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一種特異性引物檢測鼠源性成分的方法與流程

文檔序號:11145880閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種特異性引物檢測鼠源性成分的方法,其特征在于工藝過程分為特異性引物設(shè)計(jì)合成、DNA提取、反應(yīng)體系建立、PCR擴(kuò)增、鼠源性成分分析結(jié)果評價(jià)五個(gè)步驟:

(1)、特異性引物設(shè)計(jì)合成:根據(jù)Genbank中鼠的線粒體細(xì)胞色素b基因序列設(shè)計(jì)并合成特異性引物,特異性引物的上游引物F的堿基序列為5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’,特異性引物的下游引物R的堿基序列為5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’;

(2)、DNA提取:取鼠肌肉組織1g研磨成糜狀,然后按照組織基因組DNA提取試劑盒使用說明操作,提取DNA,經(jīng)核酸蛋白分析儀測定提取的DNA的濃度為220ng/μL,純度為1.85,用RNase/DNase-free H2O將提取的DNA濃度稀釋為5ng/μL,備用;

(3)、反應(yīng)體系建立:以步驟(2)提取的DNA為模板,用特異性引物建立10μL的PCR反應(yīng)體系,取體積為2μL和濃度為5ng/μL的DNA模板、體積為1μL和濃度為5μM的上游引物F、體積為1μL和濃度為5μM的下游引物R以及體積為5μL的2×Master mixture,剩余部分用RNase/DNase-free H2O補(bǔ)足,實(shí)現(xiàn)反應(yīng)體系的建立,并設(shè)置平行試驗(yàn);

(4)、PCR擴(kuò)增:將步驟(3)建立的反應(yīng)體系置于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上,設(shè)置以下條件:①、模板變性:95℃-5min;②、QPCR擴(kuò)增:95℃-20s,60℃-10s,72℃-10s,40個(gè)循環(huán),在72℃時(shí)采集熒光信號;③、熔解曲線:95℃-5s,65℃to 97℃的速率為0.5℃/5s,1個(gè)循環(huán);

(5)、鼠源性成分分析結(jié)果評價(jià):測定并加權(quán)計(jì)算實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物平均Cp值,Cp值小于33,熔解曲線顯示有明顯的單一主峰,無非特異性PCR產(chǎn)物,表明利用該特異性引物能夠檢測到鼠源性成分,且特異性和重復(fù)性良好。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性引物檢測鼠源性成分的方法,其特征在于所述特異性引物根據(jù)Genbank中鼠的線粒體細(xì)胞色素b基因序列設(shè)計(jì)并合成的,所述特異性引物的上游引物F的堿基序列為5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’,所述特異性引物的下游引物R的堿基序列為5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性引物檢測鼠源性成分的方法,其特征在于特異性引物的堿基序列是由上海捷瑞生物工程有限公司合成的;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為Roche生物科技公司生產(chǎn)的LightCycler 480式實(shí)時(shí)熒光定量PCR;核酸蛋白分析儀為Biochrom有限公司生產(chǎn)的BioDrop-μLite式核酸蛋白分析儀;高速冷凍離心機(jī)是湖南湘儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)的臺(tái)式高速冷凍離心機(jī);2×Mastermixture為Roche生物科技公司生產(chǎn)的LightCycler480SYBR Green I Master;DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司生產(chǎn)的組織基因組DNA提取試劑盒。

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