本發(fā)明涉及分離提純技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種提純蛋白酶解物中小分子多肽的方法。

背景技術(shù)：

多糖普遍存在于動(dòng)物、植物及微生物中，種類繁多，功能廣泛。常規(guī)的蛋白資源，如大豆蛋白、大米蛋白和谷朊粉等，一般均含有較多的多糖，其中一部分多糖以游離多糖的形式存在，另一部分多糖則與蛋白結(jié)合，糖鏈和肽鏈中的氨基酸殘基通過(guò)共價(jià)連接，形成糖蛋白。糖蛋白中的糖鏈可分為2大類，n-連接的糖鏈和o-連接的糖鏈，n-糖鏈連接在asn-x-thr/ser序列中，其中的x為脯氨酸以為的任意氨基酸殘基，o-糖鏈的結(jié)構(gòu)比n-糖鏈簡(jiǎn)單，連接位點(diǎn)為n-糖鏈多，常出現(xiàn)在絲氨酸、蘇氨酸、羥賴氨酸、羥脯氨酸等氨基酸殘基。有些蛋白的糖基比例非常高，可在糖基鏈上形成支鏈，糖蛋白中糖鏈一般含有10~15個(gè)單糖單位，大部分分布在細(xì)胞膜上，具有識(shí)別功能。

近年來(lái)，利用蛋白質(zhì)制備活性多肽的研究非常熱門(mén)，因?yàn)槎嚯牟粌H具有無(wú)抗原性，并且具有很多生物活性，例如降血壓、抗氧化等。然而，因多肽的制備原料含有較多的結(jié)合型和游離型多糖，在實(shí)際的研究中，多糖和多肽可能具有類似的生理學(xué)功能，所以準(zhǔn)確分析多肽的功能首先要除去多糖，防止多糖對(duì)結(jié)果進(jìn)行干擾，而目前尚無(wú)簡(jiǎn)單的方法進(jìn)行去除。例如采用堿溶酸沉方法提取米渣蛋白（yangl.,chenj.,xut.,etal.riceproteinextractedbydifferentmethodsaffectscholesterolmetabolisminratsduetoitslowerdigestibility,int.j.ofmol.sci.12(2011)7594-7608），可將大部分游離多糖除去，分離提純蛋白，但是提取的產(chǎn)物包含糖蛋白，在后續(xù)的酶解工藝中，糖蛋白酶解形成肽多糖，會(huì)對(duì)多肽的活性檢測(cè)進(jìn)行干擾。

多肽與糖的分離可以采用酶法或化學(xué)法，酶法由于o-糖鏈的解離目前只有1種酶-內(nèi)切α-n-乙酰半乳糖胺酶，只能識(shí)別乙酰半乳糖與半乳糖之間的連接，由于識(shí)別位點(diǎn)的局限因此使用不多，為了盡可能多的除去多糖，可采用化學(xué)裂解方法。三氟甲磺酸在裂解多肽與葡萄糖之間的共價(jià)鍵的同時(shí)，還能保持多肽的完整及活性。

9-芴甲氧羰基法（fmoc）或叔丁氧羰基（boc）法可以將多肽的氨基端衍生化，使之極性改變更容易溶于有機(jī)溶劑中進(jìn)行提純，后期可將提純的多肽去衍生化，得到目標(biāo)多肽。boc法相比于fmoc法制得純化的目標(biāo)多肽不含鹽，更加適合純化多肽。目前，結(jié)合多肽衍生化及糖肽鍵切割對(duì)粗多肽進(jìn)行分離提純，去除結(jié)合型和游離型多糖，用于準(zhǔn)確性質(zhì)分析，這方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種工藝簡(jiǎn)單、得率高的酶解液中肽的分離方法。具體為將蛋白酶解物樣品干燥后，利用三氟甲磺酸切割結(jié)合多糖的多肽，采用叔丁氧羰基（boc）法將多肽的氨基端衍生化，用乙酸乙酯萃取衍生化的多肽后進(jìn)行去衍生化處理，達(dá)到分離純化多肽的目的。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，其具體的技術(shù)方案如下：一種提純蛋白酶解物中小分子多肽的方法，按照下述步驟進(jìn)行：

（1）蛋白酶解產(chǎn)物的干燥

將大米蛋白酶解產(chǎn)物（15%≤水解度≤25%）離心后，上清液采用真空冷凍干燥機(jī)干燥至絕干。

（2）肽鏈與糖鏈分離

準(zhǔn)確稱取絕干酶解上清液樣品加入到預(yù)冷的樣品管中，按0.3ml/mg（大米蛋白酶解產(chǎn)物樣品）加入三氟甲磺酸，快速封口，輕搖2~5min使樣品溶解，于4℃下保溫30~60min，偶爾搖動(dòng)，樣品管中加入少量2%溴酚藍(lán)指示劑，于-20℃下預(yù)冷，在干冰甲醇浴的環(huán)境下，用預(yù)冷的60%吡啶滴定，直至溴酚藍(lán)變成淺紫色或藍(lán)色，此時(shí)溶液ph約為6.0，最后對(duì)去離子水透析并冷凍干燥。

（3）多肽的分離

準(zhǔn)確稱取步驟（2）制備的凍干樣品放入燒杯中，倒入樣品質(zhì)量10ml/g（凍干樣品）的水溶解，將二碳酸二叔丁酯（按照凍干樣品重量的0.5~2倍），溶解于10ml/g（凍干樣品）1,4-二氧六環(huán)溶劑中，倒入上述燒杯，攪拌后用三乙胺調(diào)節(jié)ph至8~9，溶液變渾濁后繼續(xù)攪拌20h，然后用石油醚作溶劑進(jìn)行萃取，分離出水溶液在冰浴條件下攪拌，用1mol/l鹽酸調(diào)節(jié)ph至2~3，溶液再次變渾濁，再往溶液中加入適量飽和氯化鈉溶液，乙酸乙酯萃取6~10次，合并乙酸乙酯溶液，將合并的乙酸乙酯溶液再用飽和氯化鈉溶液洗滌2~3次，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，直接旋干得到boc-多肽。在反應(yīng)物中加入甲苯，甲苯按照20~50ml/g（boc-多肽）添加，攪拌均勻后，加入硅膠，加熱回流，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，過(guò)濾，然后用水清洗硅膠，將濾液蒸干后，即得提純多肽。

上述的大米蛋白酶解物為較高水解度的酶解產(chǎn)物，也可以由其他蛋白原料制備的較高水解度的酶解產(chǎn)物簡(jiǎn)單代替。

上述三氟甲磺酸試劑可以用其他能斷裂糖肽鍵的化學(xué)試劑簡(jiǎn)單代替。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：1、此方法提純后，多糖的含量大幅度降低。2、本發(fā)明分離出的小分子肽純度高，得率高。3、提純后的小分子肽保留較高的生物學(xué)活性。本發(fā)明分離的是蛋白質(zhì)酶解為小分子的肽，小分子肽利于人體吸收利用，同時(shí)還具有降血壓、抗氧化等功能活性。

下面通過(guò)實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定，該領(lǐng)域的技術(shù)工程師可根據(jù)上述發(fā)明的內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。

在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。

實(shí)施例1

（1）蛋白酶解產(chǎn)物的干燥：將大米蛋白（蛋白含量63.52%）酶解產(chǎn)物（水解度15%）離心后，上清液采用真空冷凍干燥機(jī)干燥至絕干。

（2）肽鏈與糖鏈分離：稱10g絕干酶解上清液樣品，取3ml三氟甲磺酸加入到預(yù)冷的樣品管中，快速封口，輕搖5min使樣品溶解，于4℃下保溫50min，偶爾搖動(dòng)，樣品管中加入少量2%溴酚藍(lán)指示劑，于-20℃下預(yù)冷，在干冰甲醇浴的環(huán)境下，用預(yù)冷的60%吡啶滴定，直至溴酚藍(lán)變成淺紫色或藍(lán)色，此時(shí)溶液ph約為6.0，最后對(duì)去離子水透析并冷凍干燥。

（3）多肽的分離：準(zhǔn)確稱取步驟2中的凍干樣品9.38g放入燒杯中，倒入93.8ml水溶解，將二碳酸二叔丁酯4.69g溶解于93.8ml1,4-二氧六環(huán)溶劑中，倒入上述燒杯，攪拌后用三乙胺調(diào)節(jié)ph至8，溶液變渾濁后繼續(xù)攪拌20h，然后用石油醚作溶劑進(jìn)行萃取，分離出水溶液在冰浴條件下攪拌，用1mol/l鹽酸調(diào)節(jié)ph至2，溶液再次變渾濁，再往溶液中加入適量飽和氯化鈉溶液，乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯溶液，將合并的乙酸乙酯溶液再用飽和氯化鈉溶液洗滌2次，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，直接旋干得到boc-多肽。在圓底燒瓶中加入boc-多肽底物和甲苯，甲苯按照20ml/g（boc-多肽）添加，攪拌均勻后加入10倍量的硅膠（摩爾比），加熱回流，將體系冷卻到室溫，過(guò)濾，用少量水清洗硅膠3次，將濾液蒸干后得到產(chǎn)物多肽3.94g，采用凱氏定氮法測(cè)定多肽含量，其含量為89.42%。將全部所得多肽樣品加少量水溶解，定容至2l，測(cè)定1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（dpph）清除率為41.27%，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ace）抑制率為53.18%。同時(shí)將未提取的10g樣品定容至2l，測(cè)定dpph清除率為48.37%，ace抑制率為61.35%。

實(shí)施例2

（1）蛋白酶解產(chǎn)物的干燥：將大米蛋白（蛋白含量63.52%）酶解產(chǎn)物（水解度25%）離心后，上清液采用真空冷凍干燥機(jī)干燥至絕干。

（2）肽鏈與糖鏈分離：稱10g絕干酶解上清液樣品，取3ml三氟甲磺酸加入到預(yù)冷的樣品管中，快速封口，輕搖2min使樣品溶解，于0℃下保溫50min，偶爾搖動(dòng)，樣品管中加入少量2%溴酚藍(lán)指示劑，于-20℃下預(yù)冷，在干冰甲醇浴的環(huán)境下，用預(yù)冷的60%吡啶滴定，直至溴酚藍(lán)變成淺紫色或藍(lán)色，此時(shí)溶液ph約為6.0，最后對(duì)去離子水透析并冷凍干燥。

（3）多肽的分離：準(zhǔn)確稱取步驟2中的凍干樣品9.75g放入燒杯中，倒入97.5ml水溶解，將二碳酸二叔丁酯19.5g溶解于97.5ml1,4-二氧六環(huán)溶劑中，倒入上述燒杯，攪拌后用三乙胺調(diào)節(jié)ph至9，溶液變渾濁后繼續(xù)攪拌20h，然后用石油醚作溶劑進(jìn)行萃取，分離出水溶液在冰浴條件下攪拌，用1mol/l鹽酸調(diào)節(jié)ph至3，溶液再次變渾濁，再往溶液中加入適量飽和氯化鈉溶液，乙酸乙酯萃取10次，合并乙酸乙酯溶液，將合并的乙酸乙酯溶液再用飽和氯化鈉溶液洗滌3次，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，直接旋干得到boc-多肽。在圓底燒瓶中加入boc-多肽底物和甲苯，甲苯按照20ml/g（boc-多肽）添加，攪拌均勻后加入10倍量的硅膠（摩爾比），加熱回流，將體系冷卻到室溫，過(guò)濾，用少量水清洗硅膠3次，將濾液蒸干后得到產(chǎn)物多肽4.33g，采用凱氏定氮法測(cè)定多肽含量，其含量為91.85%。將全部所得多肽樣品加少量水溶解，定容至2l，測(cè)定dpph清除率為55.64%，ace抑制率為65.05%。同時(shí)將未提取的10g樣品定容至2l，測(cè)定dpph清除率為63.42%，ace抑制率為79.38%。