本發(fā)明涉及一種檢測硝基還原酶(ntr)的熒光探針，屬于有機小分子熒光探針技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

乏氧即供氧量不足，是很多疾病的重要特征，比如急性心肌梗死、炎癥性疾病以及腫瘤疾病。目前，乏氧狀態(tài)在臨床上已經(jīng)被作為腫瘤惡化的一種指標，因為惡性腫瘤在生長過程中，其對氧的需求量會增加，而腫瘤組織內(nèi)的血液供氧不足，最終導(dǎo)致這部分腫瘤組織缺氧，在臨床上大部分惡性腫瘤在生長過程中存在缺氧區(qū)。這些乏氧細胞不僅減弱了放療、化療的療效，同時也成為了腫瘤復(fù)發(fā)的根源。因此，評估腫瘤內(nèi)的缺氧程度在預(yù)測癌癥治療的效果和相關(guān)研究中至關(guān)重要。

檢測腫瘤區(qū)域缺氧的方法有：血流速度、氧壓力測量、缺氧標記法等，但這些檢測方法在操作過于繁瑣。因此，發(fā)展一種簡單快捷、靈敏、高效的測試方法尤為重要。熒光探針具有廣泛性、高靈敏性和專一性等優(yōu)點，因而受到廣泛關(guān)注。研究證明，缺氧環(huán)境會導(dǎo)致生物體內(nèi)硝基還原酶的含量及活性增加。因此，通過檢測硝基還原酶含量可以評價腫瘤區(qū)域的缺氧程度。

目前，國內(nèi)外報道了許多檢測硝基還原酶的熒光探針，但是這些熒光探針往往在稀溶液狀態(tài)時具有較強的熒光信號，而在聚集狀態(tài)或者濃溶液的狀態(tài)下熒光強度會較小甚至完全淬滅，這就是所說的分子聚集誘導(dǎo)熒光淬滅現(xiàn)象(aggregation-causedquenching，acq)，目前基于分子聚集誘導(dǎo)發(fā)光機制的硝基還原酶熒光探針還未曾有人報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明設(shè)計了一種檢測硝基還原酶的聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aggregation-inducedemission，aie)型熒光探針，在生物體內(nèi)聚集，并且在與硝基還原酶作用前后熒光信號發(fā)生顯著變化。本發(fā)明所報道的aie型硝基還原酶熒光探針在生物活體檢測中顯示出很大的優(yōu)越性，本發(fā)明的aie型熒光探針，通過熒光成像技術(shù)檢測硝基還原酶可用于評價腫瘤區(qū)域缺氧程度。

本發(fā)明所述的aie型硝基還原酶熒光探針，命名為[2-(4-硝基苯基)-1,1,2-三苯基]乙烯，簡稱tpe-no2，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（i）所示：

tpe-no2的制備反應(yīng)式如下：

上述檢測缺氧區(qū)硝基還原酶的aie型熒光探針(tpe-no2)制備方法如下：將0.01mmol鋅粉加入到80ml重蒸的四氫呋喃溶液中，0℃，氮氣保護下攪拌10分鐘，緩慢滴加0.055mmol四氯化鈦到上述溶液中，加熱回流2小時后，再向其中緩慢滴加0.03mmol二苯甲酮(a)的四氫呋喃(20ml)溶液，繼續(xù)加熱回流12小時。反應(yīng)結(jié)束后加入100ml5%氯化銨水溶液淬滅反應(yīng)，使用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸除溶劑，經(jīng)過乙醇重結(jié)晶后得到灰白色固體粉末1,1,2,2-四苯乙烯b；將1,1,2,2-四苯乙烯(b)10mmol溶于25ml二氯甲烷中，0℃下，緩慢加入0.72ml濃硝酸和1ml冰乙酸，0℃下攪拌30分鐘后置于室溫攪拌6小時，反應(yīng)結(jié)束后加入水，抽濾，水洗至中性，粗產(chǎn)物經(jīng)過柱層析提純(淋洗劑為石油醚：乙酸乙酯=50:1)，得到產(chǎn)物[2-(4-硝基苯基)-1,1,2-三苯基]乙烯c。

識別機理如下：

實驗證實，本發(fā)明提供的aie型硝基還原酶熒光探針，在硝基還原酶作用下，其熒光逐漸消失，該結(jié)果說明了本發(fā)明所述aie型熒光探針針對硝基還原酶有響應(yīng)，為生物學(xué)成像應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，預(yù)示著在熒光生物標記領(lǐng)域內(nèi)具有潛在的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1：探針tpe-no2的核磁表征：¹hnmr譜和¹³cnmr譜；

圖2：探針在不同水含量中的熒光光譜圖。其中激發(fā)波長為405nm，發(fā)射波長為500-550nm，探針的濃度：10μm；

圖3：探針檢測硝基還原酶的動力學(xué)實驗：激發(fā)波長為405nm，發(fā)射波長為500-550nm，探針濃度為10μm，硝基還原酶濃度分別為0、1、10μg/ml，測試時間：60min；

圖4：探針檢測硝基還原酶濃度的滴定實驗。激發(fā)波長為405nm，發(fā)射波長為500-550nm，探針濃度為10μm，硝基還原酶濃度分別為0、0.25、1、5、10μg/ml；

圖5：探針在水相中的選擇性。激發(fā)波長為405nm，發(fā)射波長為500-550nm，探針濃度為10μm；

圖6：探針的生物活性檢測；

圖7：探針的細胞成像應(yīng)用。激發(fā)波長：405nm，發(fā)射波長：500-550nm。

具體實施方式

下面通過實例和附圖對本發(fā)明進行說明，但本發(fā)明不受實例的限制，實例中的化合物號碼對應(yīng)上述化合物中的號碼。

實施例1

化合物四苯乙烯(b)的合成：

將0.01mmol鋅粉加入到80ml重蒸的四氫呋喃溶液中，0℃下，氮氣保護下攪拌10分鐘后，緩慢滴加0.055mmol四氯化鈦到上述溶液中，加熱回流2小時后，再向其中緩慢滴加0.03mmol二苯甲酮(a)的四氫呋喃(20ml)溶液，繼續(xù)加熱回流12小時。反應(yīng)結(jié)束后加入100ml5%氯化銨水溶液淬滅反應(yīng)，使用乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸除溶劑，經(jīng)過乙醇重結(jié)晶后得到灰白色固體粉末1,1,2,2-四苯乙烯b，簡稱tpe。產(chǎn)率：90%。

¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.02-7.04(m,8h),7.09-7.11(m,12h)；¹³cnmr(400mhz，cdcl3)δ143.75,140.99,131.35,127.67,126.43.

化合物[2-(4-硝基苯基)-1,1,2-三苯基]乙烯（tpe-no2）的合成：

將1,1,2,2-四苯乙烯(b)10mmol溶于25ml二氯甲烷中，0℃下，緩慢加入0.72ml濃硝酸和1ml冰乙酸，0℃下攪拌30分鐘后置于室溫攪拌6小時，反應(yīng)結(jié)束后加入水，抽濾，水洗至中性，粗產(chǎn)物經(jīng)過柱層析提純(淋洗劑為石油醚：乙酸乙酯=50:1)，得到產(chǎn)物[2-(4-硝基苯基)-1,1,2-三苯基]乙烯c，簡稱tpe-no2。產(chǎn)率：80%。核磁共振圖如圖1所示。

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.00-7.96(m,2h)，7.22-7.21(m,1h)，7.19-7.12(m,10h)，7.07-7.00(m,6h)；¹³cnmr(400mhz,cdcl3)δ151.05,145.98,143.89,142.74,142.68,142.54,138.83,132.10,131.27,131.20,128.24,128.12,127.8,127.57,127.37,127.13,123.05。

實施例2

探針在不同水含量中的熒光光譜圖

預(yù)先準備1份濃度為1mm本發(fā)明所述的aie型熒光探針，分別取20μl于2ml離心管中，磷酸緩沖液(pbs，ph=7.4)體積分數(shù)分別為：1%、80%、90%、99%用乙腈將體系定容至2ml，進行熒光檢測，建立熒光強度隨水含量變化的熒光光譜圖，如圖2所示，pbs為99%時，熒光強度明顯增加，說明本發(fā)明所述的aie型熒光探針在水相中聚集發(fā)光。

實施例3

探針tpe-no2與硝基還原酶作用的動力學(xué)實驗

配制濃度為1mm本發(fā)明所述的aie型熒光探針、100μg/ml硝基還原酶水溶液及濃度為1mm的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)水溶液作為母液。探針濃度為10μm，nadh濃度為300μm，硝基還原酶濃度分別為0、1、10μg/ml。記錄各體系中隨時間變化的熒光強度，建立熒光強度隨時間變化的標準曲線。如圖3所示，反應(yīng)20min，反應(yīng)體系熒光強度達到飽和狀態(tài)。

實施例4

探針與不同濃度硝基還原酶濃度的滴定實驗

配制探針終濃度為10μm，nadh終濃度為300μm，分別與不同濃度的硝基還原酶(0-10μg/ml)在37℃下充分作用30min后，進行熒光檢測(λex=405nm，λem=500-550nm)，記錄各體系中熒光強度，建立不同硝基還原酶濃度與熒光強度的標準曲線。如圖4所示。

實施例5

探針對不同離子、活性小分子及氨基酸的選擇性

配制4ml濃度為1mm本發(fā)明所述的aie型熒光探針，濃度為100mm的各種常規(guī)的離子以及氨基酸的pbs水溶液母液作為備用。

加入20μl探針母液及500當量的各離子、氨基酸于2ml磷酸緩沖液中，作用30min后進行熒光檢測(λex=405nm，λem=500-550nm)，記錄各體系熒光強度。如圖5所示，本發(fā)明所述aie型探針對其他離子及氨基酸均沒有響應(yīng)，1-15號加入的離子分別是：探針tpe-no2，h2o2，nano2，cacl2，cys，feso4，gsh，ki，kno3，mgcl2，na2s，naclo，nahso3，過氧化叔丁基，ntr(含nadh)。其中激發(fā)波長為405nm，發(fā)射波長為500-550nm。

實施例6

探針的生物活性檢測

將密度為5×10⁴個/ml的hela細胞接種到96孔板中，置于培養(yǎng)箱(溫度為37℃，5%co2)中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，棄掉上清液，分別加入本發(fā)明所述aie型熒光探針，是其終濃度分別為0μm，1μm，2μm，5μm，10μm，20μm，孵育24小時后，每孔加入10μl濃度為10mg/ml的mtt，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，棄掉上清液，加入100μl二甲基亞砜，酶標儀檢測吸光度值。由圖6可知，本發(fā)明所述的aie型熒光探針生物相容性良好。

實施例7

探針的細胞成像應(yīng)用

將密度為2×10⁴個/ml的hela細胞接種到35mm培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱(溫度為37℃，5%co2)中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，分成兩組培養(yǎng)：一組氧氣含量20%，另一組氧氣含量1%。培養(yǎng)12小時后，分別向兩種培養(yǎng)條件下的細胞加入本發(fā)明所述aie型熒光探針，使其終濃度分別為10μm，繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘，將細胞培養(yǎng)液棄掉，pbs洗3次，用共聚焦顯微鏡分別拍攝兩種培養(yǎng)條件下的細胞如圖7所示，其中，(a)hela細胞在常氧條件下(20%o2)培養(yǎng)的熒光成像；(b)hela細胞加入10μm本發(fā)明所述的aie型熒光探針在常氧條件下(20%o2)培養(yǎng)的熒光成像；(c)hela細胞加入探針(10μm)在乏氧狀態(tài)(1%o2)培養(yǎng)的熒光成像；(d)hela細胞加入200μm雙香豆素作用30min后，再加入10μm探針在乏氧狀態(tài)(1%o2)培養(yǎng)的熒光成像；(e-h)分別為(a-d)的明場成像；(i-l)分別為(a-d)與(e-h)的組合圖。標尺：20μm。在含氧量為1%條件下的細胞與探針作用后熒光強度明顯降低。而加入硝基還原酶抑制劑——雙香豆素后，發(fā)現(xiàn)熒光并沒有降低，因此證實該探針能夠識別細胞內(nèi)的硝基還原酶。