本發(fā)明涉及化合物提取分離領(lǐng)域，特別涉及吳茱萸中新喹諾酮類生物堿及其制備方法、應(yīng)用和藥物組合物。
背景技術(shù)：
吳茱萸（Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.），別名吳萸、茶辣、漆辣子、臭辣子樹、左力純幽子、米辣子等。通常分大花吳茱萸、中花吳茱萸和小花吳茱萸等幾個品種。小喬木或灌木，高3-5米，嫩枝暗紫紅色，與嫩芽同被灰黃或紅銹色絨毛，或疏短毛。生于平地至海拔1500米山地疏林或灌木叢中，多見于向陽坡地。各地有小或大量栽種。嫩果經(jīng)泡制涼干后即是傳統(tǒng)中藥吳茱萸，簡稱吳萸，是苦味健胃劑和鎮(zhèn)痛劑，又作驅(qū)蛔蟲藥。其性熱味苦辛，有散寒止痛、降逆止嘔之功，用于治療肝胃虛寒、陰濁上逆所致的頭痛或胃脘疼痛等癥。
隨著我國老齡化社會進程的加快，老年人口數(shù)量不斷增加。據(jù)統(tǒng)計，截止至2020年，我國老齡化水平將達到17.17％，各種老年病患者人數(shù)也呈上升趨勢。在發(fā)達國家，老年癡呆癥作為最常見的神經(jīng)退行性疾病，分別成為了僅次于心血管病、癌癥的第三、四大死亡殺手。而我國神經(jīng)退行性疾病患者的人數(shù)，已位居世界各國之首。目前尚未有防治神經(jīng)退行性疾病的特效藥物可供選擇，因此開發(fā)出具有靶向性，副作用小，能有效控制并逆轉(zhuǎn)病情的藥物勢在必行。我國中藥資源豐富，毒副作用小，從中藥中尋找新型神經(jīng)退行性疾病治療藥物是新藥開發(fā)研究的重要途徑之一。但是中藥成分復(fù)雜，有效成分不明確，療效不穩(wěn)定，作用機理不清楚，嚴重影響了臨床上的使用以及中藥進入國際主流市場，因此從傳統(tǒng)藥物的天然資源中尋找構(gòu)型、機制明確的特效神經(jīng)退行性疾病治療藥物是醫(yī)藥科研工作者今后相當(dāng)長時間內(nèi)的迫切任務(wù)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
吳茱萸95 % 乙醇提取物具治療神經(jīng)退行性疾病的作用，從有效部位中分離得到1個新喹諾酮類生物堿，藥效學(xué)評價顯示其具有很好的神經(jīng)保護的作用。
本發(fā)明的目的之一在于提供一種吳茱萸中新喹諾酮類生物堿。
本發(fā)明的目的之二在于提供了一種吳茱萸中新喹諾酮類生物堿的制備方法。
本發(fā)明的目的之三在于提供了一種吳茱萸中新喹諾酮類生物堿在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的之四在于提供一種藥物組合物，含有吳茱萸中新喹諾酮類生物堿化合物1。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：吳茱萸中新喹諾酮類生物堿，具有化合物1所示結(jié)構(gòu)
1。
吳茱萸中新喹諾酮類生物堿化合物 的制備方法，每制備化合物1,10mg，包括如下步驟：
a. 吳茱萸藥材10 kg，用 90% 乙醇回流提取 3 次，每次 2h，合并提取液減壓濃縮得浸膏 (800g)；
b. 將該浸膏用水分散后，依次用石油醚、氯仿、正丁醇多次萃取，分別減壓回收溶劑。依次得到各萃取物 32、200、320 g；
c. 三氯甲烷萃取物200g經(jīng)過硅膠 (200-300目，3 kg) 柱色譜粗分，CHCl3/CH3COCH3(100:1→1:100) 梯度洗脫, 每個流份 2000 ml, 共收集 167個流分，之后將167個流份通過TLC薄層檢識合并得到 5個流Fr (1-5)；
d. Fr.3 (30 g) 經(jīng)開放ODS柱色譜 (MeOH:H2O, 40:20-90:10) 洗脫, 檢識合并后得到Fr.A及Fr.B兩部分。Fr.B在經(jīng)硅膠柱色譜 (乙酸乙酯:甲醇，20:1-1:1) 洗脫得到Fr.B1-B7；
e. Fr.B7經(jīng)硅膠柱色譜(C:M, 20:1-1:1) 洗脫所得Fr.7a3部分經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜及Sephadex LH-20純化后再經(jīng)pHPLC (60% MeOH:H2O) 得新喹諾酮類生物堿類化合物1（10mg）。
吳茱萸中新喹諾酮類生物堿化合物 1在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用。所述神經(jīng)退行性疾病為腦卒中、癡呆、神經(jīng)炎癥、重金屬中毒、神經(jīng)毒劑中毒。所述癡呆為早老性癡呆或血管性癡呆。
一種藥物組合物，其中，含有吳茱萸中新喹諾酮類生物堿化合物 1以及藥效學(xué)上可接受的載體。
根據(jù)本發(fā)明的思路，對吳茱萸中新喹諾酮類生物堿類化合物進行了神經(jīng)保護相關(guān)的藥理實驗。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡丟失的重要原因，是神經(jīng)退行性疾病的共性特征。引起氧化應(yīng)激的原因有很多種，如腦缺血，神經(jīng)炎癥，興奮性遞質(zhì)釋放重攝取機制障礙，重金屬暴露，神經(jīng)毒性劑暴露等，表現(xiàn)為細胞內(nèi)自由基增加，引起脂質(zhì)過氧化，線粒體功能障礙繼而激活凋亡通路等。谷氨酸，硝普鈉雖然引發(fā)神經(jīng)元凋亡丟失的機制不一，但都是近年來許多國內(nèi)外學(xué)者倡導(dǎo)的神經(jīng)元損傷模型的誘發(fā)劑。研究認為，腦內(nèi)興奮性遞質(zhì)谷氨酸過量通常引起神經(jīng)元膜上NMDA 受體過度激活，從而導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生氧化應(yīng)激并丟失，而硝普鈉是一種NO 的供體，NO 可傳遞氧自由基透過線粒體膜，使線粒體功能失調(diào)繼而發(fā)生凋亡，其發(fā)生機制，病理生理改變與臨床老年癡呆患者腦內(nèi)表現(xiàn)具有相似性。應(yīng)用谷氨酸，硝普鈉制作神經(jīng)元損傷模型條件要求低，技術(shù)易于掌握，可靠性強，重復(fù)性好，因此在本研究中，采用谷氨酸過載，硝普鈉 (SNP) 暴露制作神經(jīng)元損傷模型。
本發(fā)明提供的一個吳茱萸新喹諾酮類生物堿在體外谷氨酸，硝普鈉誘發(fā)的大鼠大腦皮層神經(jīng)元死亡的試驗中均顯示出優(yōu)良的神經(jīng)保護作用。
陽性對照藥物為依達拉奉 (edaravone)，依達拉奉是以自由基清除為主要作用機制的新型抗老年癡呆藥物，能有效抑制因腦缺血導(dǎo)致的腦細胞、血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)細胞的氧化應(yīng)激損傷。
對硝普鈉誘發(fā)大鼠大腦皮層神經(jīng)元凋亡的保護作用體外研究中，將本發(fā)明化合物與硝普鈉(350 μM) 用神經(jīng)元培養(yǎng)基稀釋，和大鼠大腦皮層神經(jīng)元溫孵24 小時后，MTT 法測定細胞存活率，同時進行正常對照組和陽性對照組試驗。實驗結(jié)果表明，正常對照組加入硝普鈉后570 nm 處吸光度值(OD570) 明顯降低，陽性對照組和本發(fā)明化合物OD570 明顯回升，與依達拉奉(edaravone) 的細胞存活率相當(dāng)，部分新化合物的細胞存活率比依達拉奉高。
因此本發(fā)明有益效果：吳茱萸中新喹諾酮類生物堿化合物 1可用于制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)退行性疾病的藥物。優(yōu)選的神經(jīng)退行性疾病選自腦卒中、癡呆、神經(jīng)炎癥、重金屬中毒、神經(jīng)毒劑中毒。優(yōu)選的癡呆選自早老性癡呆、血管性癡呆。
附圖說明
圖1 吳茱萸的提取分離流程圖。
具體實施方式
下面的實施例及藥理活性實驗進一步說明本發(fā)明，但并不意味著對本發(fā)明的任何限制。
實施例1：吳茱萸中新喹諾酮類生物堿化合物 1的制備方法，包括如下步驟：
吳茱萸藥材10 kg，用 90% 乙醇回流提取 3 次，每次 2h，合并提取液減壓濃縮得浸膏 (800g)。將該浸膏用水分散后，依次用石油醚、氯仿、正丁醇多次萃取，分別減壓回收溶劑。依次得到各萃取物 32、200、320 g。三氯甲烷萃取物200g經(jīng)過硅膠 (200-300目，3 kg) 柱色譜粗分，CHCl3/CH3COCH3 (100:1→1:100) 梯度洗脫, 每個流份 2000 ml, 共收集 167個流分，之后將167個流份通過TLC薄層檢識合并得到 5個流Fr (1-5)；Fr.3 (30 g) 經(jīng)開放ODS柱色譜 (MeOH:H2O, 40:20-90:10) 洗脫, 檢識合并后得到Fr.A及Fr.B兩部分。Fr.B在經(jīng)硅膠柱色譜 (乙酸乙酯:甲醇，20:1-1:1) 洗脫得到Fr.B1-B7。Fr.B7經(jīng)硅膠柱色譜(C:M, 20:1-1:1) 洗脫所得Fr.7a3部分經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜及Sephadex LH-20純化后再經(jīng)pHPLC (60% MeOH:H2O) 得新喹諾酮類化合物1（10mg）。
實施例2：吳茱萸中新喹諾酮類生物堿化合物 1在制備預(yù)防和/或治療神經(jīng)退行性疾病藥物中的應(yīng)用。所述神經(jīng)退行性疾病為腦卒中、癡呆、神經(jīng)炎癥、重金屬中毒、神經(jīng)毒劑中毒。所述癡呆為早老性癡呆或血管性癡呆。
吳茱萸新喹諾酮類生物堿類化合物的理化、波譜數(shù)據(jù)如下:
黃色油狀，ESI-MS m/z 256 [M + H]+。1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) 和13C-NMR(CDCl3，125 MHz）數(shù)據(jù)見下表
表1 化合物1 的1H 和13C-NMR 數(shù)據(jù)(CDCl3，J in Hz)
a The signals were overlapped.
藥理實驗
試驗材料1、受試藥：本發(fā)明單體化合物。2、陽性對照藥：依達拉奉，由中國食品藥品檢定研究院提供。HPLC 檢測純度 ＞ 98 ％。3、細胞：出生當(dāng)天大鼠大腦皮層神經(jīng)元。4、培養(yǎng)基：DMEM，F(xiàn)BS，美國 Gibco 公司生產(chǎn)；ES，美國 Hyclone 公司生產(chǎn)。5、硝普鈉由中國食品藥品檢定研究院提供，谷氨酸由北京化工廠提供。
實驗例1：本發(fā)明化合物對大鼠大腦皮層神經(jīng)元存活狀態(tài)的影響以及在硝普鈉誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡模型中的保護作用
化合物對神經(jīng)元存活狀態(tài)的影響研究中，將原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元(DIV-9) 分為對照組和給藥組(10 μM)，n = 6 ；在化合物對硝普鈉誘發(fā)神經(jīng)元凋亡模型的保護作用研究中，將原代培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元(DIV-7) 分為對照組，硝普鈉(350 μM) 造模組，硝普鈉 (350 μM) + 依達拉奉(100 μM) 給藥組，硝普鈉(350 μM) + 化合物(10 μM) 給藥組，n = 6。給藥后，細胞置于細胞孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 小時，MTT 法(570 nm) 測定細胞存活率。以對照組吸光度為標(biāo)準，計算各組吸光度與對照組的比值。
表2化合物對大鼠皮層神經(jīng)元存活狀態(tài)的影響
表3化合物對硝普鈉和谷氨酸誘發(fā)大鼠皮層神經(jīng)元凋亡的作用效果
注：* p<0.05 vs mod，** p<0.01 vs mod，*** p<0.001vs mod，## P ＜ 0.01vs control.
實驗結(jié)果表明：對已經(jīng)鑒定的本發(fā)明化合物進了初步的細胞模型篩選，本發(fā)明化合物體現(xiàn)了神經(jīng)保護活性，即在硝普鈉損傷原代神經(jīng)元模型和谷氨酸誘導(dǎo)原代神經(jīng)元毒性模型中均具有良好的神經(jīng)保護活性。其對硝普鈉誘發(fā)大鼠皮層神經(jīng)元凋亡的保護作用效果活性優(yōu)于依達拉奉。
實施例3：一種藥物組合物，含有吳茱萸中新喹諾酮類生物堿化合物 1以及藥效學(xué)上可接受的載體。該藥物組合物可根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備。可通過將本發(fā)明化合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的固體或液體賦形劑和/或輔劑結(jié)合，制成適于人或動物使用的任何劑型。本發(fā)明化合物在其藥物組合物中的含量通常為0.1-95 重量％。
本發(fā)明化合物或含有它的藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮膚、陰道、直腸等。給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型或半固體劑型。液體劑型可以是溶液劑(包括真溶液和膠體溶液)、乳劑( 包括o/w 型、w/o 型和復(fù)乳)、混懸劑、注射劑( 包括水針劑、粉針劑和輸液)、滴眼劑、滴鼻劑、洗劑和搽劑等；固體劑型可以是片劑( 包括普通片、腸溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡騰片、口腔崩解片)、膠囊劑( 包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊)、顆粒劑、散劑、微丸、滴丸、栓劑、膜劑、貼片、氣( 粉) 霧劑、噴霧劑等；半固體劑型可以是軟膏劑、凝膠劑、糊劑等。
本發(fā)明化合物可以制成普通制劑、也制成是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將本發(fā)明化合物制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種賦形劑，包括稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑。稀釋劑可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣、碳酸鈣等；濕潤劑可以是水、乙醇、異丙醇等；粘合劑可以是淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纖維素、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素、丙烯酸樹脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解劑可以是干淀粉、微晶纖維素、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉等；潤滑劑和助流劑可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸鹽、酒石酸、液體石蠟、聚乙二醇等。
還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。
為了將給藥單元制成膠囊劑，可以將有效成分本發(fā)明化合物與稀釋劑、助流劑混合，將混合物直接置于硬膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分本發(fā)明化合物先與稀釋劑、黏合劑、崩解劑制成顆?；蛭⑼?，再置于硬膠囊或軟膠囊中。用于制備本發(fā)明化合物片劑的各稀釋劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、助流劑品種也可用于制備本發(fā)明化合物的膠囊劑。
為將本發(fā)明化合物制成注射劑，可以用水、乙醇、異丙醇、丙二醇或它們的混合物作溶劑并加入適量本領(lǐng)域常用的增溶劑、助溶劑、pH 調(diào)劑劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑。增溶劑或助溶劑可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羥丙基-β- 環(huán)糊精等；pH 調(diào)劑劑可以是磷酸鹽、醋酸鹽、鹽酸、氫氧化鈉等；滲透壓調(diào)節(jié)劑可以是氯化鈉、甘露醇、葡萄糖、磷酸鹽、醋酸鹽等。如制備凍干粉針劑，還可加入甘露醇、葡萄糖等作為支撐劑。
此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑或其它添加劑。
為達到用藥目的，增強治療效果，本發(fā)明的藥物或藥物組合物可用任何公知的給藥方法給藥。
本發(fā)明化合物藥物組合物的給藥劑量依照所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴重程度，患者或動物的個體情況，給藥途徑和劑型等可以有大范圍的變化。一般來講，本發(fā)明化合物的每天的合適劑量范圍為0.001-150mg/Kg 體重，優(yōu)選為0.1-100mg/Kg 體重，更優(yōu)選為1-60mg/Kg 體重，最優(yōu)選為2-30mg/Kg 體重。上述劑量可以一個劑量單位或分成幾個劑量單位給藥，這取決于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗以及包括運用其它治療手段的給藥方案。
本發(fā)明的化合物或組合物可單獨服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用。當(dāng)本發(fā)明的化合物與其它治療藥物存在協(xié)同作用時，應(yīng)根據(jù)實際情況調(diào)整它的劑量。
以上實施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。