本發(fā)明涉及動物食品加工領(lǐng)域，更具體地，涉及一種具有ace抑制功能的牦牛骨蛋白肽及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

高血壓是對人類健康危害極大的一種疾病，潛伏期長。高血壓的早期階段，一般沒有明顯不適癥，直至發(fā)生臨床跡象心臟病發(fā)作、腦血管破裂而導(dǎo)致死亡。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensiniconvertingenzyme，ace)為腎素-血管緊張素系統(tǒng)的關(guān)鍵酶。血管緊張素原在腎素的作用下轉(zhuǎn)化為血管緊張素i，血管緊張素i在ace的作用下轉(zhuǎn)化為血管緊張素ii，刺激血管收縮，造成血壓上升。抑制ace的活性對降低血壓有著積極的作用，因而開發(fā)有效的ace抑制劑引起人們的極大關(guān)注。雖然來源于食物的ace抑制肽比人工合成的ace抑制劑作用弱，但是它有其獨特的優(yōu)點，不會產(chǎn)生降壓過度的問題，安全性高，無副作用，除降壓功能外，往往同時具有免疫促進(jìn)、易消化吸收等功能。由于藥物療法存在副作用，天然食物中的降血壓功能因子的開發(fā)利用將成為今后高血壓非藥物治療的重要部分。

現(xiàn)有技術(shù)中有利用魚類資源或蛤類制備ace抑制肽的方法，如中國專利cn106399435a公開了一種利用魚鱗制備ace抑制肽的方法，該方法包括將魚鱗水洗去雜質(zhì)后，用nacl溶液浸泡1-2天，脫除雜蛋白和魚銀粉，將魚鱗撈出后再用hcl溶液、料液比1:10-1:20，浸泡1-2h，以脫除鈣鹽等無機(jī)鹽；將魚鱗用蒸餾水浸泡溶脹，接著用堿性蛋白酶酶解，然后離心，上清液為酶解液，將酶解液冷凍干燥得到ace抑制肽；所得到的產(chǎn)品ace抑制率較高，與化學(xué)合成的ace抑制肽相比，制備的ace抑制肽安全無毒、易于消化；如中國專利cn104593466a公開了一種利用內(nèi)源酶制備藍(lán)蛤蛋白源ace抑制肽的方法，該方法利用藍(lán)蛤體內(nèi)的內(nèi)源性蛋白酶進(jìn)行酶解，通過自溶獲得天然ace抑制肽，制備過程中不加入任何外源蛋白酶，整個制備過程包括新鮮藍(lán)蛤預(yù)處理、勻漿、內(nèi)源酶激活、酶爭、滅酶、脫腥、離心、冷凍干燥；也有報道采用羅非魚魚皮及植物蛋白為原料生產(chǎn)ace抑制肽，如中國專利cn101240312a公開了一種源于魚皮的ace抑制肽的制備方法，該方法實現(xiàn)羅非魚廢棄物的綜合利用，具體以羅非魚魚皮為原料，水提羅非魚魚皮中的魚皮蛋白，采用蛋白酶進(jìn)行水解，經(jīng)滅酶、脫苦、脫色、脫味、過濾、離子交換和濃縮等工序得到魚皮蛋白酶解液(tsp-1)，將tsp-1超濾處理后，再經(jīng)凝膠層收集高活性組分，冷凍干燥制得高活性的ace抑制肽產(chǎn)品；中國專利cn104131055a公開了一種藻紅蛋白ace抑制肽的制備方法，該方法包括藻紅蛋白的提取步驟，加入胃蛋白酶酶解再加入胰蛋白酶酶解；將酶解后的凍干粉溶于純水，上樣于sephadexg-15凝膠柱，收集活性最高峰為藻紅蛋白ace抑制組分。將所述組分繼續(xù)上樣于高效液相色譜zorbax300sb-c18柱進(jìn)行分離，以檢測該組分中藻紅蛋白ace抑制肽制備，該發(fā)明的方法可以避免活性肽經(jīng)人體攝入后被胃腸道消化液降解而失活，同時縮減了成本。

但這些制備方法中通常采用通過添加酸、堿調(diào)節(jié)ph,影響產(chǎn)品的品質(zhì)，同時對蛋白肽的主要組成不明確。我國牦牛骨資源豐富，目前國內(nèi)外專利中未見利用牦牛骨蛋白資源制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的專利文獻(xiàn)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種具有ace抑制功能的牦牛骨蛋白肽及其制備方法和應(yīng)用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供了一種具有ace抑制功能的牦牛骨蛋白肽，該牦牛骨蛋白肽為牦牛骨蛋白經(jīng)過復(fù)合蛋白酶分步酶解的酶解物制得；其中，復(fù)合蛋白酶為堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。

使用本發(fā)明特定的復(fù)合蛋白酶對牦牛骨蛋白分布酶解，得到的肽具有ace抑制活性，合理地且有效地利用了牦牛骨蛋白。

為了得到較純的牦牛骨蛋白肽，使用上述復(fù)合蛋白酶的分布酶解優(yōu)選包括以下步驟：

調(diào)節(jié)牦牛骨蛋白液中蛋白含量為8-10wt％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.4～1.0wt％的重量百分比加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解。

為了提高得到的牦牛蛋白肽的抑制活性，在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，使用上述復(fù)合蛋白酶分布酶解具體包括以下步驟：

第一步酶解反應(yīng)：向蛋白重量8-10wt％的牦牛骨蛋白液中加入0.2～0.5wt％第一復(fù)合蛋白酶，在50～60℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)0.5～1.5h，其中，第一復(fù)合蛋白酶為堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶；

第二步酶解反應(yīng)：向第一步酶解反應(yīng)產(chǎn)物中加入0.2～0.5wt％第二復(fù)合蛋白酶，在45～55℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0～2.0h，其中，第二復(fù)合蛋白酶為胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，第一復(fù)合蛋白酶中堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為1～2:1。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，第二復(fù)合蛋白酶中胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為1:1～2。

為了進(jìn)一步提高得到的牦牛蛋白肽的抑制活性，在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，牦牛骨蛋白肽的制備方法包括如下步驟：

1)牦牛骨蛋白液的制備；

2)將步驟1)制得的牦牛骨蛋白液經(jīng)過復(fù)合蛋白酶分步酶解；

3)將步驟2)酶解后的產(chǎn)物除雜、膜分離、凝膠分離以及反相hplc分離，濃縮，冷凍干燥后即得。

該制備方法中不添加任何酸和堿。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，步驟1)中還包括將制得的牦牛骨蛋白液在75-85℃下，經(jīng)頻率為80-100kh的超聲波超聲處理15-25分鐘。在該條件下，可以有效地改變牦牛骨膠原蛋白的組織結(jié)構(gòu)，利用在該溫度下特定的頻率超聲波技術(shù)處理的牦牛骨蛋白液，可以明顯改善牦牛骨蛋白對酶的敏感性，有效地降低酶的使用量。

在步驟3)中，可以使用本領(lǐng)域中通用的除雜方法，為了得到抑制活性更好的多肽，在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，步驟3)中的除雜具體為：

在90～95℃下保溫10～20分鐘，冷卻至室溫，加入酶解液重量0.2-0.6wt％的活性炭于酶解液中，通過硅藻土進(jìn)行分離，收集分離液。

在該優(yōu)選實施方式中，通過使用活性炭除雜，使得蛋白肽具有良好的風(fēng)味和色澤，能廣泛應(yīng)用于特需食品、藥物以及營養(yǎng)食品中。

為了使得到的牦牛骨蛋白液的抑制效果更好，步驟3)中膜分離可以具體為：步驟3)中膜分離具體可以為：

將除雜后的產(chǎn)物通過兩步超濾方法進(jìn)行處理，先后利用孔徑為5000道爾頓的膜和孔徑為3000道爾頓的膜進(jìn)行超濾。

進(jìn)一步優(yōu)選地，膜分離的步驟為：

將得到的分離液通過二步超濾方法進(jìn)行處理，利用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于5000道爾頓的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，步驟3)中凝膠分離和反相hplc可以為：

將膜分離后的產(chǎn)物經(jīng)過sephadexg-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測，收集第2個洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到牦牛骨蛋白肽粗品；再用rp-hplc反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，收集經(jīng)過rp-hplc反相高效液相色譜分離中16-18分中的肽洗脫液。

將所得到的肽洗脫液濃縮，冷凍干燥，即可得到本發(fā)明最優(yōu)選的牦牛骨蛋白肽。

本發(fā)明的牦牛骨蛋白肽的ace抑制活性(ic50值)小于0.32g/ml，當(dāng)?shù)鞍纂牡臐舛葹?.0mg/ml時，ace抑制率可達(dá)80％以上，優(yōu)選90％以上。

本發(fā)明從牦牛骨蛋白中提取得到的牦牛骨蛋白肽中分子量低于1000的肽的比例為90％以上。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，使用上述方法制備得到的牦牛骨多肽包括具有如下氨基酸序列的多肽：

glu-ile-arg-met-leu(giaml，如seqidno.1所示)。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，使用上述方法制備得到的牦牛骨多肽包括具有如下氨基酸序列的多肽：

thr-val-ser-leu-pro-arg(tvslpa，如seqidno.2所示)

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，使用上述方法制備得到的牦牛骨多肽包括具有如下氨基酸序列的多肽：ser-pro-ile-leu-gly-tyr-trp(spilgtt，如seqidno.3所示)。

含有上述3種多肽中任一種的牦牛骨蛋白肽均具有較好的ace抑制功能，ace抑制活性(ic50值)小于0.32g/ml。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，牦牛骨蛋白肽中活性成分包括上述3種多肽，進(jìn)一步優(yōu)選地，活性成分為上述3種多肽的組合，進(jìn)一步優(yōu)選地，上述3種肽的組合的含量在50％以上。

本發(fā)明的牦牛骨蛋白肽可以為粉末狀。

為了使整個加工過程更加簡單且不用添加酸或堿進(jìn)行ph的調(diào)整，步驟1)中的牦牛骨蛋白液是以牦牛骨為原料，經(jīng)高溫蒸煮和去脂得到的。

即本發(fā)明還提供了上述牦牛骨蛋白肽的制備方法，包括以下步驟：

1)以牦牛骨為原料，經(jīng)高溫蒸煮和去脂得到牦牛骨蛋白液；

2)將步驟1)制得的牦牛骨蛋白液經(jīng)過復(fù)合蛋白酶分步酶解；

3)將步驟2)酶解后的產(chǎn)物除雜、膜分離、凝膠分離以及反相hplc分離，濃縮，冷凍干燥后即得。

其中，步驟2)和步驟3)的進(jìn)一步優(yōu)選方案參照上述內(nèi)容。

在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，步驟1)中牦牛骨蛋白液的制備具體可以為：

選用冷凍鮮牦牛骨，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,牦牛骨清洗后將牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨顆?？偭?.0～3.0倍的水在125-135℃條件下處理2-5小時，然后通過離心過濾得到去骨渣的牦牛骨高溫蒸煮液，冷卻到15-30℃，通過分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。

為了保持較好的功能特性，較易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，牦牛骨蛋白肽的制備方法具體可以為：

1)選用冷凍鮮牦牛骨，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎將牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨顆?？偭?.0～3.0倍的水在125-135℃條件下處理2-5小時，然后通過離心過濾得到去骨渣的牦牛骨高溫蒸煮液，冷卻到15-30℃，通過分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液；

將1)得到的牦牛骨蛋白液，溫度調(diào)整到75-85℃，利用超聲波發(fā)生器經(jīng)超聲波(頻率為80-100kh)處理15-25分鐘，改變牦牛骨膠原蛋白的組織結(jié)構(gòu)。

2)調(diào)節(jié)牦牛骨蛋白液中蛋白含量為8-10wt％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.4～1.0wt％的重量百分比加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解：

第一步利用0.2～0.5wt％復(fù)合蛋白酶一(堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶)組成，它們之間的質(zhì)量比為1～2：1)，在50～60℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)0.5～1.5h；

然后進(jìn)行第二步利用0.2～0.5％復(fù)合蛋白酶二(胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1：1～2)，在45～55℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0～2.0h；

3)除雜：在90～95℃下保溫10～20分鐘，冷卻至室溫，加入酶解液重量0.2-0.6wt％的活性炭于酶解液中，通過硅藻土進(jìn)行分離，收集分離液；

膜分離：將步驟(3)所得的分離液通過二步超濾方法進(jìn)行處理，利用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于5000道爾頓的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。

凝膠分離以及反相hplc分離：取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經(jīng)過sephadexg-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測，收集第2個洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到牦牛骨蛋白肽；再用rp-hplc反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，收集經(jīng)過rp-hplc反相高效液相色譜分離中16-18分中的肽洗脫液；

將得到的肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到牦牛骨蛋白肽粉。

由上述制備方法得到牦牛骨蛋白肽分子量低于1000的肽的比例為90％以上。

本發(fā)明還提供了上述牦牛骨蛋白肽以及上述制備牛骨蛋白肽的方法在制備預(yù)防或治療受益于ace抑制的疾病的藥物或食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的牦牛蛋白肽可以作為藥物，或是膳食補充劑，或作為食品基料加入到普通食品如飲料、乳制品等中，本發(fā)明的藥物或食品可用于治療高血壓等能夠用ace抑制劑治療的其他疾病。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)較高或較低的ic50值結(jié)合治療對象的實際情況，來合理調(diào)整使用的劑量。

本發(fā)明從牦牛骨蛋白中提取的牦牛骨蛋白肽具有優(yōu)異的ace抑制功能，ace抑制活性(ic50值)小于0.32mg/ml；本發(fā)明開發(fā)的牦牛骨蛋白肽制備方法簡單，整個加工過程中沒有添加酸或堿進(jìn)行ph的調(diào)整，產(chǎn)品保持較好的功能特性，較易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；本發(fā)明開發(fā)的產(chǎn)品安全，本發(fā)明采用多種食品級特定的復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶)，經(jīng)在溫和條件下，經(jīng)過適度酶解獲得特定分子量的肽組成的牦牛骨蛋白肽，不加任何添加劑，為100％牦牛骨蛋白肽。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)手段。若未特別指明，實施例中所用的試劑為市售。

實施例1具有ace抑制功能的牦牛骨蛋白肽的制備方法

(1)選用冷凍鮮牦牛骨100克，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎機(jī)將牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨顆?？偭?倍的水在125℃條件下處理4小時，通過離心過濾得到去骨渣的牦牛骨蒸煮液，冷卻到20℃，通過分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。

(2)將(1)得到的牦牛骨蛋白液，溫度調(diào)整到80℃，利用超聲波發(fā)生器經(jīng)超聲波(頻率為85kh)處理15分鐘。

(3)調(diào)節(jié)牦牛骨蛋白液中蛋白含量為8％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.8％的重量百分比加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，第一步利用0.4％復(fù)合蛋白酶一(堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為1：1)，在55℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.5h；然后進(jìn)行第二步利用0.4％復(fù)合蛋白酶二(胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為1：2)，在50℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0h；在95℃下保溫10分鐘，冷卻至室溫，加入酶解液重量0.2％的活性炭于酶解液中，通過硅藻土進(jìn)行分離，收集分離液；

(4)將步驟(3)所得的分離液利用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于5000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。

(5)取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經(jīng)過sephadexg-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測，收集第2個洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到經(jīng)過凝膠分離的牦牛骨蛋白肽；再用rp-hplc反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，取16-18分收集的肽溶液；

(6)將步驟(5)得到的肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到具有ace抑制功能的骨膠原蛋白肽粉。通過lc-ms/ms對骨膠原蛋白肽的主要成分進(jìn)行測定，其氨基酸序列為glu-ile-arg-met-leu，thr-val-ser-leu-pro-arg，ser-pro-ile-leu-gly-tyr-trp的肽的含量為50.9％。

實施例2具有ace抑制功能的牦牛骨蛋白肽的制備方法

(1)選用冷凍鮮牦牛骨500克，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎機(jī)將牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨顆?？偭?.5倍的水在130℃條件下處理3小時，通過離心過濾得到去骨渣的牦牛骨蒸煮液，冷卻到25℃，通過分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。

(2)將(1)得到的牦牛骨蛋白液，溫度調(diào)整到82℃，利用超聲波發(fā)生器經(jīng)超聲波(頻率為90kh)處理20分鐘。

(3)調(diào)節(jié)牦牛骨蛋白液中蛋白含量為9％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量1.0％的重量百分比加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，第一步利用0.4％復(fù)合蛋白酶一(堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量比為1：1)，在50℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.5h；然后進(jìn)行第二步利用0.6％復(fù)合蛋白酶二(胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為1：1)，在50℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0h；在95℃下保溫10分鐘，冷卻至室溫，加入酶解液重量0.4％的活性炭于酶解液中，通過硅藻土進(jìn)行分離，收集分離液；

(4)將步驟(3)所得的分離液利用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于5000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。

(5)取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經(jīng)過sephadexg-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測，收集第2個洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到經(jīng)過凝膠分離的牦牛骨蛋白肽；再用rp-hplc反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，取16-18分收集的肽溶液；

(6)將步驟(5)得到的肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到具有ace抑制功能的骨膠原蛋白肽粉。通過lc-ms/ms對骨膠原蛋白肽的主要成分進(jìn)行測定，其氨基酸序列為glu-ile-arg-met-leu，thr-val-ser-leu-pro-arg，ser-pro-ile-leu-gly-tyr-trp的肽的含量為51.8％。

實施例3具有ace抑制功能的牦牛骨蛋白肽的制備方法

(1)選用冷凍鮮牦牛骨1000克，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎機(jī)將牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨顆粒總量3.0倍的水在132℃條件下處理3小時，然后通過離心過濾得到去骨渣的牦牛骨高溫蒸煮液，冷卻到25℃，通過分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。

(2)將(1)得到的牦牛骨蛋白液，溫度調(diào)整到85℃，利用超聲波發(fā)生器經(jīng)超聲波(頻率為90kh)處理25分鐘。

(3)調(diào)節(jié)牦牛骨蛋白液中蛋白含量為9％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.6％的重量百分比加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，第一步利用0.3％復(fù)合蛋白酶一(堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為2：1)，在60℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0h；然后進(jìn)行第二步利用0.3％復(fù)合蛋白酶二(胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1：1)，在50℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)2.0h；在90℃下保溫20分鐘，冷卻至室溫，加入酶解液重量0.6％的活性炭于酶解液中，通過硅藻土進(jìn)行分離，收集分離液；

(4)將步驟(3)所得的分離液通過二步超濾方法進(jìn)行處理，利用孔徑為5000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于5000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。

(5)取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經(jīng)過sephadexg-25凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測，收集第2個洗脫峰；通過濃縮、冷凍干燥，得到經(jīng)過凝膠分離的牦牛骨蛋白肽；再用rp-hplc反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，取16-18分收集的肽溶液；

(6)將步驟(5)得到的肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到具有ace抑制功能的骨膠原蛋白肽粉。通過lc-ms/ms對骨膠原蛋白肽的主要成分進(jìn)行測定，其氨基酸序列為glu-ile-arg-met-leu，thr-val-ser-leu-pro-arg，ser-pro-ile-leu-gly-tyr-trp的肽的含量為52.6％。

實施例4牦牛骨蛋白肽血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ace)抑制能力的測定試驗

試驗樣品：實施例1、實施例2、實施例3制備的牦牛骨蛋白肽及樣品4為實施例1的牦牛骨蛋白液經(jīng)過冷凍干燥達(dá)到的牦牛骨蛋白粉。ace抑制能力按照如下方法進(jìn)行：

ace抑制率的方法。用高效液相色譜可以在228nm下定量檢測釋放出的hip量，從而計算出多肽的ace抑制率。

1、試劑的配置

ph8.3的磷酸鹽緩沖溶液：用超純水配制，其中含磷酸鹽50mmol/l，nacl300mmol/l，調(diào)整ph到8.3；

ace酶液：將2ml的磷酸鹽緩沖液加入1u的ace中，使其濃度變?yōu)?.5u/ml。

hhl溶液：使用磷酸緩沖液溶解hhl，使其終濃度為5mmol/l。

樣品溶液：稱取適量樣品，用磷酸鹽緩沖液所需濃度的溶液。

2、ace抑制率測定的色譜條件

檢測波長：228nm；流速:1ml/min；流動相a:超純水(含0.1％三氟乙酸)，流動相b:甲醇(含0.1％三氟乙酸)；進(jìn)樣量:10μl，手動進(jìn)樣；

3、測定ace抑制活性的方法

取120μlhhl底物溶液，加入20μl的樣品混合均勻，在37℃恒溫水浴中保溫10min。然后加入10μlace酶液在37℃恒溫水浴中反應(yīng)30min，再加入150μl1mol/l的hcl終止反應(yīng)，得到反應(yīng)液。該反應(yīng)液利用hplc進(jìn)行分析，同時設(shè)置空白對照組。ace抑制活性計算公式如下：

ace抑制活性％＝(m-n)/m×100,

式中，m為對照組中馬尿酸的峰面積，n為添加的樣品組中馬尿酸的峰面積。

4、半抑制濃度的測定

按照ace抑制肽體外檢測方法測定其抑制活性，以濃度為橫坐標(biāo)，ace抑制率為縱坐標(biāo)繪成圓滑的曲線，從曲線中計算出ic50值。結(jié)果見表1。

5、牦牛骨蛋白肽中分子量分布的測定：參照gb/t22729-2008方法測定。

由表1可知，本發(fā)明制備的牦牛骨蛋白肽具有很好的ace抑制活性，其ic50值小于0.32mg/ml，牦牛骨蛋白肽中分子量小于1000的達(dá)到90％以上。

表1牦牛骨蛋白肽的ace抑制活性實驗結(jié)果

最后，本發(fā)明的方法僅為較佳的實施方案，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>安徽國肽生物科技有限公司

<120>具有ace抑制功能的牦牛骨蛋白肽及制備方法和應(yīng)用

<130>khp171112765.1

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>5

<212>prt

<213>牦牛骨

<400>1

gluileargmetleu

15

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<213>牦牛骨

<400>2

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15

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<212>prt

<213>牦牛骨

<400>3

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