本發(fā)明涉及一種具有抑制ptp1b活性的間苯三酚衍生物及其制備方法、應(yīng)用，是通過植物化學(xué)的手段從烏墨[eugeniajambolanalam]種子中分離得到的16個間苯三酚衍生物，此類化合物在ptp1b抑制劑開發(fā)、糖尿病以及肥胖等疾病的臨床預(yù)防與治療方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：糖尿病是胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙導(dǎo)致的一種以高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病患者中超過90％為ⅱ型糖尿病，需通過口服降糖藥物來控制血糖。目前臨床上使用的口服降糖藥均存在一些副作用及禁忌癥(如低血糖，損害腎臟功能，體重增加，胃腸道反應(yīng)等)，且絕大多數(shù)對糖尿病并發(fā)癥作用甚微。蛋白酪氨酸磷酸酶1b(proteintyrosinephosphatase1b，ptp1b)能催化蛋白質(zhì)磷酸化酪氨酸殘基脫去磷酸基團(tuán)。ptp1b在胰島素敏感組織中廣泛表達(dá)，通過去磷酸化被激活的胰島素受體(ir)及其底物(irs)而發(fā)揮生理活性，在胰島素信號通路中起關(guān)鍵的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)代研究結(jié)果表明ptp1b的過度表達(dá)可引起胰島素抵抗和(或)瘦素抵抗進(jìn)而導(dǎo)致ⅱ型糖尿病和(或)肥胖的發(fā)生。ptp1b目前已經(jīng)成為治療糖尿病和肥胖的一個重要藥物靶點，ptp1b抑制劑對肥胖的協(xié)同治療作用使其與其它口服降糖藥相比具有獨特的優(yōu)越性。烏墨[eugeniajambolanalam.]又稱海南蒲桃、烏楣，是桃金娘科蒲桃屬植物，多生長于熱帶、南亞熱帶地區(qū)。主產(chǎn)于印度，在我國福建、云南、廣西、海南及臺灣等地多有分布。種子長橢圓形，具強(qiáng)烈的澀味，微苦。烏墨種子在世界范圍內(nèi)用于治療糖尿病已有逾百年的歷史。目前從體外、動物以及人體臨床實驗等不同層次已證實烏墨種子的確具有良好的抗糖尿病降血糖的功效。本發(fā)明所涉及的化合物1-16其抑制ptp1b的活性為首次發(fā)現(xiàn)，其中化合物9為已知化合物，其余化合物均為新化合物。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明是從烏墨[eugeniajambolanalam.]種子中提取分離得到的具有脂肪側(cè)鏈的?；g苯三酚衍生物，經(jīng)藥理實驗研究表明，這類化合物對ptp1b具有顯著抑制活性。本發(fā)明的目的之一是提供具有脂肪側(cè)鏈的抑制ptp1b活性的間苯三酚衍生物及其制備方法。本發(fā)明的另一個目的在于提供所述間苯三酚衍生物的用途，包括所述間苯三酚衍生物在制備ptp1b抑制劑的藥物中的應(yīng)用，進(jìn)一步在制備治療糖尿病、肥胖癥以及并發(fā)癥藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明解決技術(shù)問題采用技術(shù)方案如下：一種具有ptp1b抑制活性的間苯三酚類化合物，其結(jié)構(gòu)通式為式i所示化合物：其中：r1為甲基或氫，r2為甲基或氫，r1和r2可以相同或不同；r3為含有12～26個碳的烷烴或烯烴側(cè)鏈。上述的間苯三酚類化合物，主要是從烏墨[eugeniajambolanalam]種子中分離得到的16個間苯三酚類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式可以具體如下：本發(fā)明提供制備該類?；g苯三酚衍生物的方法，采用如下步驟：1)制備提取物浸膏取烏墨種子粉碎，用石油醚按固液比1:2對粉碎后的種子粉末冷浸24小時，過濾，此步驟重復(fù)2次。濾液棄去后，濾渣用70％丙酮-水溶液按固液比1:2冷浸3-4次，每次24小時，過濾，合并濾液。將此濾液減壓濃縮除去丙酮和水后得粗浸膏。2)分離純化(1)將上述70％丙酮-水提取物分散于水中制成混懸液，將混懸液用乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，所得萃取液經(jīng)減壓濃縮分別得到乙酸乙酯提取浸膏和正丁醇提取浸膏。(2)將乙酸乙酯浸膏進(jìn)行mci小孔樹脂柱層析，以甲醇/水梯度洗脫，分別得到100％水洗脫組分、20％甲醇洗脫組分、40％甲醇洗脫組分、60％甲醇洗脫組分、80％甲醇洗脫組分以及100％甲醇洗脫組分，最后用丙酮沖洗mci柱。(3)將100％甲醇洗脫組分經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-丙酮梯度洗脫(15:1-0:1)，經(jīng)tlc顯色合并相似組分，共得到11個組分(fr.a-k)。組分b經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，100％甲醇洗脫，經(jīng)tlc顯色合并相似組分，得到6個亞組分(fr.b1-b6)。其中b5組分經(jīng)硅膠柱層析，二氯甲烷-乙酸乙酯(60:1)洗脫，又經(jīng)半制備高效液相色譜純化(甲醇-水93:7)，得到化合物2，6和14。b6組分經(jīng)半制備高效液相色譜純化(甲醇-水92:8)，得到化合物10。組分c經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，100％甲醇洗脫，經(jīng)tlc顯色合并相似組分，得到4個亞組分(fr.c1-c4)。其中c2組分經(jīng)硅膠柱層析，二氯甲烷-乙酸乙酯(40:1-20:1)梯度洗脫，又經(jīng)半制備高效液相色譜純化(甲醇-水94:6)，得到化合物1，3/4，5，7/8，9，11/12，13和15/16。在上述制備方法中，在制備提取物浸膏步驟中，先用石油醚進(jìn)行脫脂處理，隨后采用70％丙酮-水進(jìn)行冷浸。在上述制備方法中，，在分離純化步驟中，采用mci小孔樹脂對乙酸乙酯提取浸膏進(jìn)行分離，并用甲醇-水梯度洗脫(梯度為0:100，20:80，40:60，60:40，80:20和100:0)。在上述制備方法中，在分離純化步驟中，半制備高效液相色譜柱填料為rp-c18。本發(fā)明對所得具有脂肪側(cè)鏈的?；g苯三酚衍生物進(jìn)行了體外ptp1b抑制活性實驗，結(jié)果表明，所述間苯三酚衍生物對ptp1b有顯著的抑制活性。因此可用來制備ptp1b抑制劑，用于治療糖尿病、肥胖癥及其并發(fā)癥，可以用于制備治療和預(yù)防糖尿病藥物和肥胖癥藥物或藥物保健品。附圖說明圖1：化合物1的1hnmr譜。圖2：化合物1的13cnmr譜。圖3：化合物5的1hnmr譜。圖4：化合物5的13cnmr譜。圖5：化合物10的1hnmr譜。圖6：化合物10的13cnmr譜。圖7：化合物13的1hnmr譜。圖8：化合物13的13cnmr譜。具體實施方式以下結(jié)合技術(shù)方案和附圖詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實施例。實施例1具有脂肪側(cè)鏈的酰基間苯三酚衍生物的制備1.制備烏墨種子提取物浸膏(1)制備提取液烏墨種子(5kg)粉碎，用石油醚10l對粉碎后的種子粉末冷浸24小時，過濾，此步驟重復(fù)2次。石油醚提取液棄去，濾渣用70％丙酮-水溶液10l冷浸4次，每次24小時，過濾，合并濾液，即為烏墨種子提取液。(2)制備提取物浸膏將上述提取液在溫度≤40℃條件下減壓濃縮除去丙酮和水后得粗浸膏1200g。2.分離純化(1)將上述70％丙酮-水提取物分散于2.5l水中制成混懸液，將混懸液依次用乙酸乙酯(2.5l)和正丁醇(2.5l)萃取4次，所得萃取液經(jīng)減壓濃縮分別得到乙酸乙酯提取浸膏(185g)和正丁醇提取浸膏(250g)。(2)將乙酸乙酯浸膏進(jìn)行mci小孔樹脂柱層析，以甲醇/水梯度洗脫，分別得到100％水洗脫組分、20％甲醇洗脫組分、40％甲醇洗脫組分、60％甲醇洗脫組分、80％甲醇洗脫組分以及100％甲醇洗脫組分，最后用丙酮沖洗mci柱。(3)將100％甲醇洗脫組分(33g)經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-丙酮梯度洗脫(15:1-0:1)，經(jīng)tlc顯色合并相似組分，共得到11個組分(fr.a-k)。(4)組分b(2.2g)經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，100％甲醇洗脫，經(jīng)tlc顯色合并相似組分，得到6個亞組分(fr.b1-b6)。(5)b5組分(92.6mg)經(jīng)硅膠柱層析，二氯甲烷-乙酸乙酯(60:1)洗脫，又經(jīng)半制備高效液相色譜純化(甲醇-水93:7)，得到本發(fā)明化合物2(13.1mg)，6(13.4mg)和14(6.0mg)。(6)b6組分(12.2mg)經(jīng)半制備高效液相色譜純化(甲醇-水92:8)，得到本發(fā)明化合物10(2.7mg)。(7)組分c(2.1g)經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，100％甲醇洗脫，經(jīng)tlc顯色合并相似組分，得到4個亞組分(fr.c1-c4)。(8)c2組分(260.0mg)經(jīng)硅膠柱層析，二氯甲烷-乙酸乙酯(40:1-20:1)梯度洗脫，又經(jīng)半制備高效液相色譜純化(甲醇-水94:6)，得到本發(fā)明化合物1(4.9mg)，3/4(15.8mg)，5(8.3mg)，7/8(6.7mg)，9(6.7mg)，11/12(5.5mg)，13(2.1mg)和15/16(9.5mg)?；衔?-8以及10-16經(jīng)鑒定為新化合物，化合物9為已知物spiralisonec。3.結(jié)構(gòu)鑒定根據(jù)uv、nmr、ms、ir、旋光等數(shù)據(jù)確定了化合物1-16的結(jié)構(gòu)。其具體理化數(shù)據(jù)如下：化合物1:無色膠狀物；0(c1.0，meoh)；uvmax(meoh)λmax(logε)332(4.14)，290(4.82)nm；ir(film)νmax3294，3011，2928，2855，1640，1608，1506，1464，1399，1329，1161，1066，1010，966，886，835cm-1；hresimsm/z429.2639[m+h]+(calcdforc26h37o5，429.2641)；1hnmr和13cnmr數(shù)據(jù)見表1。化合物2:黃色膠狀物；0(c1.0，meoh)；uvmax(meoh)λmax(logε)348(3.97)，296(4.52)nm；ir(film)νmax3394，2928，2855，1715，1636，1461，1364，1298，1123，895，811cm-1；hresimsm/z455.2806[m-h]-(calcdforc28h39o5，455.2803)；1hnmr和13cnmr數(shù)據(jù)見表1?；衔?/4:白色膠狀物；uvmax(meoh)λmax(logε)346(4.13)，293(4.64)nm；ir(film)νmax3296，3011，2927，2855，1638，1606，1458，1327，1159，1107，891，818cm-1；hresimsm/z465.2625[m+na]+(calcdforc27h38o5na，465.2611)；1hnmr和13cnmr數(shù)據(jù)見表1?；衔?：無色膠狀物；0(c1.0，meoh)；uvmax(meoh)λmax(logε)328(3.90)，287(4.42)nm；ir(film)νmax3334，3010，2926，2855，1641，1609，1464，1328，1276，1161，1066，1011，885，835，722cm-1；hresimsm/z429.2642[m-h]-(calcdforc26h37o5，429.2641)；1hnmr和13cnmr數(shù)據(jù)見表2?；衔?：淺黃色膠狀物；0(c1.0，meoh)；uvmax(meoh)λmax(logε)350(3.99)，296(4.51)nm；ir(film)νmax3389，2929，2857，1711，1635，1613，1461，1364，1239，1190，1122，937，811cm-1；hresimsm/z457.2950[m-h]-(calcdforc28h41o5，457.2959)；1hnmr和13cnmr數(shù)據(jù)見表2。化合物7/8:白色膠狀物；uvmax(meoh)λmax(logε)344(3.94)，293(4.51)nm；ir(film)νmax3313，3010，2927，2856，1639，1609，1498，1462，1329，1188，1161，1109，893cm-1；hresimsm/z467.2756[m+na]+(calcdforc27h40o5na，467.2768)；1hnmr和13cnmr數(shù)據(jù)見表2?；衔?：淺黃色膠狀物；0(c1.0，meoh)；uvmax(meoh)λmax(logε)345(4.11)，296(4.49)nm；esimsm/z405.2[m-h]-；1hnmr和13cnmr數(shù)據(jù)見表3。化合物10：淺黃色膠狀物；0(c0.8，meoh；uvmax(meoh)λmax(logε)346(4.23)，294(4.69)nm；ir(film)νmax3384，2922，2852，1635，1611，1466，1366，1325，1295，1189，1123，896cm-1；hresimsm/z433.2955[m-h]-(calcdforc26h41o5，433.2594)；1hnmr和13cnmr數(shù)據(jù)見表3?；衔?1/12:白色無定型粉末；uvmax(meoh)λmax(logε)334(3.93)，293(4.58)nm；ir(film)νmax3344，2921，2852，1639，1607，1465，1328，1161，1107，891，819cm-1；hresimsm/z419.2822[m-h]-(calcdforc25h39o5,419.2797)；1hnmr和13cnmr數(shù)據(jù)見表3。化合物13：無色膠狀物；0(c1.0，meoh)；uvmax(meoh)λmax(logε)332(4.06)，290(4.52)nm；ir(film)νmax3320，2926，2855，1642，1508，1464，1330，1161，1068，1011，885，837cm-1；hresimsm/z403.2497[m-h]-(calcdforc24h35o5，403.2484)；esi-ms/ms[m+h-h2o]+m/z387.0，345.0，331.0，317.0，303.1，289.0，275.1，260.9，233.1，218.9，205.0，178.9，152.9，138.9，68.9，57.0，42.9；1hnmr和13cnmr數(shù)據(jù)見表4?；衔?4：淺黃色膠狀物；+4.3(c0.9，meoh)；uvmax(meoh)λmax(logε)330(3.88)，290(4.41)nm；ir(film)νmax3360，2924，2854，1641，1464，1328，1278，1161，1067，886，834cm-1；hresimsm/z431.2794[m-h]-(calcdforc26h39o5，431.2797)；esi-ms/ms[m+h-h2o]+m/z415.0，373.3，359.1，345.0，331.0，317.0，302.9，288.7，275.0，260.8，219.1，205.0，179.0，153.0，138.9，69.2，57.1，43.1；1hnmr和13cnmr數(shù)據(jù)見表4?；衔?5/16:白色無定型粉末；uvmax(meoh)λmax(logε)338(3.73)，292(4.28)nm；ir(film)νmax3353，2925，2854，1638，1607，1461，1328，1160，1109，889，820cm-1；hresimsm/z419.2808[m+h]+(calcdforc25h39o5，419.2797)；esi-ms/ms[m+h-h2o]+m/z401.0，359.0，345.0，331.0，317.1，303.2，289.0，274.7，260.7，219.0，192.9，176.8，166.9，152.9，56.8，43.0；1hnmr和13cnmr數(shù)據(jù)見表4。table1.化合物1-4在cdcl3的1hnmr(600mhz)和13cnmr(150mhz)數(shù)據(jù)a,b部分信號重疊table2.化合物5-8在cdcl3的1hnmr(600mhz)和13cnmr(150mhz)數(shù)據(jù)a部分信號重疊table3.化合物9–12a的1hnmr(600mhz)和13cnmr(150mhz)數(shù)據(jù)a化合物9，11和12在dmso-d6中檢測，化合物10在cdcl3中檢測b部分重疊信號table4.化合物13–16a的1hnmr(600mhz)和13cnmr(150mhz)數(shù)據(jù)a化合物13和14在cdcl3中檢測，化合物15和16在dmso-d6中檢測b部分重疊信號實施例2ptp1b抑制活性實驗1實驗原理及方法(1)根據(jù)ptp1b水解掉對硝基苯磷酸(p-npp)一個磷酸基團(tuán)的產(chǎn)物在波長405nm處有吸收的原理來測定ptp1b的活性。(2)100μl反應(yīng)體系：p-npp2mm；1.15μg/mlgst-ptp1b1-321蛋白溶液；樣品或dmso；緩沖液[50mm4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid(hepes)，ph7.3；100mmnacl；0.1％牛血清白蛋白(bsa)；1mm二硫蘇糖醇(dtt)]。(3)實驗方法：在96孔板中加入ptp1b蛋白溶液1μl(0.115mg/ml)，測試樣品或陽性對照樣品1μl或dmso1μl，緩沖液96μl，混勻，在30℃共孵育10分鐘。然后加入2μlp-npp(20mm)反應(yīng)30min，最后加入3mnaoh終止反應(yīng)，405nm利用spectramaxmd5酶標(biāo)儀(美國moleculardevices)測定吸光度。熊果酸和3-(3,5-dibromo-4-hydroxy-benzoyl)-2-ethyl–benzofuran-6-sulfonicacid-(4-(thiazol-2-ylsulfamyl)-phenyl)-amide(ptp1binhibitor)為陽性對照，不含酶溶液的系統(tǒng)為空白。抑制率＝(od405空白－od405樣品)/od405空白×100％。2實驗結(jié)果專利所述化合物的ptp1b抑制活性結(jié)果如表5所示。table5.化合物1-9,11,12,14-16對ptp1b的抑制活性3實驗結(jié)論該類具有脂肪側(cè)鏈的酰基間苯三酚衍生物具有較好的ptp1b抑制活性。因此本發(fā)明的間苯三酚衍生物可用于制備糖尿病、肥胖癥以及并發(fā)癥的藥物中。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12