本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體說(shuō)的是一種卵形鯧鲹β-胸腺素及其作為免疫增強(qiáng)劑在抗細(xì)菌性疾病性能方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

卵形鯧鲹(trachinotusovatus)是我國(guó)海南、廣東和廣西等南方沿海地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖魚(yú)類，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，病害發(fā)生日益嚴(yán)重。胸腺是機(jī)體免疫系統(tǒng)中重要的中樞免疫器官之一，胸腺素是由goldstein和white在1966年首次從胎牛胸腺蛋白提取液中分離得到的具有生活活性的多肽類物質(zhì)。其中β-胸腺素結(jié)構(gòu)高度保守，由40-44個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量約為5.0kd。胸腺素不僅具有免疫調(diào)節(jié)活性，促進(jìn)t細(xì)胞的成熟的作用，同時(shí)在調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)中亦具有重要作用。目前胸腺素作為一種免疫調(diào)節(jié)劑或增強(qiáng)劑，已經(jīng)在醫(yī)學(xué)臨床廣泛運(yùn)用。由于其能夠協(xié)調(diào)內(nèi)分泌，調(diào)節(jié)免疫平衡，提高機(jī)體抵抗外界病原的入侵，在獸醫(yī)臨床的防治試驗(yàn)中也有不錯(cuò)的效果。然而魚(yú)類β-胸腺素的功能和應(yīng)用潛能尚不清楚。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種卵形鯧鲹β-胸腺素及其抗病性能方面的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種卵形鯧鲹β-胸腺素，所述卵形鯧鲹β-胸腺素的cdna核苷酸的序列如seqidno.1：

actactgctgcaacgcactgaccagagaccttccagcgatcccgtcagccaacgcttcgactctctgcaaccatgagtgacaacaagcccgacatctcagacgtgaccagcttcgacaagaccaaactgaagaagacggagactcaagagaaaaacacactgccaaccaaagaaaccatcgaacaggagaagtcagagtcatcatgaagatcagtcctcctgtacactgcacattccacaagccttgcctctttcaaccttttccaacatgtattccaagttgcagaacttaataattgacaaaacgttggctgtacaaccacacaactcaacttgcctagatgtccctctggtacagtgaggaagtggtggctcaatgtcggcatgagttcctggtcacctgttttttgctggggctgtatctcaaggtgtcatgaaacaactgagggacctacacttcatgatttgtagccctgctctagccacctgtgaatgctcacaaagcaagctgtttctttttgtaaaaaaaaatctggaatgcacaagtttgttaaatatgcaaaataaaaaatgtaaactgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa；

所述卵形鯧鲹β-胸腺素的的氨基酸序列如seqidno.2：

msdnkpdisdvtsfdktklkktetqekntlptketieqeksess

本發(fā)明還提供所述卵形鯧鲹β-胸腺素在魚(yú)類抗細(xì)菌疾病藥物。

本發(fā)明還提供所述卵形鯧鲹β-胸腺素在魚(yú)類抗細(xì)菌疾病藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述的細(xì)菌為緩愛(ài)德華氏菌病、哈維氏弧菌病或無(wú)乳鏈球菌病。

本發(fā)明提供了卵形鯧鲹β-胸腺素抗病基因及其編碼蛋白質(zhì)的重組表達(dá)方法，具體為提取卵形鯧鲹的rna，將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna，再以cdna為模板，以下述序列為引物，通過(guò)pcr獲得β-胸腺素抗病基因的基因序列，所述引物的序列為：

trotβ-f：5’-gatatcatgagtgacaacaagccc-3’；

trotβ-r：5’-gatatctgatgactctgacttctcc-3’。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min；擴(kuò)增后的片段經(jīng)膠回收后與pmd19-t載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行pcr檢測(cè)；檢測(cè)正確后提取重組質(zhì)粒，ecorv限制性內(nèi)切酶酶切后回收132bp片段；提取pet-32a質(zhì)粒同時(shí)質(zhì)粒經(jīng)ecorv酶切后，利用t4連接酶將上述132bp回收片段連接構(gòu)建重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒經(jīng)基因測(cè)序驗(yàn)證含有β-胸腺素基因，將其命名為ptrotβ；

將上述的質(zhì)粒ptrotβ用常規(guī)方法轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株bl21感受態(tài)細(xì)胞中，在含有50ug/ml氨芐青霉素的lb固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12-20小時(shí)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將其命名為bl21/ptrotβ；

將bl21/ptrotβ菌株接種至含50ug/ml氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中，30℃條件下，200rpm/min振蕩培養(yǎng)至od600約為0.6，加入異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度為0.5mmol/l進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，30℃條件下繼續(xù)以200rpm/min搖動(dòng)培養(yǎng)6h，而后以5000g，4℃離心10min，收集菌液，加入6ml裂解液，-80℃速凍之后，4℃解凍，而后再進(jìn)行超聲破碎后，以10000g,4℃離心30min,回收上清液并進(jìn)行層析柱回收純化。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：

本發(fā)明的β-胸腺素能夠顯著抑制致病菌的生長(zhǎng)，并且注射魚(yú)類之后能夠顯著提高魚(yú)類的抗病能力。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施提供的誘導(dǎo)及純化的β-胸腺素蛋白電泳圖。泳道m(xù)，分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2，對(duì)照；泳道3，β-胸腺素誘導(dǎo)；泳道4，β-胸腺素純化。

圖2為本發(fā)明實(shí)施提供的純化的β-胸腺素蛋白抑制致病菌生長(zhǎng)的生長(zhǎng)曲線圖。a為抑制遲緩愛(ài)德華氏菌生長(zhǎng)曲線圖，b為抑制哈維氏弧菌生長(zhǎng)曲線圖，c為抑制無(wú)乳鏈球菌生長(zhǎng)曲線圖。其中空心圓形曲線為對(duì)照蛋白，實(shí)心圓形曲線為本發(fā)明實(shí)施提供的純化的β-胸腺素蛋白。

圖3為實(shí)驗(yàn)魚(yú)注射純化的β-胸腺素蛋白后腎臟、脾臟及肝臟中的細(xì)菌在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)量圖：a、肝臟，b、脾，c、腎。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步解釋，但本發(fā)明的技術(shù)方案不受實(shí)施例任何形式上的限制。

實(shí)施例

一種卵形鯧鲹β-胸腺素，所述卵形鯧鲹β-胸腺素的cdna核苷酸的序列如seqidno.1；所述卵形鯧鲹β-胸腺素的的氨基酸序列如seqidno.2。

提取卵形鯧鲹的rna，將rna反轉(zhuǎn)錄為cdna，再以cdna為模板，以下述序列為引物，通過(guò)pcr獲得β-胸腺素抗病基因的基因序列，所述引物的序列為：

trotβ-f：5’-gatatcatgagtgacaacaagccc-3’；

trotβ-r：5’-gatatctgatgactctgacttctcc-3’。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2min，94℃30s，52℃30s，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。擴(kuò)增后的片段經(jīng)膠回收后與pmd19-t載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α，挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行pcr檢測(cè)。檢測(cè)正確后提取重組質(zhì)粒，ecorv限制性內(nèi)切酶酶切后回收132bp片段。提取pet-32a質(zhì)粒同時(shí)質(zhì)粒經(jīng)ecorv酶切后，利用t4連接酶將上述132bp回收片段連接構(gòu)建重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)基因測(cè)序驗(yàn)證含有β-胸腺素基因，將其命名為ptrotβ。

β-胸腺素重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將上述的質(zhì)粒ptrotβ用常規(guī)方法轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株bl21感受態(tài)細(xì)胞中(購(gòu)于全式金科技有限公司，北京)，在含有氨芐青霉素(50ug/ml)的lb固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12-20小時(shí)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將其命名為bl21/ptrotβ。

將bl21/ptrotβ菌株接種至含氨芐青霉素(50ug/ml)的lb培養(yǎng)基中，30℃條件下，200rpm/min振蕩培養(yǎng)至od600約為0.6，加入異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.5mmol/l進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，30℃條件下繼續(xù)以200rpm/min搖動(dòng)培養(yǎng)6h，而后以5000g,4℃離心10min，收集菌液，加入6ml裂解液，-80℃速凍之后，4℃解凍，而后再進(jìn)行超聲破碎后，以10000g,4℃離心30min,回收上清。講上清中的蛋白用親和層析柱histraphpcplumne(購(gòu)于美國(guó)gehealthcare公司)回收純化。將誘導(dǎo)的蛋白、純化的蛋白及對(duì)照空載體誘導(dǎo)的蛋白用sds-page電泳分析檢測(cè)(8v/cm電壓下電泳25-30min，隨后15v/cm電壓下電泳2-2.5h)，測(cè)定其誘導(dǎo)及分子量大小(參見(jiàn)圖1)。發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)質(zhì)量與β-胸腺素質(zhì)量一致。

所述裂解液為終濃度50mmnah2po4，300mmnacl和10mmimidazole，ph8.0。

實(shí)施例2β-胸腺素的抑菌作用

將實(shí)施例1述純化的β-胸腺素蛋白在pbs中稀釋至1ug/ul。將遲緩愛(ài)德華氏菌，哈維氏弧菌和無(wú)乳鏈球菌，在lb培養(yǎng)基中，30℃條件下，200rpm/min振蕩培養(yǎng)至od600約為0.6，分別取50ul菌液與50ulβ-胸腺素稀釋液混勻，在30℃，250rpm轉(zhuǎn)速下，growthcurves公司的bioscreenc進(jìn)行測(cè)量，od600每小時(shí)測(cè)量一次，連續(xù)測(cè)量96小時(shí)，β-胸腺素蛋白可以顯著抑制緩愛(ài)德華氏菌，哈維氏弧菌和無(wú)乳鏈球菌的生長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

實(shí)施例3β-胸腺素蛋白注射魚(yú)類后顯著提高魚(yú)類的抗病感染能力

將實(shí)施例1純化的β-胸腺素蛋白在pbs中稀釋至200ug/ml，即為β-胸腺素稀釋液。將30條卵形鯧鲹(重約15g)隨機(jī)分為2組，每組15條。將兩組分別命名為a和b，a組的每條魚(yú)分別注射100ulβ-胸腺素稀釋液，將b組分別注射100ulpbs。

將遲緩愛(ài)德華氏菌在lb培養(yǎng)基中，30℃條件下，200rpm/min振蕩培養(yǎng)至od600約為0.6，估算1od＝5*10⁸cfu/ml，于pbs中稀釋至10⁶cfu/ml，即為緩愛(ài)德華氏菌細(xì)菌懸液。

攻毒感染

在將a和b組實(shí)驗(yàn)魚(yú)注射100ulβ-胸腺素稀釋液或100ulpbs1天后，每條魚(yú)注射100ul上述步驟制備的緩愛(ài)德華氏菌細(xì)菌懸液進(jìn)行人工感染。在感染后6h，12h及24h，取魚(yú)的腎臟、脾臟及肝臟，組織研磨于pbs中制備各組織懸液，組織懸液涂布lb固體平板，30℃培養(yǎng)24h后，進(jìn)行細(xì)菌的菌落計(jì)算。結(jié)果表明，a組魚(yú)腎臟、脾臟及肝臟的細(xì)菌數(shù)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著(p<0.05)低于b組魚(yú)組織中的細(xì)菌數(shù)，見(jiàn)圖3。

所述pbs組分的配方為：nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l，ph7.2～7.4。

這些結(jié)果表明，β-胸腺素能夠顯著抑制致病菌的生長(zhǎng)，并且能夠顯著增強(qiáng)魚(yú)類抵抗細(xì)菌的侵染能力。因此，卵形鯧鲹β-胸腺素可以制備成預(yù)防緩愛(ài)德華氏菌病、哈維氏弧菌病或無(wú)乳鏈球菌病的注射制劑。

sequencelisting

<110>海南大學(xué)

<120>一種卵形鯧鲹β-胸腺素及其應(yīng)用

<130>無(wú)

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>602

<212>dna

<213>trachinusdraco

<400>1

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