專利名稱:用于測量硝基還原酶酶活性的方法和試劑的制作方法
本發(fā)明涉及酶試驗領(lǐng)域。本發(fā)明特別是涉及硝基還原酶酶試驗和用于測量以細(xì)胞為基礎(chǔ)的系統(tǒng)中的硝基還原酶酶活性和硝基還原酶基因表達(dá)的新報告染料(reporter dye)。
報告基因技術(shù)被廣泛用于監(jiān)測與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)有關(guān)的細(xì)胞事件。常用與報告基因的表達(dá)偶合的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)來監(jiān)測許多細(xì)胞事件。為了確立報告基因試驗，將報告基因放置在具有最小啟動子的啟動子或增強子轉(zhuǎn)錄控制下。該報告基因被插入到通常包含可選擇的標(biāo)記物(其可賦予對生長抑制化合物，如抗生素，的耐受性)的適宜的質(zhì)粒載體中。用標(biāo)準(zhǔn)試驗操作將該載體DNA引入到細(xì)胞中。加入適宜的激動劑將接通細(xì)胞信號途徑，從而激活了轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)。Naylor等人在Biochem.Pharmacol.，(1999)，58，749-757中對報告基因技術(shù)進行了綜述。
已經(jīng)對以細(xì)胞為基礎(chǔ)的熒光基因報告系統(tǒng)進行了描述，該試驗使用細(xì)菌硝基還原酶(NTR)和可透過細(xì)胞的硝基-取代的淬滅的(或無熒光的)花青染料(被表示為化合物(i))，其發(fā)揮著作為酶底物的功能(US2003/0186348，Thomas，N.等人)。
化合物(i)通過用乙酯基掩蓋潛伏的極性官能團而促進了通過被動擴散通過漿膜進行的底物的細(xì)胞吸收。細(xì)胞水解酶對該酯基進行的細(xì)胞內(nèi)裂解使得底物被保留在活細(xì)胞內(nèi)。向表達(dá)硝基還原酶的細(xì)胞加入所說的底物使得硝基被還原為羥胺，同時伴有熒光發(fā)射增加。根據(jù)淬滅的花青染料的結(jié)構(gòu)，來自該NTR反應(yīng)產(chǎn)物的熒光發(fā)射可以在很寬的波長范圍內(nèi)被產(chǎn)生，所說的波長范圍通常為500-900nm。更長波長下的發(fā)射可有利避免背景熒光和增加生物學(xué)系統(tǒng)的敏感性。
由報告基因構(gòu)建體表達(dá)的野生型硝基還原酶被定位在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中(Spooner等人，Int.J.Cancer，(2001)，93，123-30)。為了從該試驗中獲得最大的信號輸出，希望將所說的底物定位于相同的細(xì)胞隔室中作為報告酶，即，位于宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中從而使得所說的底物可被硝基還原酶激活。掩蓋所說底物分子上的親水性基團或者連接到所說底物上的親水性基團可以產(chǎn)生一些膜可滲透性化合物。此外，所說的掩蓋基團可以被設(shè)計為可以在細(xì)胞內(nèi)從所說的底物上裂解下來從而在細(xì)胞內(nèi)，優(yōu)選在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生所說的底物。并未表明用于使硝基取代的花青染料相對均勻地傳遞到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的掩蓋策略是完全成功的。用熒光顯微鏡進行的細(xì)胞滲透性淬滅的花青染料(Cy-Q)衍生物在細(xì)胞內(nèi)的定位研究已經(jīng)表明一些底物定位于內(nèi)部細(xì)胞膜和細(xì)胞器中，主要位于細(xì)胞的線粒體中。親脂性陽離子性硝基-取代的花青染料底物在線粒體中的積聚伴有探針的熒光增加，同時，這種積聚導(dǎo)致了NRT試驗中的背景熒光增加。因此，需要可用作NTR底物的表現(xiàn)出更低的背景熒光、改善的熒光信號和細(xì)胞內(nèi)分布的新的改良了的試劑。
Squarylium(squaraine)染料是一類總得來說為電中性的染料；其一個實例顯示為化合物(ii)。
化合物(ii)硝基-取代的squaraine染料可以由EP 645680(Bugner D.，等人)獲知，其可作為近紅外吸收添加劑用于電子照相成像過程。PCT申請WO97/40104(Hamilton，A.L.等人)公開了squaraine染料以及squaraine染料與生物學(xué)分子如肽、蛋白和核苷酸的加合物。該染料可以被供電子和吸電子取代基，例如硝基取代；但是，其并沒有公開該硝基取代的染料的熒光性質(zhì)。本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，通過將硝基還原，使得該squaraine染料的光學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，優(yōu)選是熒光發(fā)射發(fā)生改變，包含硝基的淬滅的(quenched)squaraine染料可有效作為硝基還原酶的底物。與使用常規(guī)NTR底物的試驗相比，在測定硝基還原酶活性的試驗中使用硝基-取代的squaraine染料大大增加了該試驗的敏感性并降低了其背景熒光。
本發(fā)明第一方面提供了一種探測組合物中的硝基還原酶酶活性的方法，其包括i)將所說的組合物在可以促進硝基還原酶活性的條件下與染料分子進行混合；和ii)測量所說染料分子光學(xué)性質(zhì)的變化，其中所說的變化是硝基還原酶活性數(shù)量的度量；其特征在于所說的染料分子是包含至少一個NO2基團的squaraine染料。
在一個實施方案中，要探測其中硝基還原酶活性的組合物包含至少一種細(xì)胞或細(xì)胞提取物。所說的細(xì)胞可以是離體或在體的。例如，可以將所說的細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件下進行培養(yǎng)，或者所說的組合物可以是活體動物細(xì)胞。
在另一個實施方案中，所說的方法是在存在要測定其對硝基還原酶酶活性的作用的試驗物質(zhì)的情況下進行的。
本發(fā)明第二方面提供了一種方法，其包括i)將宿主細(xì)胞與染料分子進行接觸，其中所說的宿主細(xì)胞已經(jīng)用包含表達(dá)控制序列(其與編碼硝基還原酶的序列可操作地相連)的核酸進行了轉(zhuǎn)染；ii)測量所說染料分子光學(xué)性質(zhì)的變化，其中所說的變化是硝基還原酶活性數(shù)量的度量；其特征在于所說的染料分子是包含至少一個NO2基團的squaraine染料。
在染料分子中測量的光學(xué)性質(zhì)適宜地是熒光發(fā)射強度，從而，熒光發(fā)射的增加是所說酶對所說染料作用的結(jié)果。例如，可以在第一波長(適宜地為該染料的最大激發(fā))下對所說的組合物進行激發(fā)，在相當(dāng)于該酶反應(yīng)產(chǎn)物的最大發(fā)射的第二波長下測量其熒光發(fā)射強度。也可以在一個波長范圍內(nèi)進行染料分子的激發(fā)和熒光發(fā)射的測量以將發(fā)射信號最大化和區(qū)別激發(fā)和發(fā)射信號?；蛘撸鶞y量的光學(xué)性質(zhì)的變化可以是該硝基還原酶作用前后該染料熒光壽命的變化。還可以用熒光壽命的變化來區(qū)別酶反應(yīng)的產(chǎn)物和被用作底物的染料分子。作為另一種供替代的選擇，所說的光學(xué)性質(zhì)的變化可以是相對于產(chǎn)物的最大吸收而言，該染料分子最大吸收的變化。在優(yōu)選的實施方案中，所說的光學(xué)性質(zhì)的變化是所說染料分子熒光強度的增加，其增加是硝基還原酶活性數(shù)量的度量。
根據(jù)本發(fā)明的第一和第二方面，所說的squaraine染料適宜地是式(I)的化合物 其中R3被連接到Z1環(huán)結(jié)構(gòu)上和R4被連接到Z2環(huán)結(jié)構(gòu)上；Z1和Z2獨立地表示苯基或萘基環(huán)系；X和Y相同或不同并選自氧、硫、-CH＝CH-和基團 基團R1和R2獨立地選自C1-C4烷基、-(CH2)n-P、-{(CH2)2-O}p-R6和基團W；其中P選自COOR7、SO3-和OH，W是單-或二-取代的硝基芐基，R6是甲基或乙基，R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，n是從1至10的整數(shù)，和p是從1至3的整數(shù)；
基團R3和R4獨立地選自氫、NO2、鹵素、SO3-、C1-C4烷氧基和-(CH2)m-COOR7；其中R7的定義如上文所述并且m是0或1至5的整數(shù)；R5是任選地被COOR7、SO3-或OH取代的C1-C6烷基；其中R7的定義如上文所述；和基團R1、R2、R3和R4中至少一個包含至少一個NO2基。
式(I)的squaraine染料可適宜地包含一種反荷離子(counter-ion)，所說的反荷離子可以是正電或負(fù)電以平衡該染料發(fā)色團或取代基上的形式電荷(formal charge)(或多個形式電荷)。該反荷離子的性質(zhì)對本發(fā)明而言并不重要，并且可以是許多已知離子如H+、NH4+、K+、Na+、三氟乙酸鹽(F3C-CO2-)、高氯酸鹽(ClO4-)、Br-、或I-中的任何一種。
所說的式(I)的染料中所包含的至少一個硝基可以適宜地被直接連接到Z1和Z2環(huán)結(jié)構(gòu)上。在這種實施方案中，該squaraine染料的基團R3和R4中的一種是或者二者都是NO2。在另一個實施方案中，所說squaraine染料的基團R3和R4中的一種是或者二者都是基團W，其中W的定義如上文所述。所說的squaraine染料可以任選地被一個或兩個連接到其芳環(huán)結(jié)構(gòu)上的硝基進一步取代。
在優(yōu)選的實施方案中，在本發(fā)明方法中所用的squaraine染料對于細(xì)胞而言是可滲透的。在這些實施方案中，基團R1、R2、R3和R4中至少一個包含細(xì)胞膜透化基團?？梢酝ㄟ^掩蓋親水性基團從而提供更疏水的化合物來產(chǎn)生膜滲透化合物。所說的掩蓋基團可以被設(shè)計為可以在細(xì)胞內(nèi)從所說底物上裂解下來從而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生被衍生的底物。因為所說的底物比所說的膜滲透衍生物更親水，所以其被截留在細(xì)胞內(nèi)。適宜的細(xì)胞膜透化基團可以選自可以容易地被哺乳動物內(nèi)源性細(xì)胞內(nèi)的酯酶裂解的乙酰氧基甲基酯(Jansen，A.B.A.和Russell，T.J.，J.Chem.Soc.，2127-2132(1965)和Daehne，W.等人.J.Med-.Chem.13，697-612(1970))以及新戊酰酯(Madhu等人J.Ocul.Pharmacol.Ther.，(1998)，14，5，第389-399頁)，但是也可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員公認(rèn)的其它適宜基團。
在一個實施方案中，所說squaraine染料的基團R1和R2中的一種是或者二者都是基團W，其中W的定義如上文所述。在本發(fā)明這一實施方案中所用染料的特定實例是這些選自式(II)、(III)和(IV)染料的染料 其中X和Y相同或不同并選自氧、硫、-CH＝CH-和基團 其中R5的定義如上文所述；R1和R2中至少一個是基團W；其中W的定義如上文所述；任何其余的R1或R2選自C1-C4烷基、-(CH2)n-P和-{(CH2)2-O}p-R6；其中P選自COOR7、SO3-和OH，R6是甲基或乙基，R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，n是從1至10的整數(shù)和p是從1至3的整數(shù)；和基團R3和R4獨立地選自氫、鹵素、SO3-、C1-C4烷氧基和-(CH2)m-COOR7；其中R7的定義如上文所述和m是0或1至5的整數(shù)。
在這種實施方案中，優(yōu)選地基團R1和R2中的一個選自基團W，其中W選自 其余的R1或R2選自甲基或乙基、或基團-(CH2)n-COOR7，其中R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，n是從1至10的整數(shù)，優(yōu)選地是5或6。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，W是基團 和其余R1或R2的定義如上文所述。
在另一個實施方案中，式(II)、(III)和(IV)的squaraine染料的基團R3和R4中的一種是或者二者都是NO2。在這種實施方案中，X和Y相同或不同并選自氧、硫、-CH＝CH-和基團 其中R5的定義如上文所述；基團R1或R2獨立地選自C1-C4烷基、-(CH2)n-P和-{(CH2)2-O}p-R6；其中P選自COOR7、SO3-和OH，R6是甲基或乙基，R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，n是從1至10的整數(shù)和p是從1至3的整數(shù)；R3和R4中的至少一個是NO2；和任何其余的R3或R4選自氫、SO3-、C1-C4烷氧基和-(CH2)m-COOR7；其中R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，和m是0或1至5的整數(shù)。
在優(yōu)選的實施方案中，X和Y選自氧、硫和 其中R5是甲基。
優(yōu)選的C1-C4烷基選自甲基和乙基。特別優(yōu)選的-(CH2)n-COOR7基選自-(CH2)5-COOR7、和-(CH2)6-COOR7；其中R7的定義如上文所述。
鹵素原子選自氟、氯、溴和碘。
本發(fā)明第三方面提供了一種對試驗物質(zhì)進行篩選的方法，對該試驗物質(zhì)對硝基還原酶基因表達(dá)的作用進行了測試。所說的方法包括的步驟有a)在不存在和存在所說試驗物質(zhì)的情況下進行本發(fā)明第二方面所說的方法；和b)在不存在和存在所說物質(zhì)的情況下測定硝基還原酶基因表達(dá)的數(shù)量；其中在不存在和存在所說物質(zhì)情況下硝基還原酶基因表達(dá)之間的差異是所說物質(zhì)對硝基還原酶基因表達(dá)作用的指示。
在另一方面，所說的用于對試驗物質(zhì)進行篩選的方法可以通過a)在存在所說物質(zhì)的情況下進行本發(fā)明第二方面的方法；和b)將硝基還原酶基因表達(dá)的數(shù)量與不存在所說試驗物質(zhì)情況下硝基還原酶基因表達(dá)數(shù)量的對照值進行比較來進行?？梢詫⒃搶φ罩狄噪娮痈袷酱鎯υ跀?shù)據(jù)庫中或者以其它電子格式進行存儲。
用許多酶基因作為哺乳動物細(xì)胞中的報告基因的方法是眾所周知的(其綜述可參見Naylor L.H.(1999)Biochemical Pharmacology58，749-757)。對所說的報告基因進行選擇以使得可以在存在其它細(xì)胞蛋白的情況下測量所說基因的產(chǎn)物并在所選擇的對宿主細(xì)胞中基因表達(dá)改變有響應(yīng)的調(diào)節(jié)序列的控制下將其引入到細(xì)胞內(nèi)。典型的調(diào)節(jié)序列包括那些對激素、第二信使和其它細(xì)胞控制和信號因子有響應(yīng)的序列。例如，已知與七種膜受體結(jié)合的激動劑可以調(diào)節(jié)一些啟動子原件，包括cAMP響應(yīng)原件、NFAT、SRE和AP1；MAP激酶的活化產(chǎn)生了導(dǎo)致Fos和Jun轉(zhuǎn)錄的SRE調(diào)節(jié)；DNA損害激活了DNA修復(fù)酶和腫瘤抑制基因p53的轉(zhuǎn)錄。通過選擇適宜的調(diào)節(jié)序列，可以用所說的報告基因來對所加入的物質(zhì)對涉及所選擇的正在進行研究的調(diào)節(jié)序列的細(xì)胞過程的影響進行分析。
對于作為報告基因的應(yīng)用而言，所說的硝基還原酶基因可以用眾所周知的方法進行分離，例如可以通過用聚合酶鏈反應(yīng)由cDNA庫進行擴增(分子克隆，實驗室手冊(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，第2版，Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989，第14.5-14.20頁)。在分離出來之后，可以與進行研究的基因調(diào)節(jié)序列一起并在其控制下將該硝基還原酶基因插入到適用于與哺乳動物啟動子一起使用的載體中(分子克隆，實驗室手冊，第2版，Cold Spring HarbourLaboratory Press 1989，第16.56-16.57頁)。然后，可以通過用眾所周知的技術(shù)進行轉(zhuǎn)染而將該包含硝基還原酶報告基因和相關(guān)聯(lián)的調(diào)節(jié)序列的載體引入到宿主細(xì)胞中，例如可以用DEAE-葡聚糖或磷酸鈣來進行轉(zhuǎn)染(分子克隆，實驗室手冊，第2版，Cold Spring HarbourLaboratory Press 1989，第16.30-16.46頁)。其它適宜的技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是眾所周知的。已經(jīng)表明，當(dāng)以這種方式進行表達(dá)時，硝基還原酶可以被保留在細(xì)胞中(見Bridgewater等人Eur.J.Cancer，(1995)，31A，2362-70)。
本發(fā)明的方法可以與可在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)塑料器皿中進行培養(yǎng)的任何粘附細(xì)胞類型一起使用，所說的細(xì)胞類型包括就種屬(例如人、嚙齒類動物、猿)、組織來源(例如腦、肝、肺、心、腎、皮膚、肌肉)和細(xì)胞類型(例如上皮、內(nèi)皮)而言衍生自任何公認(rèn)來源的細(xì)胞類型。已經(jīng)確定了一些可用于對不同細(xì)胞類型進行培養(yǎng)的方案。(見例如，F(xiàn)reshney，R.I.，動物細(xì)胞的培養(yǎng)基礎(chǔ)技術(shù)手冊(Culture of Animal CellsAManual of Basic Technique)，第2版，Alan R.Liss Inc.1987)。將所選擇的宿主細(xì)胞系接種到無菌的組織培養(yǎng)物處理的培養(yǎng)皿中并將其在37℃下，在5％CO2的潮濕氣氛中在適宜的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所說的適宜培養(yǎng)基通常為包含10％胎牛血清+2mM L-谷酰胺的Dulbecco′sModified Eagles培養(yǎng)基?？梢杂帽娝苤姆椒▽⒃撡|(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞中，例如可以用陽離子脂質(zhì)、磷酸鈣、和電穿孔來進行轉(zhuǎn)染。推薦在試驗前將各細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率進行優(yōu)化以確?？梢垣@得可再現(xiàn)的數(shù)據(jù)。通常在轉(zhuǎn)染后24-72小時對硝基還原酶的短暫表達(dá)進行分析。將所制備的硝基還原酶基因報告DNA/轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合體滴加到各皿中。將所說皿的內(nèi)含物仔細(xì)混合并將其培養(yǎng)最少4小時。將其在37℃下在5％CO2的潮濕氣氛下培養(yǎng)一整夜是適當(dāng)?shù)?。在培養(yǎng)后，取出各皿的培養(yǎng)基并將細(xì)胞單層用無菌的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進行洗滌?？梢灾苯釉谠撧D(zhuǎn)染皿中對被轉(zhuǎn)染了的細(xì)胞進行分析，或者可以將細(xì)胞從各皿中分離出來，匯集，將其制成轉(zhuǎn)染細(xì)胞的混懸液。通常在轉(zhuǎn)染后24-72小時對硝基還原酶的短暫表達(dá)進行分析。
在本發(fā)明典型的以腺病毒為基礎(chǔ)的NTR基因報告試驗中，在病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)前24小時，將所選擇的宿主細(xì)胞繼代培養(yǎng)并將其在37℃下在5％CO2的潮濕氣氛下培養(yǎng)一整夜。用胰蛋白酶對這些細(xì)胞進行分離并將得自各燒瓶的細(xì)胞匯集，將其制成細(xì)胞的混懸液。將位于混懸液中的細(xì)胞與病毒在預(yù)定的感染復(fù)數(shù)(MOI)下合并于體積足以覆蓋適宜的組織培養(yǎng)物處理的燒瓶底部的完全培養(yǎng)基中并將其在37℃下在5％CO2的潮濕氣氛中培養(yǎng)一整夜。將細(xì)胞分離(胰蛋白酶)，制備轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的混懸液。
可以適宜地用所說的包含硝基還原酶的載體來制備用于基因報告試驗的瞬時細(xì)胞和穩(wěn)定細(xì)胞。對于穩(wěn)定細(xì)胞系的制備而言，必需選擇適宜的試劑如抗生素G418。根據(jù)這種方法，應(yīng)當(dāng)以低密度(適宜地為100-500)將這些細(xì)胞接種到適宜的皿中，并向培養(yǎng)基中加入所選擇的試劑。所選擇試劑的最佳濃度將根據(jù)細(xì)胞類型和所需的生長速率來進行變化，并且0.1mg/ml至1mg/ml的加入濃度是適宜的。
為了對試驗物質(zhì)對硝基還原酶活性的作用進行分析，將細(xì)胞分配到微孔板的孔中，所說的微孔板適宜地為具有24、96、384或更高的孔密度，例如1536個孔的微量滴定板。在將其在37℃下培養(yǎng)一整夜后，除去培養(yǎng)基并將試驗物質(zhì)加入到不含血清的培養(yǎng)基中。用僅包含不含血清的培養(yǎng)基的孔作為對照。在培養(yǎng)后，向其中加入硝基還原酶底物并用適宜的熒光計或成像系統(tǒng)來測量隨著時間的流逝熒光信號的增加。
為了對試驗物質(zhì)通過進行研究的調(diào)節(jié)序列激活細(xì)胞響應(yīng)的能力進行分析，將已經(jīng)用所說的硝基還原酶報告基因進行了轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與試驗物質(zhì)一起進行培養(yǎng)，然后向其中加入細(xì)胞滲透性squaraine染料底物，如包含至少一個NO2基團的squaraine染料。在經(jīng)過將所說的染料底物轉(zhuǎn)化為熒光發(fā)射增加的形式所需的適宜時間后，用適宜的熒光計或成像系統(tǒng)在對于所選擇的squaraine染料而言適宜的波長下測量隨著時間的流逝得自所說細(xì)胞的熒光發(fā)射。
這些基因報告試驗通常是在“終止”條件下進行的，例如將細(xì)胞溶解以探測報告基因。因此，使所說的反應(yīng)進行預(yù)定的時間，然后用終止試劑結(jié)束該反應(yīng)，所說的終止試劑通常為表面活性劑。終止試劑的一個實例是Triton X-100，可以用其來破壞細(xì)胞膜和釋放酶活性。此外，可以用標(biāo)準(zhǔn)試劑如甲醛將細(xì)胞“固定”，并且將該硝基還原酶反應(yīng)的產(chǎn)物截留在細(xì)胞內(nèi)。其使得可以將試驗板儲存適宜的時間直至進行讀數(shù)。
在要對試驗進行格式化以對試驗物質(zhì)對硝基還原酶活性的活性進行測定時，該試驗可以在連續(xù)測量底物熒光的情況下來進行。在這種形式中，所說底物的熒光發(fā)射強度不斷發(fā)生變化?？梢垣@得該反應(yīng)的時間-過程，從而使得可以進行實時動力學(xué)研究。可以將所發(fā)射熒光的測量結(jié)果與得自未與試驗物質(zhì)進行接觸的對照細(xì)胞的熒光測量結(jié)果進行比較，并且如果有的話，由試驗細(xì)胞熒光與對照細(xì)胞熒光的比例來測定試驗物質(zhì)對由所說調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)的基因表達(dá)的作用。
可以用裝有光電倍增管作為檢測器的儀器，例如“Ultra”熒光計(Tecan)或電荷耦合器件(CCD)圖像儀(如掃描圖像儀或面積圖像儀)對微量滴定板的所有孔成像來測量熒光強度的變化。LEADseekerTM系統(tǒng)的特色在于CCD照相機使得可以在單次經(jīng)過時對高密度微量滴定板進行熒光成像。其成像是定量的并且很快，并且適用于成像應(yīng)用的儀器現(xiàn)在同時可以對整個多孔板進行成像?；蛘?，可以在“活細(xì)胞”格式下用INCellTM1000分析器或INCellTM3000分析器來對細(xì)胞進行成像。在這種形式中，應(yīng)當(dāng)向所說的細(xì)胞中加入適宜的細(xì)胞標(biāo)記物，如具有與被還原底物的熒光發(fā)射不同并且可以與之區(qū)分開的熒光發(fā)射波長的細(xì)胞質(zhì)、核或膜熒光標(biāo)記。適宜地在500nm至900nm，優(yōu)選550-780nm，最優(yōu)選630-700nm的波長下來探測底物所發(fā)射的熒光。例如，對于化合物(1)(實施例1)而言，可以在630nm下激發(fā)，在645nm下對熒光發(fā)射進行監(jiān)測。或者，可以將所說的染料體內(nèi)給藥于適當(dāng)?shù)毓こ袒霓D(zhuǎn)基因動物模型。然后，可以用適宜的光學(xué)系統(tǒng)，例如eXploreOptixTM成像來測定硝基還原酶的活性和定位。
另一方面，本發(fā)明提供了選自下式染料的硝基-取代的squaraine染料 其中X和Y相同或不同并選自氧、硫、-CH＝CH-和基團 基團R1和R2獨立地選自C1-C4烷基、-(CH2)n-P、-{(CH2)2-O}p-R6和基團W；其中P選自COOR7、SO3-和OH，W是單-或二-取代的硝基芐基，R6是甲基或乙基，R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，n是從1至10的整數(shù)，和p是從1至3的整數(shù)；基團R3和R4獨立地選自氫、NO2、鹵素、SO3-、C1-C4烷氧基和-(CH2)m-COOR7；其中R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，和m是0或1至5的整數(shù)；R5是任選地被COOR7、SO3-或OH取代的C1-C6烷基；其中R7的定義如上文所述；和基團R1、R2、R3和R4中至少一個包含至少一個NO2基。
X和Y優(yōu)選地選自氧、硫和 其中R5是甲基。
在一個實施方案中，基團R1和R2中的一個是 其余的R1或R2選自甲基、乙基和基團-(CH2)n-COOR7；其中R7的定義如上文所述和n是從1至10的整數(shù)，優(yōu)選地是5或6。
在另一個實施方案中，基團R1和R2獨立地選自C1-C4烷基、-(CH2)n-COOR7和-{(CH2)2-O}p-R6；其中R6是甲基或乙基，R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，和n和p的定義如上文所述；基團R3和R4中至少一個是NO2；和其余的基團R3或R4選自氫、SO3-、C1-C4烷氧基和-(CH2)m-COOR7；其中R7的定義如上文所述和m是0或1至5的整數(shù)。
所說的squaraine染料可用作探測和/或測量硝基還原酶酶活性并且特別是用于測量細(xì)胞試驗中硝基還原酶基因表達(dá)數(shù)量的底物。
本發(fā)明第一方面染料的實例如下i)2-(1-甲基-3，3-二甲基-2-亞二氫吲哚基甲基)-4-(1-(3，5-二硝基芐基)-3，3-二甲基-2-亞二氫吲哚基甲基)環(huán)丁烯二基(cyclobutenediylium)-1，3-二酸鹽(-diolate)(2-(1-methyl-3，3-dimethyl-2-indolinylidenemethyl)-4-(1-(3，5-dinitrobenzyl)-3，3-dimethyl-2-indolinylidenemethyl)cyclobutenediylium-1，3-diolate)(化合物1)；ii)2-(1-(5-羧基戊基)-3，3-二甲基-2-亞二氫吲哚基甲基)-4-(1-(3，5-二硝基芐基)-3，3-二甲基-2-亞二氫吲哚基甲基)環(huán)丁烯二基-1，3-二酸鹽(化合物2)；iii)2-(1-(5-羧基戊基)-3，3-二甲基-2-亞苯并二氫吲哚基甲基)-4-(1-(3，5-二硝基芐基)-3，3-二甲基-2-亞二氫吲哚基甲基)環(huán)丁烯二基-1，3-二酸鹽(2-(1-(5-carboxypentyl)-3，3-dimethyl-2-benzindolinylidenemethyl)-4-(1-(3，5-dinitrobenzyl)-3，3-dimethyl-2-indolinylidenemethyl)cyclobutenediylium-1，3-diolate)(化合物3)；iv)2-(3-乙基-6-硝基-2-亞苯并噻唑啉基甲基)-4-(1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-3，3-二甲基-2-亞二氫吲哚基甲基)環(huán)丁烯二基-1，3-二酸鹽(2-(3-ethyl-6-nitro-2-benzothiazolinylidenemethyl)-4-(1-(2-(2-methoxyethoxy)ethyl)-3，3-dimethyl-2-indolinylidenemethyl)cyclobutenediylium-1，3-diolate)(化合物4)；v)2-(1-乙基-3，3-二甲基-5-甲氧基-2-亞二氫吲哚基甲基)-4-(1-(3，5-二硝基芐基)-3，3-二甲基-5-甲氧基-2-亞二氫吲哚基甲基)環(huán)丁烯二基-1，3-二酸鹽(化合物5)；vi)2-(1-(5-羧基戊基)-3，3-二甲基-5-甲氧基-2-亞二氫吲哚基甲基)-4-(1-(3，5-二硝基芐基)-3，3-二甲基-5-甲氧基-2-亞二氫吲哚基甲基)環(huán)丁烯二基-1，3-二酸鹽(化合物6)；vii)3-(5-羧基戊基)-1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基-3-甲基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基甲基-4-((1-(3，5-二硝基芐基)-3，3-二甲基-3H-吲哚(indolium)-2-基)亞甲基)-3-氧代環(huán)丁-1-烯-1-酸鹽(化合物7)；和viii)2-((3，3-二甲基-5-磺基-1-(4-磺基丁基)-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)甲基)-4-((1-甲基-6-硝基喹啉-2-基)亞甲基)-3-氧代環(huán)丁-1-烯-1-酸鹽(2-((3，3-dimethyl-5-sulfo-1-(4-sulfobutyl)-1，3-dihydro-2H-indol-2-ylidene)methyl)-4-((1-methyl-6-nitroquinolinium-2-yl)methylene)-3-oxocyclobut-1-en-1-olate)(化合物(8)參考下面的附圖和實施例對本發(fā)明進行進一步說明，其中圖1表示如實施例11中所示的，與在硝基還原酶基因報告試驗中作為底物的本發(fā)明硝基-取代的squaraine染料(化合物(1))相比的兩種硝基-取代的花青型染料——化合物(i)和(iii)的分子結(jié)構(gòu)；圖2說明了兩種硝基-取代的花青染料——化合物(i)和(iii)與NTR基因報告試驗中硝基-取代的squaraine(化合物(1))進行的比較；圖3是在硝基還原酶基因報告試驗中作為底物的硝基-取代的squaraine染料(化合物(1)和2)的比較研究；圖4表示了化合物(2)在HeLa細(xì)胞中的分布；和圖5表示了對在活細(xì)胞NTR試驗中作為硝基還原酶底物的化合物(2)、(3)和(4)進行的評估。
實施例1.2-(1-甲基-3，3-二甲基-2-亞二氫吲哚基甲基)-4-(1-(3，5-二硝基芐基)-3，3-二甲基-2-亞二氫吲哚基甲基)環(huán)丁烯二基-1，3-二酸鹽(化合物(1))的制備 化合物(1)1.1 1-(3，5-二硝基芐基)-2，3，3-三甲基-3H-吲哚碘化物的制備向2，3，3-三甲基假吲哚(1.64g)中加入3，5-二硝基芐基碘化物(3.71g)和二氯苯(15ml)。在將其加熱至90℃加熱6小時后，使該混合物冷卻并通過過濾除去所產(chǎn)生的沉淀。將該固體用二氯苯(2×10ml)和乙醚(2×50ml)進行洗滌。將該物質(zhì)在真空烘箱中進行干燥，得到黃色固體形式的產(chǎn)物(2.69g)。
MALDI-TOF(C18H18N3O4需要M+340)339，340。
1.2化合物(1)的制備向1-(3，5-二硝基芐基)-2，3，3-三甲基-3H-吲哚碘化物(100mg)中加入3-羥基-4-(1，3，3-三甲基-1，3-二氫吲哚-2-亞基甲基)環(huán)丁-3-烯-1，2-二酮(54mg)、吡啶(2.25ml)、醋酸(2.25ml)和醋酸酐(0.5ml)。將該混合物加熱回流6小時，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。將殘余物在水和二氯甲烷之間進行分配，將有機相相繼用稀碳酸氫鈉水溶液和1M HCl進行洗滌。除去溶劑并用二氧化硅閃柱色譜對其進行純化(MeOH/DCM)。將所得的物質(zhì)用反相HPLC進一步進行純化(CH3CN/H2O/TFA)。
MALDI-TOF(C34H30N4O6需要M+590)591。
2.2-(1-(5-羧基戊基)-3，3-二甲基-2-亞二氫吲哚基甲基)-4-(1-(3，5-二硝基芐基)-3，3-二甲基-2-亞二氫吲哚基甲基)環(huán)丁烯二基-1，3-二酸鹽(化合物(2))的制備 化合物(2)向1-(3，5-二硝基芐基)-2，3，3-三甲基-3H-吲哚碘化物(467mg)中加入3，4-二羥基-3-環(huán)丁烯-1，2-二酮(110mg)、1-(5-羧基戊基)-2，3，3-三甲基-3H-吲哚碘化物(354mg)、吡啶(4.5ml)、醋酸(4.5ml)和醋酸酐(1ml)。將該混合物加熱回流3小時，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。將這種粗品用二氧化硅閃柱色譜進行處理(用MeOH/DCM進行洗脫)。將包含產(chǎn)物的級分合并并除去溶劑。將所得的物質(zhì)用反相HPLC進一步進行純化(CH3CN/H2O/TFA)。
3.2-(1-(5-羧基戊基)-3，3-二甲基-2-亞苯并二氫吲哚基甲基)-4-(1-(3，5-二硝基芐基)-3，3-二甲基-2-亞二氫吲哚基甲基)環(huán)丁烯二基-1，3-二酸鹽(化合物(3))的制備 化合物(3)3.1 3-(5-羧基戊基)-1，1，2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚碘化物的制備向1，1，2-三甲基-1H-苯并[e]假吲哚(16.2g)中加入6-溴己酸(31.2g)和二氯苯(50ml)。將該混合物在110℃下加熱136小時，冷卻至環(huán)境溫度，在冰上冷卻，過濾。將濾餅用二氯苯(50ml)、乙醚(50ml)洗滌并將起在40℃下在低真空下進行干燥，得到淡棕色固體形式的化合物(25.38g)。
LCMS(C21H26NO2需要M+324)324。
3.2化合物(3)的制備向1-(3，5-二硝基芐基)-2，3，3-三甲基-3H-吲哚碘化物(132mg)中加入3-(5-羧基戊基)-1，1，2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚碘化物(114mg)、3，4-二羥基-3-環(huán)丁烯-1，2-二酮(32mg)、吡啶(4.5ml)、醋酸(4.5ml)和醋酸酐(1ml)。將該混合物加熱至90℃加熱4小時，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。用二氧化硅閃柱色譜進行純化(EA/MeOH)，合并相關(guān)級分并將其濃縮。將所得的物質(zhì)用反相HPLC進一步進行純化(CH3CN/H2O/TFA)，得到1.7mg。
MALDI-TOF(C43H40N4O8需要M+740)741。
4.2-(3-乙基-6-硝基-2-亞苯并噻唑啉基甲基)-4-(1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-3，3-二甲基-2-亞二氫吲哚基甲基)環(huán)丁烯二基-1，3-二酸鹽(化合物(4))的制備
化合物(4)4.1 1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-2，3，3-三甲基-3H-吲哚溴化物的制備向2，3，3-三甲基假吲哚(1.59g)中加入1-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)乙烷(2.75g)和二氯苯(5ml)。將該混合物加熱至70℃加熱一整夜。除去揮發(fā)性物質(zhì)并用HPLC對該物質(zhì)進行純化。
MALDI-TOF(C16H24NO2需要M+262)263。
4.2 2-甲基-6-硝基苯并噻唑的制備將位于濃硫酸(80ml)中的2-甲基苯并噻唑(22g)冷卻至-5℃。向其中加入位于濃硝酸(20ml)中的濃硫酸(12ml)混合物，將其唯獨維持在低于5℃的溫度上(約1.5小時)。其后，使該混合物加溫至室溫并將該溶液傾倒到冰上，產(chǎn)生一種黃色沉淀。通過過濾除去固體并將其用乙醇重結(jié)晶。在過濾后，將該固體用乙醇洗滌并在真空烘箱中對其進行干燥，得到18g所需的產(chǎn)物。
LCMS(C8H6N2O2S需要M+194)195。
4.3 3-乙基-2-甲基-6-硝基苯并噻唑碘化物的制備向2-甲基-6-硝基苯并噻唑(0.36g)中加入碘乙烷(1.5ml)和二氯苯(20ml)。將該混合物加熱至120℃加熱2天，然后使之冷卻至室溫。向其中加入乙酸乙酯并通過過濾取出所得的沉淀。將其在真空烘箱中干燥，得到所需的物質(zhì)(80mg)。
4.4化合物(4)的制備向3-乙基-2-甲基-6-硝基苯并噻唑碘化物(400mg)中加入3，4-二羥基-3-環(huán)丁烯-1，2-二酮(128mg)、1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-2，3，3-三甲基-3H-吲哚溴化物(420mg)、吡啶(20ml)、醋酸(18ml)和醋酸酐(8ml)。將該混合物加熱至120℃加熱4小時，然后使之冷卻至室溫。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去揮發(fā)性物質(zhì)，將殘余物溶解于DCM中，用二氧化硅閃柱色譜進行純化(DCM/EA/MeOH)。將該物質(zhì)用制備TLC進一步進行純化，得到23mg。
LCMS(C30H31N3O6S需要M+561)560。
5.2-(1-乙基-3，3-二甲基-5-甲氧基-2-亞二氫吲哚基甲基)-4-(1-(3，5-二硝基芐基)-3，3-二甲基-5-甲氧基-2-亞二氫吲哚基甲基)環(huán)丁烯二基-1，3-二酸鹽(化合物(5))的制備 5.1 5-甲氧基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚的制備向鹽酸4-甲氧基苯基肼(4.84g)中加入3-甲基-2-丁酮(6.4ml)和醋酸(45ml)。將該混合物加熱至100℃加熱2.5小時，其后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。用閃柱色譜進行處理，得到所說的產(chǎn)物(4.66g)。
δH(270MHz；CDCl3)1.3(6H，s)，2.2(3H，s)，3.8(3H，s)，6.8(2H，m)，7.4(1H，m)。
5.2 1-乙基-5-甲氧基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚碘化物的制備向5-甲氧基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚(1.9g)中加入碘代乙烷(5ml)和1，2-二氯苯(10ml)。將該混合物加熱至80℃加熱4小時，其后，使該混合物冷卻并通過過濾取出沉淀，將其相繼用二氯苯和乙醚進行洗滌。將其在烘箱中干燥，得到所說的產(chǎn)物(3g)。
δH(270MHz；CDCl3)1.6(3H，t)，1.6(6H，s)，3.1(3H，s)，3.9(3H，s)，4.7(2H，q)，7.1(2H，m)，7.7(1H，m)。
5.3 1-(3，5-二硝基芐基)-5-甲氧基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚碘化物的制備向5-甲氧基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚(1.90g)中加入3，5-二硝基芐基碘化物(4.62g)和1，2-二氯苯(10ml)。將該混合物加熱至75℃加熱3小時，在此期間，分離出一種橙色的固體。然后，將該混合物在冰浴上進行冷卻并通過過濾收集固體級分；將其相繼用二氯苯和乙醚進行洗滌，并將其真空干燥，得到所說的產(chǎn)物(2.62g)。
δH(270MHz；DMSO-d6)1.6(6H，s)，2.9(～3H，s)，3.85(3H，s)，6.1(2H，s)，7.1(1H，dd)，7.55(1H，d)，7.8(1H，d)，8.65(2H，s)and 8.8(1H，s)。
5.4化合物(5)的制備向1-(3，5-二硝基芐基)-5-甲氧基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚碘化物(250mg)中加入3，4-二羥基-3-環(huán)丁烯-1，2-二酮(55mg)、1-乙基-5-甲氧基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚碘化物(175mg)、吡啶(2.25ml)、醋酸(2.25ml)和醋酸酐(0.5ml)。將該混合物加熱回流5小時，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。將該粗品在DCM和1M HCl之間進行分配。將有機層進一步用水進行洗滌。用二氧化硅閃柱色譜進行處理(DCM/MeOH)，將相關(guān)級分合并并對其進行濃縮。將所得的物質(zhì)用反相HPLC進一步進行純化(CH3CN/H2O/TFA)。
MALDI-TOF(C37H36N4O8requires M+664)665。
6.2-(1-(5-羧基戊基)-3，3-二甲基-5-甲氧基-2-亞二氫吲哚基甲基)-4-(1-(3，5-二硝基芐基)-3，3-二甲基-5-甲氧基-2-亞二氫吲哚基甲基)環(huán)丁烯二基-1，3-二酸鹽(化合物(6))的制備
6.1 1-(5-羧基戊基)-5-甲氧基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚溴化物的制備向5-甲氧基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚(1.9g)中加入6-溴己酸(3g)和1，2-二氯苯(10ml)。將該混合物加熱至100℃加熱3小時，然后使之冷卻至室溫。向其中加入乙醚并通過過濾取出沉淀出來的物質(zhì)。將其在真空烘箱中進行干燥，得到所說的產(chǎn)物(3.12g)。
δH(270MHz；CDCl3)1.4(2H.m)，1.5(6H，s)，1.6(2H，m)，1.8(2H，m)，2.2(2H，m)，2.8(3H，s)，3.8(3H，s)，4.4(2H，m)，7.1(1H，m)，7.5(1H，m)，7.9(1H，m)。
6.2化合物(6)的制備向1-(3，5-二硝基芐基)-5-甲氧基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚碘化物(500mg)(見5.3)中加入3，4-二羥基-3-環(huán)丁烯-1，2-二酮(114mg)、1-(5-羧基戊基)-5-甲氧基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚溴化物(385mg)、吡啶(4.5ml)、醋酸(4.5ml)和醋酸酐(1ml)。將該混合物加熱至110℃加熱4.5小時，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。將這種粗品在DCM和1M HCl之間進行分配。將有機層用水進一步進行洗滌。用二氧化硅閃柱色譜進行處理(DCM/MeOH)，將相關(guān)級分合并并對其進行濃縮。將所得的物質(zhì)用反相HPLC進一步進行純化(CH3CN/H2O/TFA)。
MALDI-TOF(C41H42N4O10需要M+750)751。
7.3-(5-羧基戊基)-1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基-3-甲基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基甲基-4-((1-(3，5-二硝基芐基)-3，3-二甲基-3H-吲哚-2-基)亞甲基)-3-氧代環(huán)丁-1-烯-1-酸鹽(化合物(7))的制備 化合物(7)7.1 3-(5-羧基戊基)-1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-2，3-二甲基-3H-吲哚溴化物的制備向6-(2，3-二甲基-3H-吲哚-3-基)己酸(100mg)中加入1-溴-2-(2-甲氧基乙氧基)乙烷(1ml)并將該混合物加熱至90℃加熱一整夜。在冷卻時，向其中加入乙醚(10ml)并通過過濾取出所說的物質(zhì)。
LCMS(C21H32NO4需要M+362)363。
7.2化合物(7)的制備向3-(5-羧基戊基)-1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-2，3-二甲基-3H-吲哚溴化物中加入方形酸(44mg)、1-(3，5-二硝基芐基)-2，3，3-三甲基-3H-吲哚碘化物(177mg)、吡啶(4.5ml)、醋酸(4.5ml)和醋酸酐(1ml)。將該混合物加熱至80℃加熱一整夜。在冷卻后，用制備HPLC進行處理，得到所需的物質(zhì)。
LCMS(C43H46N4O10需要M+778)779。
8.化合物(7)的乙酰氧基甲酯衍生物向3-(5-羧基戊基)-1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基-3-甲基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基甲基-4-((1-(3，5-二硝基芐基)-3，3-二甲基-3H-吲哚-2-基)亞甲基)-3-氧代環(huán)丁-1-烯-1-酸鹽(14mg)中加入乙腈(3ml)、Hunigs堿(32μl)和溴乙酸甲酯(9ul)。在將其在室溫下攪拌2小時后，用HPLC進行處理，得到所需的物質(zhì)(8mg)。
LCMS(C46H50N4O12需要M+850)851。
9.化合物(7)的乙酯衍生物的制備向乙醇(10ml)中加入乙酰氯(1ml)，然后向其中加入3-(5-羧基戊基)-1-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基-3-甲基-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基甲基-4-((1-(3，5-二硝基芐基)-3，3-二甲基-3H-吲哚-2-基)亞甲基)-3-氧代環(huán)丁-1-烯-1-酸鹽(2mg)。將該混合物在室溫下攪拌5小時，其后在真空下除去揮發(fā)性物質(zhì)。
LCMS(C45H50N4O10需要M+806)807。
10.-2-((3，3-二甲基-5-磺基-1-(4-磺基丁基)-1，3-二氫-2H-吲哚-2-亞基)甲基)-4-((1-甲基-6-硝基喹啉-2-基)亞甲基)-3-氧代環(huán)丁-1-烯-1-酸鹽(化合物(8))的制備 化合物(8)10.1 1，2-二甲基-6-硝基喹啉碘化物的制備將2-甲基-6-硝基喹啉(0.5g，2.66mmol)和碘代甲烷(1ml，16mmol)一起在乙腈(10ml)中加熱回流48小時。將該混合物冷卻至室溫，一種灰色的物質(zhì)從該溶液中結(jié)晶出來，將其濾出。表明其是起始材料。將濾液用乙酸乙酯(200ml)進行稀釋，得到一種黃色/綠色沉淀。將產(chǎn)物濾出，用乙酸乙酯進行洗滌，然后將其在真空下進行干燥。得到黃色/綠色固體形式的產(chǎn)物(147mg，16.8％)。
LCMS(C11H11N2O2需要M+203)單一組分M+203。
10.2 2，3，3-三甲基-5-磺基-1-(4-磺基丁基)-3H-吲哚，鉀鹽的制備將2，3，3-三甲基假吲哚-5-磺酸鉀(6g，21.6mmol)和1，4-丁磺酸內(nèi)酯(55ml)一起在氮氣下在90℃下加熱24小時。在冷卻后，將該反應(yīng)混合物用乙酸乙酯進行稀釋，將所得的固體濾出，用乙酸乙酯洗滌并將其真空干燥。分離出淡粉色固體形式的產(chǎn)物(10.3g)。用1H NMR(CD3OD)對該產(chǎn)物進行定性。
10.3化合物(8)的制備將1，2-二甲基-6-硝基-喹啉碘化物(100mg，0.30mmol)、3，4-二羥基-3-環(huán)丁烯-1，2-二酮(34.5mg，0.30mmol)和2，3，3-三甲基-5-磺基-1-(4-磺基丁基)-3H-吲哚，鉀鹽(124mg，0.30mmol)一起在吡啶(3ml)、醋酸(3ml)和醋酸酐(2ml)的混合物中在120℃下加熱1小時?？吹皆摲磻?yīng)混合物變成深綠/藍(lán)色。在冷卻后，將該反應(yīng)混合物傾倒到乙酸乙酯中以使產(chǎn)物沉淀。將產(chǎn)物濾出并用RP HPLC對該混合物進行純化，用水/乙腈/0.1％TFA混合物進行洗脫。得到深藍(lán)色固體形式的產(chǎn)物(14mg)。
LCMS(C30H30N3O10S2需要M+656)ES-給出了(M-H)2-再造(reconstruction)給出了654下的M-。
11.硝基-取代的Squaraine染料(化合物(1))與硝基-取代的花青染料(化合物(i)和(iii))在硝基還原酶基因報告試驗中作為底物的比較研究將包含NTR基因上游的NF-кB響應(yīng)元件的報告基因構(gòu)建體構(gòu)建到pDC511(AdmaxTM)中。將該報告基因與Ad5基因組DNA一起包裝到輔助細(xì)胞，HEK293中并拯救出不能復(fù)制的腺病毒。
在病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)前將HeLa細(xì)胞繼代培養(yǎng)24小時并將其在37℃下在5％CO2的潮濕氣氛中在包含10％胎牛血清+2mM L-谷酰胺的Dulbecco′s Modified Eagles培養(yǎng)基中培養(yǎng)一整夜。在該整夜培養(yǎng)后，用胰蛋白酶將這些細(xì)胞從各燒瓶中分離出來，匯集，制成細(xì)胞混懸液并測定細(xì)胞濃度。將該HeLa細(xì)胞混懸液以預(yù)定的感染復(fù)數(shù)(MOI)與病毒在足以覆蓋組織培養(yǎng)燒瓶底部的最小體積的完全培養(yǎng)基中進行混合，在T75cm2Costar燒瓶中對于106個細(xì)胞而言通常為15ml。將該細(xì)胞/病毒混懸液送回到恒溫箱中并將其在37℃下在5％CO2的潮濕氣氛下放置一整夜。在第二天，從各燒瓶中取出該培養(yǎng)基并將細(xì)胞單層用5-10ml PBS進行沖洗。用胰蛋白酶對這些細(xì)胞進行分離并將其匯集，制得轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的混懸液；測定該細(xì)胞混懸液的濃度并將其調(diào)節(jié)至5.0×104個細(xì)胞/ml。將200μl這種細(xì)胞混懸液分配到96孔微量滴定板的各孔中；≈104個細(xì)胞/孔。將所有的板都在37℃下在5％CO2的潮濕氣氛中培養(yǎng)一整夜。將培養(yǎng)了一整夜的培養(yǎng)基用200μl PBS代替。從各孔中取出該PBS并代之以位于不含血清的Dulbecco′s Modified Eagles培養(yǎng)基(100ng/ml，90μl)中的TNFα激動劑或者向復(fù)制孔(replicate wells)中加入對照(90μl不含血清的培養(yǎng)基)。將這些板放回到37℃的恒溫箱中在5％CO2的潮濕氣氛中放置2小時。同時，獨立地向復(fù)制孔中分配10μl10μM化合物(i)和(iii)(硝基-花青染料)以及化合物(1)(硝基-squaraine染料)的溶液并將這些板放回到37℃5％CO2的潮濕氣氛中。用Tecan″Ultra″熒光計對隨著時間的流逝的熒光信號進行監(jiān)測。在相同的條件下測量所有的底物以避免儀器假象。
圖2對包含硝基的squaraine染料(化合物(1)與包含硝基的花青染料(化合物(i)和(iii))的性能進行了比較?；衔?1)的信號與背景的比例為3∶1，與化合物(i)的1.3∶1相比，清楚地表明其在具有相似的熒光信號增加的情況下降低了背景熒光。
12.硝基-取代的Squaraine染料(化合物(1)和(2))在硝基還原酶基因報告試驗中作為底物的比較研究用與實施例11所述方法相同的方法，將HeLa細(xì)胞用腺病毒NF-кB報告系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在適宜的時間，將化合物(1)和(2)各自獨立地加入到復(fù)制孔中。在Tecan Ultra熒光計上監(jiān)測隨著時間的流逝的熒光信號，其數(shù)據(jù)如圖3中所示。
當(dāng)與化合物(1)進行比較時，在存在激動劑——TNF-α的情況下，化合物(2)清楚地表現(xiàn)出試驗信號顯著增加?；衔?2)還能探測包含所說報告基因的對照樣品細(xì)胞中的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性。這種基礎(chǔ)活性是包含NF-KB報告基因但是不含激動劑的細(xì)胞和mock轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞間信號的差異?；衔?1)不夠敏感，不能探測這種低水平的活性。認(rèn)為試驗敏感性的改善是進行了改良的化合物在細(xì)胞中的可獲得性(availability)的直接后果。因此，認(rèn)為化合物(2)可以在細(xì)胞質(zhì)中被獲得，所說的細(xì)胞質(zhì)也是表達(dá)的報告蛋白的同一隔室。在NTR表達(dá)后，對試驗板的顯微成像產(chǎn)生了具有強烈紅色細(xì)胞質(zhì)染色的細(xì)胞。
得自圖2和3的數(shù)據(jù)說明了硝基-取代的squaraine染料(化合物(2))性質(zhì)的改善是向該染料中引入兩個squarylium部分和加上了己酸基的結(jié)果。在化合物(iii)，硝基-取代的花青染料中存在的己酸基不足以改變化合物(i)的細(xì)胞定位，也不足以改變其在NTR試驗中的性能。
13.化合物(2)在HeLa細(xì)胞中的定位將HeLa細(xì)胞以每個皿120,000個細(xì)胞的密度進行涂布并將其在37℃下在包含10％胎牛血清+2Mm L-谷酰胺的Dulbecco′s ModifiedEagles培養(yǎng)基中培養(yǎng)一整夜。除去該培養(yǎng)了一整夜的培養(yǎng)基并代之以2ml包含1μM化合物(2)的不含血清的培養(yǎng)基。將這些培養(yǎng)皿放回到恒溫箱中放置2小時，然后在Zeiss Confocal顯微鏡上對其進行成像。
圖4表示了化合物(2)在HeLa細(xì)胞中的吸收和分布。沒有跡象表明化合物(2)被隔離到細(xì)胞器中。有細(xì)胞結(jié)構(gòu)背景標(biāo)記的跡象，但其并不會損害該試驗的性能。
14.對在活細(xì)胞NTR試驗中作為硝基還原酶底物的化合物(2)、(3)和(4)進行的評估在活細(xì)胞NTR試驗，圖5中表示了用硝基-取代的染料(化合物(2)、(3)和(4))作為硝基還原酶底物的用途的另外的實例。圖5中所示的化合物(3)的數(shù)據(jù)表明通過延長該染料的共軛系統(tǒng)可以獲得可以在更高的波長下進行發(fā)射的squaraine染料底物。如細(xì)胞的固定所表明的那樣，存在的己酸基團增加了該探針在細(xì)胞中的保留性。在固定后，化合物(2)和(3)在信號方面幾乎沒有降低，而在固定后，化合物(4)的信號幾乎損失了50％。
15.在NTR對底物作用后最大吸收移位的實例將位于DMSO中的化合物(8)(1mMol)(4μl)用PBS緩沖液進行稀釋(0.01M)(1.76ml)。測量該溶液的UV/Vis光譜。該底物在682nm下具有最大吸收，AU＝0.22。向該溶液中加入NADH(0.01M，PBS中)(200μl)和NTR酶(446ng/ml，37μl)，將該混合物在室溫下靜置30分鐘。其后，重新測量其吸收光譜。觀察到在621nm下具有新的最大吸收，AU＝0.17。
權(quán)利要求
1.一種探測組合物中的硝基還原酶酶活性的方法，其包括i)將所說的組合物在促進硝基還原酶活性的條件下與染料分子進行混合物；和ii)測量所說染料分子光學(xué)性質(zhì)的變化，其中所說的變化是硝基還原酶活性數(shù)量的度量；其特征在于所說的染料分子是包含至少一個NO2基團的squaraine染料。
2.如權(quán)利要求
1所述的方法，其中所說的組合物包含至少一種細(xì)胞或細(xì)胞提取物。
3.如權(quán)利要求
1或權(quán)利要求
2所述的方法，其中所說的方法是在存在要測定其對硝基還原酶酶活性的影響的試驗物質(zhì)的情況下進行的。
4.一種方法，其包括i)將宿主細(xì)胞與染料分子進行接觸，其中所說的宿主細(xì)胞已經(jīng)用核酸分子進行了轉(zhuǎn)染，所說的核酸分子包含與編碼硝基還原酶的序列可操作地連接的表達(dá)控制序列；和ii)測量所說的染料分子光學(xué)性質(zhì)的變化，其中所說的變化是硝基還原酶活性數(shù)量的度量；其特征在于所說的染料是包含至少一個NO2基團的squaraine染料。
5.如權(quán)利要求
1至4中任意一項所述的方法，其中所說的光學(xué)性質(zhì)的變化是所說染料分子熒光強度的增加，從而所說的增加是硝基還原酶活性數(shù)量的度量。
6.如權(quán)利要求
1至5中任意一項所述的方法，其中所說的squaraine染料是式(I)的染料 其中R3被連接到Z1環(huán)結(jié)構(gòu)上和R4被連接到Z2環(huán)結(jié)構(gòu)上；Z1和Z2獨立地表示苯基或萘基環(huán)系；X和Y相同或不同并選自氧、硫、-CH＝CH-和基團 基團R1和R2獨立地選自C1-C4烷基、-(CH2)n-P、-{(CH2)2-O}p-R6和基團W；其中P選自COOR7、SO3-和OH，W是單-或二-取代的硝基芐基，R6是甲基或乙基，R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，n是從1至10的整數(shù)，和p是從1至3的整數(shù)；基團R3和R4獨立地選自氫、NO2、鹵素、SO3-、C1-C4烷氧基和-(CH2)m-COOR7；其中R7的定義如上文所述和m是0或1至5的整數(shù)；R5是任選地被COOR7、SO3-或OH取代的C1-C6烷基；其中R7的定義如上文所述；和基團R1、R2、R3和R4中至少一個包含至少一個NO2基。
7.如權(quán)利要求
4至6中任意一項所述的方法，其中所說的染料是細(xì)胞可滲透性的或者被賦予了細(xì)胞可滲透性。
8.如權(quán)利要求
1至7中任意一項所述的方法，其中所說squaraine染料的基團R1和R2中的一種是或者二者都是基團W，其中W的定義如上文所述。
9.如權(quán)利要求
8所述的方法，其中所說的squaraine染料是選自下式染料的化合物 其中X和Y相同或不同并選自氧、硫、-CH＝CH-和基團 其中R5的定義如上文所述；R1和R2中至少一個是基團W；其中W的定義如上文所述；任何其余的基團R1或R2選自C1-C4烷基、-(CH2)n-P和-{(CH2)2-O}p-R6；其中P選自COOR7、SO3-和OH，R6是甲基或乙基，R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，n是從1至10的整數(shù)和p是從1至3的整數(shù)；和基團R3和R4獨立地選自氫、鹵素、SO3-、C1-C4烷氧基和-(CH2)m-COOR7；其中R7的定義如上文所述和m是0或1至5的整數(shù)。
10.如權(quán)利要求
9所述的方法，其中基團R1和R2中的一個選自基團W，其中W選自 其余的R1或R2選自甲基和乙基，或者是基團-(CH2)n-COOR7，其中R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，n是從1至10的整數(shù)，優(yōu)選地是5或6。
11.如權(quán)利要求
10所述的方法，其中W是基團 和其余R1或R2的定義如上文所述。
12.如權(quán)利要求
1至7中任意一項所述的方法，其中所說的squaraine染料的基團R3和R4中的一種是或者二者都是NO2。
13.如權(quán)利要求
12所述的方法，其中所說的squaraine染料是下式的化合物 其中X和Y相同或不同并選自氧、硫、-CH＝CH-和基團 其中R5的定義如上文所述；基團R1或R2獨立地選自C1-C4烷基、-(CH2)n-P和-{(CH2)2-O}p-R6；其中P選自COOR7、SO3-和OH，R6是甲基或乙基，R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，n是從1至10的整數(shù)和p是從1至3的整數(shù)；基團R3和R4中至少一個是NO2；和任何其余的基團R3或R4選自氫、SO3-、C1-C4烷氧基和-(CH2)m-COOR7；其中R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，和m是0或1至5的整數(shù)。
14.一種對要測定其對硝基還原酶基因表達(dá)的作用的試驗物質(zhì)進行篩選的方法，所說的方法包括a)在不存在和存在所說試驗物質(zhì)的情況下進行如權(quán)利要求
4至13中任意一項所述的方法；和b)在不存在和存在所說物質(zhì)的情況下測定硝基還原酶基因表達(dá)的數(shù)量；其中在不存在和存在所說物質(zhì)情況下硝基還原酶基因表達(dá)數(shù)量之間的差異是所說物質(zhì)對硝基還原酶基因表達(dá)的作用的指示。
15.一種對要測定其對硝基還原酶基因表達(dá)的作用的試驗物質(zhì)進行篩選的方法，所說的方法包括a)在存在所說物質(zhì)的情況下進行如權(quán)利要求
4至13中任意一項所述的方法；和b)將硝基還原酶基因表達(dá)的數(shù)量與不存在該試驗物質(zhì)情況下硝基還原酶基因表達(dá)數(shù)量的對照值進行比較。
16.如權(quán)利要求
15所述的方法，其中將所說的對照值電子存儲在數(shù)據(jù)庫中或者存儲為其它電子形式。
17.一種選自下式染料的化合物 其中X和Y相同或不同并選自氧、硫、-CH＝CH-和基團 基團R1和R2獨立地選自C1-C4烷基、-(CH2)n-P、-{(CH2)2-O}p-R6和基團W；其中P選自COOR7、SO3-和OH，W是單-或二-取代的硝基芐基，R6是甲基或乙基，R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，n是從1至10的整數(shù)，和p是從1至3的整數(shù)；基團R3和R4獨立地選自氫、NO2、鹵素、SO3-、C1-C4烷氧基和-(CH2)m-COOR7；其中R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，和m是0或1至5的整數(shù)；R5是任選地被COOR7、SO3-或OH取代的C1-C6烷基；其中R7的定義如上文所述；和基團R1、R2、R3和R4中至少一個包含至少一個NO2基。
18.如權(quán)利要求
17所述的化合物，其中基團R1和R2中的一個是 其余的R1或R2選自甲基、乙基和基團-(CH2)n-COOR7；其中R7的定義如上文所述和n是從1至10的整數(shù)。
19.如權(quán)利要求
18所述的化合物，其中所說的其余的R1或R2選自基團-(CH2)5-COOR7和-(CH2)6-COOR7；其中R7的定義如上文所述。
20.如權(quán)利要求
17所述的化合物，其中基團R1和R2獨立地選自C1-C4烷基、-(CH2)n-COOR7和-{(CH2)2-O}p-R6；其中R6是甲基或乙基，R7選自H、C1-C4烷基和CH2OC(O)R8，其中R8是甲基、或叔-丁基，和n和p的定義如上文所述；基團R3和R4中的至少一個是NO2；和其余的基團R3或R4選自氫、SO3-、C1-C4烷氧基和-(CH2)m-COOR7；其中R7的定義如上文所述和m是0或1至5的整數(shù)。
21.如權(quán)利要求
17至20中任意一項所述的化合物用作用于探測和/或測量硝基還原酶酶活性的底物的應(yīng)用。
專利摘要
公開了硝基－取代的squaraine報告染料以及用該類染料來探測細(xì)胞試驗中的硝基還原酶酶活性和硝基還原酶基因表達(dá)的方法。所說的染料為結(jié)構(gòu)式(I)的染料，其中Z
文檔編號C09B57/00GK1993477SQ20058002547
公開日2007年7月4日 申請日期2005年5月24日
發(fā)明者R·M·韋斯特, R·伊斯邁爾 申請人:通用電氣醫(yī)療集團英國有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan