本發(fā)明涉及基因工程學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域，尤其是一種嵌合抗原受體并融合誘導(dǎo)性凋亡酶的復(fù)合蛋白及其構(gòu)建方法，本發(fā)明還涉及上述復(fù)合蛋白在制備治療乳腺癌藥物中的用途。

背景技術(shù)：

我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，特別是晚期轉(zhuǎn)移乳腺癌的病例增多。目前治療乳腺癌仍然是以手術(shù)為主的綜合治療。自從提出了“乳腺癌是全身性疾病”的概念以后，全身治療的方案越來(lái)越受到重視。但是，已經(jīng)發(fā)生全身轉(zhuǎn)移的乳腺癌仍然屬于難治之癥，這些病例往往對(duì)多種化療和放療方案都不敏感，各種治療手段除了稍能延長(zhǎng)壽命，并沒(méi)有突破性進(jìn)展。

研究發(fā)現(xiàn)，約25～30％的乳腺癌病人的癌組織細(xì)胞表達(dá)一種表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2，her2)。雖然her2在乳腺癌的表達(dá)率不算高，但是陽(yáng)性的病例往往預(yù)后差、發(fā)展快。her2在乳腺癌中的過(guò)量表達(dá)不僅與癌細(xì)胞的增殖率和發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)呈正相關(guān)，而且這些病例往往對(duì)多種化療放療不敏感。這主要由于her2作為表皮生長(zhǎng)因子受體，具有促癌細(xì)胞生長(zhǎng)，擴(kuò)散和腫瘤血管增生等功能，因此，her2蛋白是乳腺癌惡化的分子標(biāo)記，現(xiàn)在臨床上已經(jīng)采用檢測(cè)癌組織中her2表達(dá)來(lái)預(yù)測(cè)乳腺癌病人的預(yù)后，抗her2治療也已經(jīng)通過(guò)了試驗(yàn)階段，正式應(yīng)用于臨床實(shí)踐。

2012年，我們課題組應(yīng)用具有結(jié)合her2受體和攜帶抗癌sirna藥物雙向功能的融合蛋白作為載體成功識(shí)別her2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞，并能在人源化小鼠荷瘤模型中成功輸送功能性rna序列抑制腫瘤細(xì)胞增殖遷移。因此her-2抗體是有效結(jié)合her-2分子的蛋白分子。

目前通過(guò)阻斷her2受體來(lái)治療乳腺癌的途徑主要有以下幾類(lèi)：

1.抗her2單克隆抗體：

通過(guò)封閉乳腺癌細(xì)胞表面her2受體，阻斷其與各種生長(zhǎng)因子的結(jié)合，從而抑制受體激活，同時(shí)誘導(dǎo)受體經(jīng)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，減少細(xì)胞表面her2的表達(dá)量。其中單抗trastuzumab，又稱(chēng)herceptin，是第一個(gè)獲美國(guó)fda批準(zhǔn)應(yīng)用于晚期乳腺癌治療的抗her2藥物。數(shù)年來(lái)多個(gè)中心大宗病例的臨床應(yīng)用結(jié)果證明，herceptin單藥治療能使her2陽(yáng)性的晚期乳腺癌病例進(jìn)入臨床緩解期，并維持18個(gè)月之久。與化療藥物聯(lián)合使用治療已經(jīng)發(fā)生全身轉(zhuǎn)移的乳腺癌能增加腫瘤對(duì)化療的敏感性，明顯地延長(zhǎng)病人的壽命。但是，距離真正有效地控制和治愈乳腺癌，herceptin的療效尚不夠理想，這主要由于乳腺癌細(xì)胞her2受體是在基因水平過(guò)量表達(dá)，而herceptin只是通過(guò)阻斷受體蛋白起作用，新的her2蛋白仍在源源不斷地合成并輸送到細(xì)胞膜，補(bǔ)充喪失的受體。而且鑒于心臟毒性和過(guò)敏反應(yīng)，單抗的用量不可能無(wú)限制地加大。另一方面，herceptin只作用于her2跨膜蛋白的細(xì)胞外部分，其胞內(nèi)部分的酪氨酸激酶仍可被鄰近未被阻斷的表皮生長(zhǎng)因子受體激活來(lái)傳導(dǎo)增殖信號(hào)。

2.酪氨酸激酶抑制劑：

her2刺激細(xì)胞增殖的信號(hào)主要通過(guò)酪氨酸激酶系統(tǒng)的級(jí)聯(lián)活化來(lái)傳導(dǎo)。通過(guò)抑制her2受體蛋白胞內(nèi)部分的酪氨酸激酶(如細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶erk1抑制劑)，在細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。但是與酪氨酸激酶抑制劑往往只針對(duì)級(jí)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的某一環(huán)節(jié)，而her2信號(hào)還可以通過(guò)旁路途徑傳導(dǎo)。此外，酪氨酸激酶抑制劑不能直接抑制過(guò)量表達(dá)的her2基因，更不能徹底地阻斷her2蛋白的合成。更重要的是，酪氨酸激酶也是正常細(xì)胞所必需，使用其抑制劑干擾了很多正常組織細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，引起多種毒副作用。

因此，要進(jìn)一步擴(kuò)展抗her2治療乳腺癌的臨床成果，有必要發(fā)展毒性低，又能徹底抑制整個(gè)her2跨膜蛋白表達(dá)的有效方法。

3.傳統(tǒng)的反義基因方法：

包括特異性的反義寡核苷酸和核糖酶(ribozyme)均曾用于抑制乳腺癌細(xì)胞her2基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究。但是由于這些傳統(tǒng)的反義基因方法抑制基因表達(dá)的效果較弱，因此不能滿足臨床應(yīng)用的需求。

4.cart細(xì)胞即過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療是抗腫瘤治療中的新型手段

car-t療法，即chimericantigenreceptortcellimmunotherapy，嵌合抗原受體t細(xì)胞免疫療法。它是過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療的一種，這一概念較早就出現(xiàn)，是近幾年才被改良使用到臨床上，并在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤等腫瘤的治療上取得較顯著的療效的新型細(xì)胞療法。被認(rèn)為是最有前景的腫瘤治療方式之一。car-t技術(shù)經(jīng)過(guò)一系列漫長(zhǎng)的演化過(guò)程中，逐漸走向成熟，并在抗腫瘤治療上展現(xiàn)出日益優(yōu)越的特點(diǎn)。

人體內(nèi)正常免疫細(xì)胞在執(zhí)行抗腫瘤功能時(shí)主要以識(shí)別并啟動(dòng)殺傷途徑達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的作用，其中，t淋巴細(xì)胞是主要直接殺手。但由于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸以及表面抗原的多變性使得具有抗腫瘤細(xì)胞功能的免疫細(xì)胞不能及時(shí)識(shí)別腫瘤細(xì)胞造成腫瘤細(xì)胞不能被及早完全清除而形成腫瘤，進(jìn)而危害人體健康。而具有特異抗原受體修飾的t淋巴細(xì)胞可以直接識(shí)別腫瘤抗原，并快速活化啟動(dòng)殺傷效應(yīng)，可達(dá)到快速，特異，精準(zhǔn)的效果。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)，是生物體細(xì)胞的主動(dòng)消亡過(guò)程，是多細(xì)胞有機(jī)體調(diào)控機(jī)體發(fā)育、控制細(xì)胞衰老、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制。一般認(rèn)為，細(xì)胞凋亡存在三條主要通路:線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和死亡受體通路，各通路間互相聯(lián)系，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。其中，胱天蛋白酶(caspases)-9是線粒體通路上啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的一個(gè)關(guān)鍵蛋白，caspase-9酶原的激活可以啟動(dòng)下游效應(yīng)蛋白酶從而引起細(xì)胞凋亡。早在2001年已有科學(xué)家研究出一種誘導(dǎo)型的caspase-9(簡(jiǎn)稱(chēng)icasp-9，與細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白fkbp12融合)可在藥物ap1903的調(diào)控下自激活引起細(xì)胞凋亡，開(kāi)啟人為可調(diào)控的細(xì)胞凋亡，即通過(guò)藥物可以及時(shí)讓細(xì)胞“自殺”。這種設(shè)計(jì)隨即在腫瘤細(xì)胞的研究上進(jìn)行。后續(xù)的研究表明，ap1903對(duì)含有icasp-9酶的細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡快，體內(nèi)代謝快，對(duì)機(jī)體其他部位影響小，是合適的調(diào)控藥物。因此，icasp-9可以作為調(diào)控細(xì)胞凋亡也即是控制car-t治療的一個(gè)安全“按鈕”。

目前，cart細(xì)胞療法在白血病等非實(shí)體腫瘤的治療中取得顯著的進(jìn)展，在國(guó)外已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。而在實(shí)體瘤的治療上也進(jìn)行了較多嘗試，如黑色素癌，前列腺癌等等。car-t治療應(yīng)用的主要障礙在于特異識(shí)別特定的腫瘤細(xì)胞時(shí)，可能出現(xiàn)的細(xì)胞脫靶效應(yīng)，以及由于重新輸入大量激活型t淋巴細(xì)胞可能誘發(fā)的細(xì)胞炎癥因子風(fēng)暴對(duì)患者的機(jī)體傷害。當(dāng)大量car-t細(xì)胞輸入體內(nèi)在快速地殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)，有可能會(huì)因?yàn)槟[瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的碎片等，引起自身機(jī)體短時(shí)間內(nèi)大量炎癥因子的產(chǎn)生，或因?yàn)榇罅繗a(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，損傷正常器官細(xì)胞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種能避免誘發(fā)細(xì)胞炎癥因子風(fēng)暴，特異性識(shí)別并高效殺死腫瘤細(xì)胞并能夠在淋巴細(xì)胞發(fā)生失常時(shí)及時(shí)誘導(dǎo)“自殺”的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種嵌合抗原受體并融合誘導(dǎo)性凋亡酶的復(fù)合蛋白，所述復(fù)合蛋白由seqidno：2所示的氨基酸序列組成。此處抗原指her2單鏈中的一個(gè)片段。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及一種分離的核酸，所述核酸編碼上述復(fù)合蛋白。優(yōu)選地，所述核酸的核苷酸序列如seqidno：1所示。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及一種載體，所述載體表達(dá)上述復(fù)合蛋白?？捎糜诓迦肽康亩嗪塑账岬妮d體是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于克隆載體和表達(dá)載體，在一個(gè)實(shí)施方案中，載體可以是例如質(zhì)粒，粘粒，噬菌體，柯斯質(zhì)粒等等。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及一種修飾的t淋巴細(xì)胞，所述修飾的t淋巴細(xì)胞表達(dá)上述復(fù)合蛋白。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包含上述復(fù)合蛋白，或上述分離的核酸，或上述載體，或上述修飾的t淋巴細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，所述復(fù)合蛋白包括但不限于seqidno：2所示的氨基酸序列，還可以包括復(fù)合蛋白的變體。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及上述復(fù)合蛋白，或分離的核酸，或載體，或修飾的t淋巴細(xì)胞在制備治療乳腺癌的藥物中的用途。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及上述修飾的t淋巴細(xì)胞和ap1903的聯(lián)合使用在制備治療乳腺癌的藥物中的用途。由此，ap1903能夠在修飾的t淋巴細(xì)胞發(fā)生失常時(shí)及時(shí)誘導(dǎo)其“自殺”。此處“失?！笔侵?，在修飾的t淋巴細(xì)胞快速地殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)，有可能會(huì)因?yàn)槟[瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的碎片等，引起自身機(jī)體的短時(shí)間內(nèi)大量炎癥因子的產(chǎn)生，或因?yàn)榇罅繗a(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)損傷正常細(xì)胞。

下面對(duì)本發(fā)明中相關(guān)術(shù)語(yǔ)進(jìn)行相應(yīng)說(shuō)明和解釋?zhuān)?/p>

在本發(fā)明中，除非另有說(shuō)明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語(yǔ)的定義和解釋。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“變體”是指這樣的蛋白，其氨基酸序列與本發(fā)明的復(fù)合蛋白(如seqidno：2所示的蛋白)的氨基酸序列具有一個(gè)或多個(gè)(例如1～3個(gè)或1～5個(gè)或1～10個(gè))氨基酸不同或者具有至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，并且其保留了所述復(fù)合蛋白的必要特性。此處術(shù)語(yǔ)“必要特性”是指：能夠結(jié)合her2受體；能強(qiáng)化激活免疫t淋巴細(xì)胞；能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；能夠在真核表達(dá)系統(tǒng)中可溶性地表達(dá)；利用本發(fā)明所涉及的表達(dá)純化方法能夠獲得高產(chǎn)率的純化蛋白。術(shù)語(yǔ)“同一性”是對(duì)核苷酸序列或氨基酸序列的相似性的量度。通常將序列排列起來(lái)，以獲得最大限度的匹配?！巴恍浴北旧砭哂斜绢I(lǐng)域公知的意義并且可用公開(kāi)的算法(例如blast)來(lái)計(jì)算。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“真核表達(dá)系統(tǒng)”是指由293ft細(xì)胞與慢病毒質(zhì)粒表達(dá)載體組成的表達(dá)系統(tǒng)，其中293ft細(xì)胞從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)獲得。

根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“載體(vector)”是指，可將多核苷酸插入其中的一種核酸運(yùn)載工具。當(dāng)載體能使插入的多核苷酸所編碼的蛋白獲得表達(dá)時(shí)，載體稱(chēng)為表達(dá)載體。載體可以通過(guò)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于：質(zhì)粒；噬菌體；柯斯質(zhì)粒等等。

可用于本發(fā)明的方法中的緩沖液是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于，tris緩沖液，磷酸鹽緩沖液，hepes緩沖液，mops緩沖液等等。

綜上所述，本發(fā)明的有益效果為：

1、基于體內(nèi)自身免疫細(xì)胞識(shí)別殺傷腫瘤細(xì)胞的原理，通過(guò)基因工程的方法，使自身t淋巴細(xì)胞表達(dá)靶向her-2表面分子的car(嵌合抗原受體)串聯(lián)兩種免疫激活信號(hào)分子片段(cd137與cd3ζ)得到本發(fā)明的復(fù)合蛋白，含有該復(fù)合蛋白的t淋巴細(xì)胞在藥物ap1903的配合下，可實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞被快速識(shí)別，并且被殺傷進(jìn)而導(dǎo)致凋亡，同時(shí)，能避免以往cart療法中出現(xiàn)的炎癥因子風(fēng)暴等嚴(yán)重不良反應(yīng)出現(xiàn)；

2、本發(fā)明的復(fù)合蛋白將抗her-2分子單鏈fv區(qū)域與t細(xì)胞受體的細(xì)胞內(nèi)t細(xì)胞信號(hào)區(qū)相結(jié)合，能將具有細(xì)胞毒性的t淋巴細(xì)胞靶向于表達(dá)her-2的細(xì)胞(乳腺癌細(xì)胞等)，然后通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，對(duì)細(xì)胞毒性t細(xì)胞進(jìn)行修飾，并且該復(fù)合蛋白設(shè)有開(kāi)啟“自殺”的開(kāi)關(guān)，具有高效精準(zhǔn)安全的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例3中pmscvpuro-her2-scfv-cd8α-cd137-cd3ζ-icasp9用ecori和xhoi的酶切鑒定后的電泳結(jié)果，其中圖1(a)中，m為marker，2979bp處上方有相應(yīng)的條帶，與預(yù)期條帶的位置相吻合；圖1(b)為maeker的各dna條帶的電泳圖；

圖2為pmscvpuro-her2-scfv-cd8α-cd137-cd3ζ-icasp9結(jié)構(gòu)圖；

圖3為實(shí)施例8修飾的car-t淋巴細(xì)胞活化鑒定結(jié)果圖；

圖4為實(shí)施例9中修飾的car-t淋巴細(xì)胞殺傷能力檢測(cè)結(jié)果圖；

圖5為實(shí)施例9中修飾的car-t淋巴細(xì)胞的靶向特異性檢測(cè)結(jié)果圖；

圖6為實(shí)施例9中修飾的car-t淋巴細(xì)胞在藥物ap1903的調(diào)控下的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)參照下列意在舉例說(shuō)明本發(fā)明(而非限定本發(fā)明)的實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明。除非特別指明，本發(fā)明中所使用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和免疫檢測(cè)法，基本上參照j.sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，第3版，johnwiley&sons，inc.，1995中所述的方法進(jìn)行；限制性?xún)?nèi)切酶的使用依照產(chǎn)品制造商推薦的條件。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，實(shí)施例以舉例方式描述本發(fā)明，且不意欲限制本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。

本發(fā)明旨在構(gòu)建具有結(jié)合her2受體，同時(shí)能強(qiáng)化激活免疫t淋巴細(xì)胞，又能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡的特異性嵌合抗原受體并融合誘導(dǎo)性細(xì)胞凋亡酶的復(fù)合蛋白；以及開(kāi)發(fā)car-t細(xì)胞在殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)能力以及調(diào)控能力，加速car-t技術(shù)應(yīng)用于臨床；并為治療晚期乳腺癌提供有效的武器，發(fā)展新型的抗癌細(xì)胞療法。

通過(guò)本發(fā)明的方法構(gòu)建的特異性嵌合抗原受體并融合誘導(dǎo)性細(xì)胞凋亡酶的復(fù)合蛋白具有結(jié)合her2受體，強(qiáng)化t淋巴細(xì)胞激活狀態(tài)以及調(diào)控細(xì)胞凋亡的功能；其能高效殺傷her-2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞，并且在藥物ap1903的誘導(dǎo)下能發(fā)生細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步驗(yàn)證了car-t細(xì)胞的治療效果和臨床可行性；此復(fù)合蛋白的成功開(kāi)發(fā)為發(fā)展嵌和抗原受體細(xì)胞免疫治療法奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，將為治療晚期乳腺癌提供又一個(gè)高質(zhì)量且有力的手段。

為更好的說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。

實(shí)施例1構(gòu)建具有結(jié)合her2受體、同時(shí)強(qiáng)化激活免疫t淋巴細(xì)胞、又能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡的特異受體蛋白的質(zhì)粒

1.1引物設(shè)計(jì)：從基因文庫(kù)中查到her2單鏈片段抗體，激活片段(cd8α鏈，cd137跨膜段，cd3ζ胞內(nèi)段)，誘導(dǎo)片段(fkbp12以及caspase-9的保守段)的序列后，用primer軟件分別設(shè)計(jì)相關(guān)引物以及連接引物。以上涉及片段全場(chǎng)序列均可從基因bank中查找獲得。

1.1.1.her2-scfv引物:

forward：ncoi為內(nèi)切酶

5’-gggccatggcccaggtgcagctgttgcagtctggggcagag-3’(seqidno:3)

reverse：noti為內(nèi)切酶

5’-ttgcggccgctccggaattcacctaggacggtcagcttggtccc-3’(seqidno:4)

1.1.2.激活片段的引物：

①cd8α鏈引物：

f:ccagcgaagcccaccacgac(seqidno:5)

r:aggagatgatatcacaggcgaagtccagcc(seqidno:6)

②cd137引物：

f:cgcctgtgatatcatctccttctttcttgc(seqidno:7)

r:acttcactcttcacagttcacatcctcctt(seqidno:8)

③cd3ζ胞內(nèi)段引物：

f:tgaactgtgaagagtgaagttcagcaggag(seqidno:9)

r:agggggcagggcctgcatg(seqidno:10)

1.1.3.誘導(dǎo)片段引物

f1:actaacaggcaagcagcaaagttgt(seqidno:11)

f2:agcggcggcggcagcactaacagg(seqidno:12)

r:ttatgatgttttaaagaaaagttttttccg(seqidno:13)

1.2pcr克隆相關(guān)目的片段:

1.2.1.pcr反應(yīng)體系1：50ul體系

1.2.2.pcr反應(yīng)循環(huán)

1.3.pcr產(chǎn)物酶切

1.3.1.her2scfv的pcr產(chǎn)物用ncoi和noti內(nèi)切酶切開(kāi)

her2scfv的pcr產(chǎn)物酶體系在37℃水浴4小時(shí)。

1.3.2.pmscvpuro用xhoi和ecori內(nèi)切酶切開(kāi)50ul體系：

pmscvpuro的酶切體系在37℃水浴4小時(shí)。

1.4將上述三個(gè)pcr產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收目的片段

1.4.1將酶切鑒定片段大小正確的pcr產(chǎn)物全部上樣1％agarose膠電泳；

1.4.2將目的dna片段用干凈的手術(shù)刀切下，放入1.5ml離心管，放入回收膠前離心管稱(chēng)重；

1.4.3稱(chēng)重后，在1.5ml離心管中加入以每毫克膠加入1微升體積的bindingbuffer；

1.4.460℃水浴中放置10min(至膠完全溶解)，每2～3分鐘混勻一次(溶膠液應(yīng)與memberbindingbuffer顏色相同)；

1.4.5加入1倍膠體積的異丙醇然后充分混勻，靜置片刻；

1.4.6將柱子放樣品轉(zhuǎn)移入柱子中(柱子的最大容量為800ul)，室溫放置1min，然后16000g×1min離心；

1.4.7取下柱子，棄流出液，將柱子放回原收集管中；

1.4.8加入700ulwashingbuffer至收集管，室溫放置1min，然后16000g×1min離心；

1.4.9加入500ulwashingbuffer至收集管，然后16000g×1min離心；

1.4.10取下收集管，棄流出液，再次16000g×1min離心；

1.4.11將收集管放置在一支新的1.5ml離心管中，加入50ulelubtebuffer(或無(wú)菌h2o)至膜中央，靜置片刻，然后16000g×1min離心，收集回收質(zhì)粒。

1.5將切膠回收的目的片段進(jìn)行連接

1.6連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

1.6.1cacl2制備感受態(tài)細(xì)胞dh5α

1.6.1.1在15ml試管中加入3mllb培養(yǎng)基，從平板上挑取一單克隆接種，37℃，250rpm，培養(yǎng)過(guò)夜，約16小時(shí)。

1.6.1.2取2ml過(guò)夜菌接入200ml新鮮的lb培養(yǎng)基，37℃，260rpm，培養(yǎng)，直至od600＝0.4～0.5，然后將菌液冰浴30～60分鐘。

1.6.1.34℃，5000rpm×5min離心收集細(xì)菌，棄上清。

1.6.1.4用10ml0.1m的cacl2輕輕吹打，充分懸浮，冰浴10min。

1.6.1.54℃，5000rpm×5min離心，棄上清。

1.6.1.6加入2ml0.1m的cacl2輕輕吹打，充分懸浮，冰浴30min即感受態(tài)制備完成。

1.6.2轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

1.6.2.1準(zhǔn)備1.5ml的離心管2支，冰浴預(yù)冷；

1.6.2.2分別取100uldh5α感受態(tài)細(xì)胞，各加入10ul連接產(chǎn)物，混合均勻；

1.6.2.3將上述混合物放置冰上30min；

1.6.2.4將混合物轉(zhuǎn)移至42℃水浴中溫育90s；

1.6.2.5將混合物轉(zhuǎn)移至冰上放置2min后，加入800ul的lb培養(yǎng)液，在搖床上37℃，150rpm培養(yǎng)60min；

1.6.2.64000rpm×5min離心；

1.6.2.7棄800ul的上清液，剩余100ul混勻后涂la板；

1.6.2.8先取20uliptg和70ulxgal混合后涂布在la板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，然后把上步驟剩余的100ul菌液混勻后涂la板；

1.6.2.9la板置37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)；

1.6.2.10在過(guò)夜培養(yǎng)的la板上挑取10個(gè)長(zhǎng)得比較飽滿的白色克隆，分別加入6mlla培養(yǎng)基中，在搖床上37℃，250rpm培養(yǎng)16h。

實(shí)施例2pmscvpuro-her2-scfv-cd8α-cd137-cd3ζ-icasp9質(zhì)粒小量抽提

2.1收菌：以12000g×1min離心收菌。(一般抽提一份用3～4ml菌液)；

2.2棄上清；

2.3加250ul冰浴buffers1(含rnasea)，渦旋振蕩，使菌體充分懸浮；

2.4加250ulbuffers2，溫和混勻6次(此過(guò)程不超過(guò)5min)；

加350ulbuffers3，溫和混勻6次；

2.5以12000g×10min離心；

2.6取上清，過(guò)dna制備管，以12000g×1min，棄濾液；

2.7dna制備管內(nèi)加700ulbufferw1，12000g×1min，棄濾液；

2.8dna制備管內(nèi)加500ulbufferw2，12000g×1min，棄濾液；

2.9再次以12000g×1min離心；

2.10加40ulddh2o(或ebbuffer)于dna制備管的膜中央，室溫靜置1min(50℃預(yù)熱ebbuffer可能洗脫效果更好)；

2.1112000g×1min離心并收集洗脫液，即質(zhì)粒dna。

實(shí)施例3酶切鑒定嵌合受體融合誘導(dǎo)凋亡酶復(fù)合蛋白構(gòu)建的質(zhì)粒pmscvpuro-her2-scfv-cd8α-cd137-cd3ζ-icasp9

用序列分析軟件bioedit對(duì)pmscvpuro-her2-scfv-cd8α-cd137-cd3ζ-icasp9質(zhì)粒進(jìn)行分析，正確定位各酶切位點(diǎn)的位置。

ecori(g^aattc)的酶切位點(diǎn)處于：4390；xhoi(c^tcgag)的酶切位點(diǎn)處于：1417；酶切后的條帶大小為：2979bp(由于酶切的特性，限制性?xún)?nèi)切酶會(huì)從酶切位點(diǎn)前后的3個(gè)堿基處切下，因此，切下條帶大小會(huì)比實(shí)際插入序列多6個(gè)堿基)，位置準(zhǔn)確，如圖1所示。

實(shí)施例4pmscvpuro-her2-scfv-cd8α-cd137-cd3ζ-icasp9質(zhì)粒大量抽提與測(cè)序

4.1進(jìn)行質(zhì)粒大量抽提以獲得較高純度的質(zhì)粒，為其在t淋巴細(xì)胞表達(dá)做準(zhǔn)備。

4.1.1吸取0.5ml上述菌液加入500mlla培養(yǎng)基中在搖床上37℃，250rpm培養(yǎng)16h，菌液密度大約為3～4×10⁹細(xì)胞/ml。

4.1.2將菌液收集在200ml離心管中，在4℃條件下，以6000g的速度離心15min。以同樣的條件重復(fù)3次，把細(xì)菌收集在同一個(gè)離心管中。

4.1.3將細(xì)菌沉淀重懸在20mlbufferp1(使用前加入rnasea和lysebluereagent)中。

4.1.4向離心管中加入20mlbufferp2，并上下顛倒4～6次混勻，在室溫(15～25℃)下放置5min，此時(shí)混合液變?yōu)樗{(lán)色。

4.1.5向離心管中加入20mlbufferp3，并上下顛倒4～6次混勻，在冰上放置30min，此時(shí)混合液藍(lán)色褪去，變?yōu)闊o(wú)色。

4.1.6將上述液體在4℃20,000g離心30min，并迅速收集含有質(zhì)粒dna的上清液。

4.1.7將上一步驟獲得的上清液4℃20,000g離心15min，并迅速收集含有質(zhì)粒dna的上清液。

4.1.8向上清液中加入42ml異丙醇以沉淀其中的質(zhì)粒dna，并4℃20,000g離心15min，小心棄去上清液。

4.1.9向質(zhì)粒dna沉淀中加入500μltebuffer(ph8.0)，并加入bufferqbt至總?cè)萘?ml。

4.1.10使用qiagen-tip100進(jìn)行質(zhì)粒抽提，取4mlbufferqbt加入qiagen-tip100柱子進(jìn)行平衡，并讓液體在重力的作用下緩慢流盡。

4.1.11將步驟9所獲得的含有質(zhì)粒dna的液體加入柱子，讓其在重力的作用下緩慢進(jìn)入交換樹(shù)脂。

4.1.12用bufferqc洗柱，2×10ml。

4.1.13用5mlbufferqf過(guò)柱進(jìn)行洗脫，用一個(gè)干凈的離心管接洗脫液。

4.1.14于洗脫液中加3.5ml異丙醇以沉淀質(zhì)粒dna，并4℃15,000g離心30min。離心后將上清液小心棄去。

4.1.15室溫下用2ml70％的酒精洗質(zhì)粒dna，然后在4℃15,000g離心10min，離心后小心棄去上清液。

4.1.16沉淀物風(fēng)干10min后加入250μl的tebuffer(ph8.0)。

4.2抽提質(zhì)粒濃度測(cè)定

應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒大量抽提后獲得的pmscvpuro-her2-scfv-cd8α-cd137-cd3ζ-icasp9質(zhì)粒的濃度為：

0.025×1000×50＝1.25ug/ul

4.3her2-scfv-cd8α-cd137-cd3ζ-icasp9的測(cè)序

委托英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下：

ctcgagatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgatggcccaggtgcagctggtgcagtctggggcagaggtgaaaaagcccggggagtctctgaagatctcctgtaagggttctggatacagctttaccagctactggatcgcctgggtgcgccagatgcccgggaaaggcctggagtacatggggctcatctatcctggtgactctgacaccaaatacagcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagtcgacaagtccgtcagcactgcctacttgcaatggagcagtctgaagccctcggacagcgccgtgtatttttgtgcgagacatgacgtgggatattgcagtagttccaactgcgcaaagtggcctgaatacttccagcattggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtggcggatcgcagtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctgcggccccaggacagaaggtcaccatctcctgctctggaagcagctccaacattgggaataattatgtatcctggtaccagcagctcccaggaacagcccccaaactcctcatctatgatcacaccaatcggcccgcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggttccggtccgaggatgaggctgattattactgtgcctcctgggactacaccctctcgggctggggttcggcggaggaaccaagctgaccgtcctaggtgcggccgccggcggaggaggatctccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatcatctccttctttcttgcgctgacgtcgactgcgttgctcttcctgctgttcttcctcacgctccgtttctctgttgttaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacggctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgccatcatcaccaccaccatcagtgcaccaactatgcgctgctgaaactggcgggcgatgtggaaagcaacccgggcccgatgggagtgcaggtggaaaccatctccccaggagacgggcgcaccttccccaagcgcggccagacctgcgtggtgcactacaccgggatgcttgaagatggaaagaaagttgattcctcccgggacagaaacaagccctttaagtttatgctaggcaagcaggaggtgatccgaggctgggaagaaggggttgcccagatgagtgtgggtcagagagccaaactgactatatctccagattatgcctatggtgccactgggcacccaggcatcatcccaccacatgccactctcgtcttcgatgtggagcttctaaaactggaaagcggcggcggcagcactaacaggcaagcagcaaagttgtcgaagccaaccctagaaaaccttaccccagtggtgctcagaccagagattcgcaaaccagaggttctcagaccggaaacacccagaccagtggacattggttctggaggatttggtgatgtcggtgctcttgagagtttgaggggaaatgcagatttggcttacatcctgagcatggagccctgtggccactgcctcattatcaacaatgtgaacttctgccgtgagtccgggctccgcacccgcactggctccaacatcgactgtgagaagttgcggcgtcgcttctcctcgctgcatttcatggtggaggtgaagggcgacctgactgccaagaaaatggtgctggctttgctggagctggcgcagcaggaccacggtgctctgactgctgcgtggtggtcattctctctcacggctgtcaggccagccacctgcagttcccaggggctgtctacggcacagatggatgccctgtgtcggtcgagaagattgtgaacatcttcaatgggaccagctgccccagcctgggagggaagcccaagctctttttcatccaggcctgtggtggggagcagaaagaccatgggtttgaggtggcctccacttcccctgaagacgagtcccctggcagtaaccccgagccagatgccaccccgttccaggaaggtttgaggaccttcgaccagctggacgccatatctagtttgcccacacccagtgacatctttgtgtcctactctactttcccaggttttgtttcctggagggaccccaagagtggctcctggtacgttgagaccctggacgacatctttgagcagtgggctcactctgaagacctgcagtccctcctgcttagggtcgctaatgctgtttcggtgaaagggatttataaacagatgcctggttgctttaatttcctccggaaaaaacttttctttaaaacatcacatcatcaccaccaccattaaga-3’

結(jié)果顯示上述序列(下劃線部分)與her2-scfv-cd8α-cd137-cd3ζ-icasp9的理論序列(即seqidno：1所示的dna序列)完全一致。

實(shí)施例5質(zhì)粒圖

所構(gòu)建質(zhì)粒pmscvpuro-her2-scfv-cd8α-cd137-cd3ζ-icasp9的繪制質(zhì)粒圖如圖2所示。這個(gè)質(zhì)粒圖闡明了質(zhì)粒的英文全稱(chēng)為pmscvpuro-her2-scfv-cd8α-cd137-cd3ζ-icasp9，序列的總長(zhǎng)度為9225bp，以及目標(biāo)序列her2-scfv-cd8α-cd137-cd3ζ-icasp9(即seqidno：1所示的dna序列)的插入位置，并說(shuō)明相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，質(zhì)粒表達(dá)嘌呤霉素抗性等質(zhì)粒信息。

實(shí)施例6pmscv慢病毒表達(dá)載體的包裝及純化

6.1pmscvpuro表達(dá)質(zhì)粒慢病毒的構(gòu)建

6.1接種1×10⁶個(gè)293ft細(xì)胞于100mm組織培養(yǎng)皿中，初始細(xì)胞密度應(yīng)在50～70％鋪滿培養(yǎng)過(guò)夜。

6.2除去培養(yǎng)基，加入4ml優(yōu)化培養(yǎng)基opti-mem以及1ml完全培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基)。確認(rèn)培養(yǎng)皿的所有區(qū)域被培養(yǎng)基覆蓋，以防止細(xì)胞干燥死亡。

6.3于一無(wú)菌15ml離心管中混合制備慢病毒的三個(gè)質(zhì)粒：pspax24μg，pmd2.g1.4ug和pmscvpuro-her2-scfv-cd8α-cd137-cd3ζ-icasp9表達(dá)質(zhì)粒5.6ug，加入opti-mem，總體積1500ul。lipofectamine300025ul，加入到無(wú)血清無(wú)抗生素opti-mem，總體積1500ul，室溫靜置5min。

混合上述溶液，室溫靜置30min。

6.4將上述混合液逐滴加入組織培養(yǎng)皿，每加入2到3滴便溫和地晃動(dòng)培養(yǎng)皿以使起其與轉(zhuǎn)染混合液混勻。

6.537度培養(yǎng)10～14小時(shí)。

6.6約12小時(shí)以后，除去轉(zhuǎn)染溶液，并加入20ml完全培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)約48～60小時(shí)。

6.7約48小時(shí)后，收集上清，再加入10ml培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)約24小時(shí)后收集含病毒的培養(yǎng)液。

6.8將兩次收集的病毒原液合并后于4℃條件下3000r/min離心5min，去除包裝細(xì)胞，然后通過(guò)0.22um的一次性濾器過(guò)濾，即得病毒原液。再將之置于超速離心管內(nèi)25000r/min，2小時(shí)。棄上清，用100ulpbs重懸沉淀，分裝到無(wú)菌的ep管，-80℃保存。

實(shí)施例7her2-scfv-cd8α-cd137-cd3ζ-icasp9復(fù)合蛋白在人cd8t淋巴細(xì)胞上的表達(dá)

7.1人cd8t淋巴細(xì)胞的分離。

7.1.1人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離。

7.1.1.1將健康人外周血約30ml全血用約30ml生理鹽水稀釋。

7.1.1.2取兩支50ml離心管加入約15mlficoll溶液，再將稀釋的血液輕輕傾斜加入離心管中，注意避免兩種溶液混合在一起，每管加入30ml血液。

7.1.1.3室溫，450g離心25分鐘，降速加速度設(shè)置為0，得到分層四層的液體，從上到下分別是血漿層，單核細(xì)胞層，ficoll層，紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞層。

7.1.1.4用巴氏管將白色的單核細(xì)胞層吸取置于另一管中，加入生理鹽水約30～40ml混勻，450g，5min室溫離心棄去上清。重復(fù)加入生理鹽水，300g，5min室溫離心，棄上清。再重復(fù)一次，加入20ml生理鹽水后先計(jì)數(shù)單核細(xì)胞的個(gè)數(shù)，然后再300g，8min離心棄上清。

7.1.2人cd8t淋巴細(xì)胞的篩選

7.1.2.1對(duì)于每10⁷個(gè)細(xì)胞，加入40ul緩沖液與10ul一抗溶液，輕柔重懸，4℃靜置5min。

7.1.2.2對(duì)于每10⁷個(gè)細(xì)胞，加入30ul緩沖液與20ul二抗溶液，輕柔混勻，4℃靜置10min，然后加入500ul緩沖液每10⁷個(gè)細(xì)胞。

7.1.2.3將分離柱放置于磁力架上，先用5ml緩沖液潤(rùn)管，整個(gè)篩選過(guò)程盡量少泡。

7.1.2.4待緩沖液流完，在柱子下放置新的離心管，在柱子中加入上述的細(xì)胞懸液，輕柔，用3ml緩沖液沖洗之前有細(xì)胞懸液的離心管，然后再吸取過(guò)柱。再用3ml緩沖液加入柱子。濾下的細(xì)胞即cd8t淋巴細(xì)胞。棄去柱子。將濾過(guò)的淋巴細(xì)胞300g、5min室溫離心，用含有10％血清的1640培養(yǎng)基重懸并37℃培養(yǎng)。

7.2her2-scfv-cd8α-cd137-cd3ζ-icasp9復(fù)合蛋白在cd8t淋巴細(xì)胞的表達(dá)

7.2.1計(jì)數(shù)3*10⁷個(gè)cd8細(xì)胞，用約400ul含5％血清培養(yǎng)基重懸，(培養(yǎng)基預(yù)先加入polybrene，終濃度為8mg/l)，加入之前濃縮的病毒1ul，輕柔混勻后置于12孔培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)，離心棄上清，用1ml10％血清培養(yǎng)基重懸培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)。再重復(fù)轉(zhuǎn)染一次。

7.2.2再次轉(zhuǎn)染48小時(shí)后加入嘌呤霉素篩選3～4天，濃度為5mg/l。由于表達(dá)質(zhì)粒為嘌呤霉素抗性，因此篩選后的細(xì)胞為轉(zhuǎn)染成功的car-t淋巴細(xì)胞。

實(shí)施例8修飾的car-t淋巴細(xì)胞活化鑒定。

8.1取her2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株bt474細(xì)胞10⁴個(gè)，分為兩組，每組分別加入10⁵個(gè)篩選出的t淋巴細(xì)胞和car-t細(xì)胞，37℃培養(yǎng)箱共培養(yǎng)2小時(shí)。

8.2取出細(xì)胞，離心去上清，生理鹽水重懸洗一遍，再離心棄上清，用100ul生理鹽水重懸，加入1ul人cd69熒光抗體，4℃孵育30min，洗去多余的抗體，用流式分析儀分析cd69表達(dá)情況。

如圖3所示，對(duì)于未轉(zhuǎn)染的t淋巴細(xì)胞，在2小時(shí)時(shí)即可檢測(cè)到car-t細(xì)胞cd69有較高的表達(dá)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染了復(fù)合蛋白的t細(xì)胞具有高效的活化效應(yīng)。

實(shí)施例9修飾的car-t淋巴細(xì)胞功能鑒定

9.1修飾的car-t淋巴細(xì)胞殺傷能力檢測(cè)

9.1.1取her2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞株bt474細(xì)胞8×10⁴個(gè)，平均分7組，組①直接接種于12孔細(xì)胞板中。后6組細(xì)胞一起用500ul生理鹽水重懸，加入1ulcelltracker染料，避光，37℃15min后，加入500ul含血清的培養(yǎng)基，1000rpm離心3min，棄上清。后續(xù)實(shí)驗(yàn)也在避光條件下進(jìn)行。

9.1.2將后6組細(xì)胞用2ml含血清培養(yǎng)基重懸，各250ul分別加入12孔培養(yǎng)板中另外6個(gè)孔，即為②③④⑤⑥⑦組，每組約為10⁴個(gè)細(xì)胞。

9.1.3按照腫瘤：淋巴細(xì)胞個(gè)數(shù)＝1/1，1/5，1/10的比例，在②③④組中分別加入轉(zhuǎn)染的car-t細(xì)胞，在⑤⑥⑦組中分別加入篩選出來(lái)的t淋巴細(xì)胞。每孔的體系都為1.2ml。置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～8小時(shí)。

9.1.46～8小時(shí)后，將每孔的細(xì)胞吹下吸取到1.5mlep管中，300g，4min室溫離心，棄上清。再用200ul生理鹽水重懸，加入流式抗體pi，在流式分析儀上分析腫瘤細(xì)胞被殺傷的情況。第一組作為未染色對(duì)照。

如圖4所示，對(duì)于未轉(zhuǎn)染的t淋巴細(xì)胞，car-t細(xì)胞對(duì)her2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞具有較高的殺傷能力，并且，隨著t淋巴細(xì)胞數(shù)量逐步調(diào)整為腫瘤細(xì)胞的1倍、5倍、10倍，該殺傷能力也逐漸增高。

9.2修飾的car-t淋巴細(xì)胞的靶向特異性

9.2.1取her-2表達(dá)陰性細(xì)胞mda-mb-231細(xì)胞約3×10⁴個(gè)，平均分為3組，接種于新的12孔板中。

9.2.2按照腫瘤：淋巴細(xì)胞個(gè)數(shù)＝1/1，1/5，1/10的比例，在腫瘤細(xì)胞中分別加入轉(zhuǎn)染的car-t細(xì)胞。每孔的體系都為1.2ml。置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6～8小時(shí)。

9.2.36-8小時(shí)后，將每孔的細(xì)胞吹下吸取到1.5mlep管中，300g，4min室溫離心，棄上清。再用200ul生理鹽水重懸，加入流式抗體pi，在流式分析儀上分析腫瘤細(xì)胞被殺傷的情況。

如圖5所示，對(duì)于her2陰性的乳腺癌細(xì)胞，car-t細(xì)胞的殺傷能力和普通t淋巴細(xì)胞相似，說(shuō)明car-t細(xì)胞的殺傷腫瘤細(xì)胞能力是有靶向特異性的。

9.3修飾的car-t淋巴細(xì)胞在藥物ap1903的調(diào)控下能夠快速凋亡

9.3.1各取10⁵個(gè)car-t淋巴細(xì)胞和篩選的cd8t淋巴細(xì)胞分別各接種于3個(gè)12孔培養(yǎng)板中，一一對(duì)應(yīng)為三組，每孔都加入ap1903，終濃度為100nm。

9.3.2分別于0，0.5小時(shí)的時(shí)候吸出相對(duì)的一組細(xì)胞，300g，4min，室溫離心棄上清。用300ul預(yù)冷的生理鹽水重懸，加入5ul的annexinv-apc混勻后，避光，室溫孵育15分鐘。300g、4min離心棄上清。

9.3.3用預(yù)冷的200ul生理鹽水重懸，加入流式抗體pi，在流式分析儀上分析淋巴細(xì)胞凋亡的情況。另取未作處理的淋巴細(xì)胞作為未染色對(duì)照。

如圖6所示，在加入誘導(dǎo)藥物的情況下，car-t細(xì)胞可迅速達(dá)到早期凋亡狀態(tài)，而普通t細(xì)胞則不受影響，說(shuō)明藥物ap1903是有效安全的誘導(dǎo)藥物，car-t細(xì)胞安全調(diào)控的設(shè)計(jì)成功。

綜上，我們用流式等分析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，修飾的car-t淋巴細(xì)胞具有高于普通cd8t淋巴細(xì)胞對(duì)her2乳腺癌細(xì)胞的殺傷能力，同時(shí)，在藥物ap1903的調(diào)控下，car-t細(xì)胞能夠在短時(shí)間內(nèi)快速誘導(dǎo)自身凋亡，當(dāng)大量car-t細(xì)胞輸入體內(nèi)，在其快速地殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)，有可能會(huì)因?yàn)槟[瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的碎片等，引起自身機(jī)體的短時(shí)間內(nèi)大量炎癥因子的產(chǎn)生，或因?yàn)榇罅繗a(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)損傷正常細(xì)胞時(shí)，可以應(yīng)用這一“安全按鈕”(即藥物ap1903)清除異常的cart細(xì)胞而保障機(jī)體的穩(wěn)定安全。

最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。

sequencelisting

<110>中山大學(xué)

<120>一種嵌合抗原受體并融合誘導(dǎo)性凋亡酶的復(fù)合蛋白

<130>2017

<160>13

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>3114

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccagg60

ccgatggcccaggtgcagctggtgcagtctggggcagaggtgaaaaagcccggggagtct120

ctgaagatctcctgtaagggttctggatacagctttaccagctactggatcgcctgggtg180

cgccagatgcccgggaaaggcctggagtacatggggctcatctatcctggtgactctgac240

accaaatacagcccgtccttccaaggccaggtcaccatctcagtcgacaagtccgtcagc300

actgcctacttgcaatggagcagtctgaagccctcggacagcgccgtgtatttttgtgcg360

agacatgacgtgggatattgcagtagttccaactgcgcaaagtggcctgaatacttccag420

cattggggccagggcaccctggtcaccgtctcctcaggtggaggcggttcaggcggaggt480

ggctctggcggtggcggatcgcagtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctgcggcc540

ccaggacagaaggtcaccatctcctgctctggaagcagctccaacattgggaataattat600

gtatcctggtaccagcagctcccaggaacagcccccaaactcctcatctatgatcacacc660

aatcggcccgcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctcc720

ctggccatcagtgggttccggtccgaggatgaggctgattattactgtgcctcctgggac780

tacaccctctcgggctgggtgttcggcggaggaaccaagctgaccgtcctaggtgcggcc840

gccggcggaggaggatctccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaaca900

ccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcg960

gcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatcatctccttcttt1020

cttgcgctgacgtcgactgcgttgctcttcctgctgttcttcctcacgctccgtttctct1080

gttgttaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagacca1140

gtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaagga1200

ggatgtgaactgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcg1260

cccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcgggg1320

ggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatagagtgaagttcagcaggagc1380

gcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctagga1440

cgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatgggggga1500

aagccgcagagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataag1560

atggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcac1620

gatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatg1680

caggccctgccccctcgccatcatcaccaccaccatcagtgcaccaactatgcgctgctg1740

aaactggcgggcgatgtggaaagcaacccgggcccgatgggagtgcaggtggaaaccatc1800

tccccaggagacgggcgcaccttccccaagcgcggccagacctgcgtggtgcactacacc1860

gggatgcttgaagatggaaagaaagttgattcctcccgggacagaaacaagccctttaag1920

tttatgctaggcaagcaggaggtgatccgaggctgggaagaaggggttgcccagatgagt1980

gtgggtcagagagccaaactgactatatctccagattatgcctatggtgccactgggcac2040

ccaggcatcatcccaccacatgccactctcgtcttcgatgtggagcttctaaaactggaa2100

agcggcggcggcagcactaacaggcaagcagcaaagttgtcgaagccaaccctagaaaac2160

cttaccccagtggtgctcagaccagagattcgcaaaccagaggttctcagaccggaaaca2220

cccagaccagtggacattggttctggaggatttggtgatgtcggtgctcttgagagtttg2280

aggggaaatgcagatttggcttacatcctgagcatggagccctgtggccactgcctcatt2340

atcaacaatgtgaacttctgccgtgagtccgggctccgcacccgcactggctccaacatc2400

gactgtgagaagttgcggcgtcgcttctcctcgctgcatttcatggtggaggtgaagggc2460

gacctgactgccaagaaaatggtgctggctttgctggagctggcgcagcaggaccacggt2520

gctctggactgctgcgtggtggtcattctctctcacggctgtcaggccagccacctgcag2580

ttcccaggggctgtctacggcacagatggatgccctgtgtcggtcgagaagattgtgaac2640

atcttcaatgggaccagctgccccagcctgggagggaagcccaagctctttttcatccag2700

gcctgtggtggggagcagaaagaccatgggtttgaggtggcctccacttcccctgaagac2760

gagtcccctggcagtaaccccgagccagatgccaccccgttccaggaaggtttgaggacc2820

ttcgaccagctggacgccatatctagtttgcccacacccagtgacatctttgtgtcctac2880

tctactttcccaggttttgtttcctggagggaccccaagagtggctcctggtacgttgag2940

accctggacgacatctttgagcagtgggctcactctgaagacctgcagtccctcctgctt3000

agggtcgctaatgctgtttcggtgaaagggatttataaacagatgcctggttgctttaat3060

ttcctccggaaaaaacttttctttaaaacatcacatcatcaccaccaccattaa3114

<210>2

<211>1037

<212>prt

<213>人工序列

<223>一種嵌合抗原受體并融合誘導(dǎo)性凋亡酶的復(fù)合蛋白

<400>2

metalaleuprovalthralaleuleuleuproleualaleuleuleu

151015

hisalaalaargprometalaglnvalglnleuvalglnserglyala

202530

gluvallyslysproglygluserleulysilesercyslysglyser

354045

glytyrserphethrsertyrtrpilealatrpvalargglnmetpro

505560

glylysglyleuglutyrmetglyleuiletyrproglyaspserasp

65707580

thrlystyrserproserpheglnglyglnvalthrileservalasp

859095

lysservalserthralatyrleuglntrpserserleulysproser

100105110

aspseralavaltyrphecysalaarghisaspvalglytyrcysser

115120125

serserasncysalalystrpproglutyrpheglnhistrpglygln

130135140

glythrleuvalthrvalserserglyglyglyglyserglyglygly

145150155160

glyserglyglyglyglyserglnservalleuthrglnproproser

165170175

valseralaalaproglyglnlysvalthrilesercysserglyser

180185190

serserasnileglyasnasntyrvalsertrptyrglnglnleupro

195200205

glythralaprolysleuleuiletyrasphisthrasnargproala

210215220

glyvalproaspargpheserglyserlysserglythrseralaser

225230235240

leualaileserglypheargsergluaspglualaasptyrtyrcys

245250255

alasertrpasptyrthrleuserglytrpvalpheglyglyglythr

260265270

lysleuthrvalleuglyalaalaalaglyglyglyglyserproala

275280285

lysprothrthrthrproalaproargproprothrproalaprothr

290295300

ilealaserglnproleuserleuargproglualacysargproala

305310315320

alaglyglyalavalhisthrargglyleuaspphealacysaspile

325330335

ileserphepheleualaleuthrserthralaleuleupheleuleu

340345350

phepheleuthrleuargpheservalvallysargglyarglyslys

355360365

leuleutyrilephelysglnprophemetargprovalglnthrthr

370375380

glnglugluaspglycyssercysargpheprogluglugluglugly

385390395400

glycysgluleuproalalysprothrthrthrproalaproargpro

405410415

prothrproalaprothrilealaserglnproleuserleuargpro

420425430

glualacysargproalaalaglyglyalavalhisthrargglyleu

435440445

aspphealacysaspargvallyspheserargseralaaspalapro

450455460

alatyrglnglnglyglnasnglnleutyrasngluleuasnleugly

465470475480

argarggluglutyraspvalleuasplysargargglyargasppro

485490495

glumetglyglylysproglnargarglysasnproglngluglyleu

500505510

tyrasngluleuglnlysasplysmetalaglualatyrsergluile

515520525

glymetlysglygluargargargglylysglyhisaspglyleutyr

530535540

glnglyleuserthralathrlysaspthrtyraspalaleuhismet

545550555560

glnalaleuproproarghishishishishishisglncysthrasn

565570575

tyralaleuleulysleualaglyaspvalgluserasnproglypro

580585590

metglyvalglnvalgluthrileserproglyaspglyargthrphe

595600605

prolysargglyglnthrcysvalvalhistyrthrglymetleuglu

610615620

aspglylyslysvalaspserserargaspargasnlysprophelys

625630635640

phemetleuglylysglngluvalileargglytrpglugluglyval

645650655

alaglnmetservalglyglnargalalysleuthrileserproasp

660665670

tyralatyrglyalathrglyhisproglyileileproprohisala

675680685

thrleuvalpheaspvalgluleuleulysleugluserglyglygly

690695700

serthrasnargglnalaalalysleuserlysprothrleugluasn

705710715720

leuthrprovalvalleuargprogluilearglysprogluvalleu

725730735

argprogluthrproargprovalaspileglyserglyglyphegly

740745750

aspvalglyalaleugluserleuargglyasnalaaspleualatyr

755760765

ileleusermetgluprocysglyhiscysleuileileasnasnval

770775780

asnphecysarggluserglyleuargthrargthrglyserasnile

785790795800

aspcysglulysleuargargargpheserserleuhisphemetval

805810815

gluvallysglyaspleuthralalyslysmetvalleualaleuleu

820825830

gluleualaglnglnasphisglyalaleuaspcyscysvalvalval

835840845

ileleuserhisglycysglnalaserhisleuglnpheproglyala

850855860

valtyrglythraspglycysprovalservalglulysilevalasn

865870875880

ilepheasnglythrsercysproserleuglyglylysprolysleu

885890895

phepheileglnalacysglyglygluglnlysasphisglypheglu

900905910

valalaserthrserprogluaspgluserproglyserasnproglu

915920925

proaspalathrpropheglngluglyleuargthrpheaspglnleu

930935940

aspalaileserserleuprothrproseraspilephevalsertyr

945950955960

serthrpheproglyphevalsertrpargaspprolysserglyser

965970975

trptyrvalgluthrleuaspaspilephegluglntrpalahisser

980985990

gluaspleuglnserleuleuleuargvalalaasnalavalserval

99510001005

lysglyiletyrlysglnmetproglycyspheasnpheleuarg

101010151020

lyslysleuphephelysthrserhishishishishishis

102510301035

<210>3

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gggccatggcccaggtgcagctgttgcagtctggggcagag41

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<212>dna

<213>人工序列

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ttgcggccgctccggaattcacctaggacggtcagcttggtccc44

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<213>人工序列

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ccagcgaagcccaccacgac20

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<212>dna

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aggagatgatatcacaggcgaagtccagcc30

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ttatgatgttttaaagaaaagttttttccg30