次靜置3min；

(10)、加入底物tmb50μl，反應(yīng)15min；

(11)、加入30μl1m稀硫酸終止反應(yīng)，在450nm波長下讀取熒光，選取od值高的樣品為結(jié)合于gpib-ix復(fù)合物的樣品。od值越高，結(jié)合力越大。

第二篩選模型(二次篩選)：以westernblot實(shí)驗(yàn)檢測不同雜交瘤細(xì)胞上清中的抗體在血小板膜上的具體結(jié)合位置。以人血小板膜糖蛋白gpibα抗體vm16d單克隆抗體為陽性對照，β-actin為陰性對照，如圖3結(jié)果顯示yq3與vm16d的結(jié)合位置相近，為特異性結(jié)合于血小板膜糖蛋白gpibα。

具體模型創(chuàng)建步驟為：

(1)、準(zhǔn)備血小板裂解液，分別加入non-reducing和reducingloadingbuffer，95℃煮10min；

(2)、配置8％的分離膠，上樣量為60g，70v條件下至樣品跑至分離膠后轉(zhuǎn)為120v，120v條件下至樣品跑至結(jié)束；

(3)、300ma條件下轉(zhuǎn)膜2.5h，封閉后一抗(不同雜交瘤細(xì)胞上清)過夜；

(4)、二抗孵育2h后顯色。non-reducing條件下，結(jié)合位置為150kd左右，同時(shí)reducing條件下，結(jié)合位置為100kd左右的樣品為結(jié)合位點(diǎn)為gpibα的樣品。

第三篩選模型(功能檢測)：采用易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的肺癌細(xì)胞系a549作為研究的細(xì)胞模型。腫瘤細(xì)胞分別與熒光染料標(biāo)記的經(jīng)過不同激動(dòng)劑及抗體處理后的血小板共孵育，通過連續(xù)光譜熒光儀檢測血小板與腫瘤細(xì)胞的粘附。同樣以vm16d為陽性對照，pbs為vm16d組的空白對照；rpmi-164010％fbs培養(yǎng)基為樣品的空白對照。圖4結(jié)果顯示，yq3對血小板與腫瘤細(xì)胞的粘附具有較強(qiáng)抑制作用，其他待篩選樣品抑制能力均弱于yq3，故數(shù)據(jù)未給出。具體模型創(chuàng)建步驟為：

(1)、提前一天將hct116、a549或md231細(xì)胞以3*104/孔鋪板，乏氧箱培養(yǎng)24h，正常培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-4h。

(2)、純化后的血小板懸浮于苔氏液中，計(jì)數(shù)2*108/ml。

(3)、以大約5μmol/lbcecf溶液與血小板37℃孵育1h，dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗1次，懸于dmem無血清培養(yǎng)基中。

(4)、以大約2*107血小板每孔加入到96孔板中，100μl每孔。

(5)、熒光染料標(biāo)記的血小板在與腫瘤細(xì)胞結(jié)合前分別與不同雜交瘤細(xì)胞上清在室溫下共培養(yǎng)20min。

(6)、將處理過的血小板分別加入已有腫瘤細(xì)胞的96孔板中，培養(yǎng)4h。

(7)、dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗3次，洗去未粘附血小板，最后每孔加入100mlpbs。

(8)、連續(xù)光譜熒光儀檢測熒光，激發(fā)波長484，發(fā)射波長535。最終選取熒光值低的樣品為對血小板與腫瘤細(xì)胞粘附具有抑制作用的樣品。熒光值越低，抑制作用越強(qiáng)。

第四篩選模型(功能檢測)：以流式細(xì)胞儀檢測血小板活性蛋白(pac-1及p-selectin)的表達(dá)以篩選出對腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血小板活化有抑制作用的樣品。同樣以rpmi-164010％fbs培養(yǎng)基為空白對照，圖5結(jié)果顯示，p-selectin的陽性率從空白組的33.38％減少到22.1％，pac-1的陽性率從空白組的9.25％減少到4.049％，說明yq3對腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血小板活化的抑制作用。之前作為陽性對照的vm16d對于腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血小板活化沒有明顯的抑制作用，故數(shù)據(jù)未給出。

具體模型創(chuàng)建步驟為：

(1)、分別在96孔板對應(yīng)孔加入含有不同抗體的細(xì)胞上清，分別加入1μl50xcacl2/孔；

(2)、提取血小板，分別加入4～6*105血小板/孔，每孔50μl，室溫反應(yīng)20min；

(3)、胰酶消化腫瘤細(xì)胞，苔氏液調(diào)整密度至1～3*104個(gè)/100μl，每孔加入100μl，37℃反應(yīng)4h；

(4)、加入20μl標(biāo)記抗體(apc-p-selectin＝1μl，fitc-pac-1＝1μl，buffer＝18μl)，室溫反應(yīng)10min，加入220μl預(yù)冷的4％多聚甲醛到體系中，所有反應(yīng)被終止；

(5)、440μl的反應(yīng)體系加入流式管中，最終體系為400μl。流式細(xì)胞儀上檢測相關(guān)蛋白表達(dá)。樣品組的蛋白表達(dá)量與正常血小板蛋白表達(dá)量相比差異越大，說明樣品對腫瘤細(xì)胞對血小板活化的抑制作用越大。

第五篩選模型(功能檢測)：以流式細(xì)胞儀檢測血小板活性蛋白(pac-1及p-selectin)的表達(dá)以檢測抗體對血小板正?；钚约肮δ艿挠绊憽D6a和6b結(jié)果顯示thrombin作用下血小板活化明顯，而yq3熒光與nc組比較沒有明顯改變，說明yq3在體外對血小板正?；罨瘺]有明顯影響。

具體模型創(chuàng)建步驟為：

(1)、分別在96孔板對應(yīng)孔加入含有不同待篩選抗體的細(xì)胞上清及0.25u/mlthrombin，分別加入1μl50xcacl2/孔

(2)、提取血小板，分別加入4～6*105血小板/孔，每孔50μl，室溫反應(yīng)20min

(3)、加入20μl標(biāo)記抗體(apc-p-selectin＝1μl，fitc-pac-1＝1μl，buffer＝18μl)，室溫反應(yīng)10min，加入120μl預(yù)冷的4％多聚甲醛到50μl體系中，所有反應(yīng)被終止

(4)、在流式管中加入160μl預(yù)冷的pbs，將240μl的反應(yīng)體系加入流式管中，最終體系為400μl。流式細(xì)胞儀上檢測相關(guān)蛋白表達(dá)。樣品組結(jié)果與正常血小板蛋白表達(dá)相比，選取兩者差異小的樣品。樣品組的蛋白表達(dá)量與正常血小板蛋白表達(dá)量相比差異越小，說明樣品對血小板活性及功能影響越小。

本發(fā)明的有益效果具體在于：

1)、靶向血小板膜糖蛋白gpibα的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑(yq3)可以有效抑制腫瘤細(xì)胞與血小板在體外的粘附，具有潛在的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，且yq3不影響血小板的正常狀態(tài)下的活化。

2)、第一篩選模型解決了對人源血小板大量需求的問題，在本發(fā)明提供的第一篩選模型中，單次篩選(篩選樣品數(shù)量為96個(gè))的人全血用量基本控制在3ml以內(nèi)，并且結(jié)合第二篩選模型，僅兩個(gè)實(shí)驗(yàn)就可準(zhǔn)確篩選出靶向血小板膜糖蛋白gpibα的樣品。

3)、第三篩選模型中腫瘤細(xì)胞在體外通過缺氧-復(fù)氧處理，模擬體內(nèi)的缺血-再灌注損傷。缺氧會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞活化及腫瘤血管生成，復(fù)氧過程會(huì)繼發(fā)細(xì)胞活化，產(chǎn)生自由基，生長因子，細(xì)胞因子以及基質(zhì)金屬蛋白酶等產(chǎn)物，腫瘤細(xì)胞通過缺氧-復(fù)氧處理后，與血小板發(fā)生粘附作用更符合其體內(nèi)作用過程。

4)、第三篩選模型中將以往的通過熒光顯微鏡成像技術(shù)觀察熒光，更改為通過連續(xù)光譜熒光儀掃描讀數(shù)，使結(jié)果更加直觀，減少實(shí)驗(yàn)誤差，也避免了由于曝光時(shí)間過長而造成的熒光猝滅現(xiàn)象。

5)、本發(fā)明建立了一系列的篩選模型，可以將其整體應(yīng)用于之后所有的靶向血小板膜糖蛋白gpibα腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑的研究，其中五個(gè)獨(dú)立的篩選模型也可以分別應(yīng)用于篩選；第一篩選模型為利用酶聯(lián)免疫吸附測定建立的初步篩選模型，可獨(dú)立應(yīng)用于篩選出結(jié)合于血小板膜受體上的樣品，第二篩選模型為利用免疫印跡法建立的二次篩選模型，可獨(dú)立應(yīng)用于確定篩選樣品的靶向性，第三、第四篩選模型是利用流式細(xì)胞儀及連續(xù)光譜熒光儀建立的功能檢測模型，可聯(lián)合應(yīng)用于篩選出在體外實(shí)驗(yàn)中抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的樣品，第五篩選模型是利用流式細(xì)胞儀建立的功能檢測模型，可以獨(dú)立應(yīng)用于對不影響血小板正?；罨臉悠返暮Y選。

在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以做出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書和附圖應(yīng)被認(rèn)為是說明性的而非限制性的。