本發(fā)明涉及熒光探針，具體屬于一種熒光探針及其制備方法，以及該探針應(yīng)用于生物樣品中pH和亞硫酸氫根的檢測。

背景技術(shù)：

HSO₃^-和pH在現(xiàn)代工業(yè)和生產(chǎn)生活中具有重要意義。亞硫酸鹽因為能夠抑制氧化和微生物生長以及著色等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于食物和飲料。但是亞硫酸過量會引起一些疾病，如過敏反應(yīng)、哮喘、腸胃和皮膚過敏疾病等。WHO規(guī)定每人每日亞硫酸鹽的允許攝入量為0-0.7mg/Kg(以SO₂計)?，F(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)中釋放大量的二氧化硫，形成的酸雨嚴(yán)重腐蝕建筑物和莊稼，并且會導(dǎo)致河流湖泊過度酸化。因此在生物和實際樣品中方便快速檢測亞硫酸鹽十分必要的。

細(xì)胞內(nèi)的pH在參與細(xì)胞活動中起著必不可少的作用，比如：細(xì)胞循環(huán)調(diào)控、細(xì)胞的生長和凋亡、離子轉(zhuǎn)運、酶活性、鈣調(diào)控、肌肉收縮和多用耐藥性等方面。

pH異常會導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂甚至嚴(yán)重者會引發(fā)諸如炎癥、癌癥、阿爾茨海默癥等疾病。因此，對pH值的動態(tài)變化進行靈敏、準(zhǔn)確的實時監(jiān)測能夠為分子水平上研究細(xì)胞的生理和毒理過程提供重要的信息。

目前已經(jīng)存在的亞硫酸鹽檢測方法有色譜法。傳感器法、電化學(xué)法、毛細(xì)血管電泳和酶技術(shù)聯(lián)用等。常用于pH的檢測方法有微電極、NMR和紫外吸收光譜等。但這些方法具有很大的局限性，如儀器昂貴、處理復(fù)雜、費事等，不利于檢測。相反熒光光譜檢測技術(shù)具有快速實時響應(yīng)、分辨率高、靈敏度高、操作簡便、非破壞性等優(yōu)點，且基于熒光探針與分子作用引起的熒光信號變化的傳感、熒光顯微成像的熒光光譜法顯示出獨特的時間和空間上的優(yōu)勢，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡，熒光成像技術(shù)成為分子水平上進行實時原位監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)pH和HSO₃^-的重要手段。現(xiàn)在文獻報道了許多用于檢測pH或HSO₃^-的熒光探針，但是能同時檢測pH和HSO₃^-的熒光探針是非常少的。因此，這就迫切需要計和合成具有合成簡單、靈敏度高、選擇性好、檢出限低、光穩(wěn)定性好的能檢測生物樣品的pH和HSO₃^-變化的熒光探針。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種熒光探針PMPA。目的之二是提供該探針PMPA的制備方法，該制備工藝簡單，成本低廉。目的之三是提供該探針的用途，即應(yīng)用于生物樣品pH和HSO₃^-變化的檢測。該探針應(yīng)具有快速響應(yīng)、靈敏度高、選擇性、檢出限低和光穩(wěn)定性好，并且具有大的Stokes位移，能夠有效減小生物樣品自身熒光的干擾的優(yōu)點。

本發(fā)明提供了一種熒光探針PMPA，其是1-(芘-1-基)-3-(6-甲氧基吡啶-3-基)丙烯酮，結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明提供的一種的熒光探針PMPA的制備方法，包括如下步驟：

(1)按摩爾比3:3-5將1-乙酰芘、6-甲氧基-吡啶-二甲醛溶解于無水乙醇中，并且在室溫下攪拌至反應(yīng)物完全溶解，呈淡黃色溶液；

(2)然后加入氫氧化鈉溶液,常溫下繼續(xù)攪拌32小時，TLC跟蹤反應(yīng)(V_乙酸乙酯：V_石油醚＝1：10)；

(3)最后加入無水乙醇，生成黃色的絮狀沉淀；靜置，抽濾，干燥，即得到黃色固體PMPA。

其合成路線如下：

本發(fā)明提供的一種定量熒光檢測酸性條件下pH的方法，其步驟為：

(1)用DMSO配制1mM的熒光探針PMPA儲備液；

(2)將2.0mL蒸餾水以及30.0μL熒光探針PMPA儲備液加入熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，527nm處的熒光強度逐漸減弱，417nm處的熒光強度逐漸增強。

(3)以pH為橫坐標(biāo)，以相對熒光強度I_417nm/I_527nm為縱坐標(biāo)繪制圖并進行Sigmoidal擬合，求得pK_a＝2.70；通過線性擬合得到熒光探針的最佳線性響應(yīng)范圍為pH1.26-3.97，回歸方程為：I_417nm/I_527nm＝-4.64×pH+19.87，線性相關(guān)系數(shù)為R²＝0.9906。

穩(wěn)定性實驗證明熒光探針對酸性pH的測定具有良好的光穩(wěn)定性。

經(jīng)實驗驗證，常見金屬陽離子不干擾體系對酸性pH的測定。

本發(fā)明提供的一種定量熒光檢測堿性條件下pH的方法，其特征在于，步驟為：

(1)用DMSO配制1mM的熒光探針PMPA儲備液；

(2)將2.0mL蒸餾水以及30.0μL熒光探針PMPA儲備液加入熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，527nm處的熒光強度逐漸減弱，460nm處的熒光強度逐漸增強；

(3)以pH為橫坐標(biāo)，以相對熒光強度I_527nm/I_460nm為縱坐標(biāo)繪制圖并進行Sigmoidal擬合，求得pK_a＝9.32；通過線性擬合得到熒光探針的最佳線性響應(yīng)范圍為pH8.50-10.35，回歸方程為：I_527nm/I_460nm＝-1.15×pH+12.46，線性相關(guān)系數(shù)為R²＝0.9904。

穩(wěn)定性實驗證明熒光探針對堿性pH的測定具有良好的光穩(wěn)定性。

經(jīng)實驗驗證，常見金屬陽離子不干擾體系對堿性pH的測定。

本發(fā)明提供了一種定量熒光檢測HSO₃^-的方法，其特征在于，步驟為:

(1)用DMSO配制1mM的熒光探針PMPA儲備液；

(2)將2.0mLPBS緩沖溶液(pH＝4.00)以及30.0μL熒光探針儲備液加入熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，527nm處的熒光強度逐漸減弱。

(3)以HSO₃^-濃度為橫坐標(biāo)，以相對熒光強度△F為縱坐標(biāo)繪制圖，得到HSO₃^-濃度的工作曲線，線性回歸方程為：△F＝64.53[HSO₃^-]+21.68。線性相關(guān)系數(shù)為R²＝0.9943，最佳線性響應(yīng)范圍為0μM-6.5μM，檢出限(LOD)為0.32μM，。

經(jīng)實驗驗證，常見陰離子不干擾體系對HSO₃^-的測定。

本發(fā)明的熒光探針PMPA通過熒光共聚焦顯微鏡成像技術(shù)，證明了可用于檢測生物(動物、微生物)樣品內(nèi)pH或HSO₃^-變化。

與現(xiàn)有熒光探針相比，本發(fā)明合成熒光探針PMPA具有以下優(yōu)點：1、本發(fā)明的熒光探針合成步驟簡單，成本低廉。2、該探針既能檢測pH又能檢測HSO₃^-，并且可以應(yīng)用于生物樣品的pH或HSO₃^-變化的檢測。3、熒光PMPA對pH和HSO₃^-響應(yīng)具有靈敏度高、檢出限低和選擇性好，不受常見金屬離子的干擾并且具有大的Stokes位移，能夠有效減小激發(fā)和生物樣品自身熒光的干擾。4、檢測手段簡單，只需要借助熒光光譜儀即可實現(xiàn)。

附圖說明

圖1實施例2熒光探針隨酸性變化的紫外吸收光譜圖

圖2實施例3熒光探針隨酸性變化的熒光滴定圖

圖3實施例3熒光探針對酸性響應(yīng)的工作曲線

圖4實施例4熒光探針對常見金屬離子的響應(yīng)情況

圖5實施例5大腸桿菌(E.coli)成像圖

圖6實施例6人肺腺癌細(xì)胞(A549)成像圖

圖7實施例7熒光探針隨堿性變化的紫外吸收光譜圖

圖8實施例8熒光探針隨堿性變化的熒光滴定圖

圖9實施例8熒光探針對堿性響應(yīng)的工作曲線

圖10實施例9熒光探針對常見金屬離子的響應(yīng)情況

圖11實施例10大腸桿菌(E.coli成像圖

圖12實施例11人肺腺癌細(xì)胞(A549)

圖13實施例12熒光探針隨HSO₃^-變化的紫外吸收光譜圖

圖14實施例13熒光探針隨HSO₃^-變化的熒光滴定圖

圖15實施例13熒光探針對HSO₃^-響應(yīng)的工作曲線

圖16實施例14熒光探針對常見陰離子的響應(yīng)情況

圖17實施例15人肺腺癌細(xì)胞(A549)成像圖

具體實施方式

實施例1熒光探針的的制備

(1)在250mL雙口燒瓶中分別加入0.7436g(3.0mmol)1-乙酰芘、0.5482g(4.0mmol)6-甲氧基-吡啶-二甲醛和60mL無水乙醇，常溫(20℃)下磁力攪拌10分鐘至反應(yīng)物完全溶解，呈淡黃色溶液；

(2)然后加入3mL 10％氫氧化鈉溶液，反應(yīng)液變?yōu)辄S色，常溫下繼續(xù)攪拌32小時，TLC跟蹤反應(yīng)(V_乙酸乙酯：V_石油醚＝1：10)；

(3)期間黃色溶液逐漸變?yōu)辄S色晶體貼在燒瓶壁上，加入無水乙醇后，生成大量黃色的絮狀沉淀；靜置，抽濾，干燥，得到黃色固體產(chǎn)品0.5211g，產(chǎn)率47.1％。

熒光探針用¹H NMR表征，結(jié)果如下：

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆,δ/ppm):δ8.625～8.609(d,1H,J＝9.6Hz),8.544(s,1H),8.469～8.456(d,1H,J＝7.8Hz),8.431～8.384(m,3H),8.348～8.283(m,4H),8.171～8.145(t,1H,J＝7.8Hz),7.747～7.721(d,1H,J＝15.6Hz),7.678～7.651(d,1H,J＝16.2Hz),6.929～6.915(d,1H,J＝8.4Hz),3.908(s,1H).

¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆,δ/ppm):194.83,165.39,150.04,142.47,138.20，133.83,133.28,131.16,130.56,129.67,129.54,129.09,127.74,127.26,127.21,126.85,126.59,126.52,124.93,124.87,124.79,124.48,124.04,111.68,54.10.

實施例2熒光探針隨酸性變化的紫外吸收光譜圖

在2.0mL蒸餾水體系中加入30.0μL熒光探針儲備液,并且用HCl進行調(diào)節(jié)pH值，并記錄其紫外吸收光譜(圖1)。隨著酸性的減弱，在330nm處的紫外吸收逐漸下降。

實施例3熒光探針PMPA隨酸性變化的熒光滴定圖

在2.0mL蒸餾水的體系中加入30.0μL熒光探針儲備液，用HCl調(diào)節(jié)體系的pH值，在熒光分光光度儀上檢測，隨著酸性的增強，527nm處的熒光強度逐漸減弱,417nm處的熒光強度逐漸增強(圖2)。儀器參數(shù):激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度分別為5.0nm、5.0nm，電壓為600V，熒光探針溶液的最大激發(fā)波長為：λ_ex為370nm和最大發(fā)射波長為λ_em 527nm。以相對熒光強度I_417nm/I_527nm為對pH值作圖，并利用Sigmoidal進行擬合，求得pK_a＝2.70；通過線性擬合得到PMPA最佳線性響應(yīng)范圍為pH 1.26-3.97，回歸方程為：I_417nm/I_527nm＝-4.64×pH+19.87，線性系數(shù)為R²＝0.9906(圖3)。

實施例4熒光探針對常見金屬離子的響應(yīng)情況

將實施例1中的探針濃度保持在15.0μM，考察該探針在常見金屬離子存在下，對H⁺的選擇性。圖4所示，分別在不同pH(pH 7.30,3.05)條件下，探針對金屬離子幾乎沒有響應(yīng)，證明了對H⁺具有很高的選擇性。圖4中物質(zhì)的順序和濃度依次為:1.空白；2.Ca²⁺(150mM)；3.Na⁺(150mM)；4.K⁺(150mM)；5.Zn²⁺(0.2mM)；6.Mg²⁺(2.0mM)；7.Hg²⁺(0.2mM)；8.Fe²⁺(0.2mM)；9.Al³⁺(0.2mM)；10.Pb²⁺(0.2mM)；11.Mn²⁺(0.2mM)；12.Co²⁺(0.2mM)；13.Cr³⁺(0.2mM)；14.Cd²⁺(0.2mM)；15.Fe³⁺(0.2mM)；16.Ni²⁺(0.2mM)；17.Cu²⁺(0.2mM).

實施例5大腸桿菌(E.coli)成像圖

將接種好的大腸桿菌(E.coli)與實施1中的探針分別在pH 7.30,4,50,3.00,和1.50的條件下于搖床中共同孵育2h,在激光共聚焦顯微鏡下觀察。分別固定激發(fā)波長為405nm和458nm,收集發(fā)射波段分別為藍色通道(410-460nm)和橙色通道(480-560nm)。隨著pH從7.30降低到1.50,大腸桿菌的橙色熒光逐漸減弱甚至粹滅，而藍色熒光逐漸增強(圖5)。

實施例6人肺腺癌細(xì)胞(A549)成像圖

實驗之前用無水DMSO溶解固體ECBT得到濃度為1mM熒光探針PMPA儲備液。分別在pH7.30，5.00，4.00和3.00的條件下取上述15μL熒光探針PMPA儲備液加入含有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)基，置于37℃的5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育15min后，用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)清洗三次，以除去培養(yǎng)基中過量的未進入細(xì)胞的探針儲備液，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。分別固定激發(fā)波長為405nm和458nm,收集發(fā)射波段分別為藍色通道(410-460nm)和橙色通道(480-560nm)。隨著pH從7.30降低到3.00,細(xì)胞內(nèi)橙色熒光逐漸減弱，而藍色熒光逐漸增強(圖6)。

實施例7熒光探針PMPA隨堿性變化的紫外吸收光譜圖

在2.0mL蒸餾水體系中加入30.0μL熒光探針儲備液,并且用NaOH進行調(diào)節(jié)pH值，并記錄其紫外吸收光譜(圖7)。隨著堿性增強，在330nm處的紫外吸收逐漸下降，并且出現(xiàn)藍移。

實施例8熒光探針PMPA隨堿性變化的熒光滴定圖

在2.0mL蒸餾水的體系中加入30.0μL熒光探針儲備液，用NaOH調(diào)節(jié)體系的pH值，在熒光分光光度儀上檢測，隨著堿性增強，527nm處的熒光強度逐漸減弱,460nm處的熒光強度逐漸增強(圖8)。儀器參數(shù):激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度分別為5.0nm、5.0nm，電壓為600V，熒光探針溶液的最大激發(fā)波長為：λ_ex為370nm和最大發(fā)射波長為λ_em 527nm。以相對熒光強度I_527nm/I_460nm對pH值作圖，并利用Sigmoidal進行擬合，求得pK_a＝9,.32；通過線性擬合得到最佳線性響應(yīng)范圍為pH 8.50-10.35，回歸方程為：I_527nm/I_460nm＝-1.15×pH+12.46，線性系數(shù)為R²＝0.9904(圖9)。

實施例9熒光探針對常見金屬離子的響應(yīng)情況

將實施例1中的探針濃度保持在15.0μM，考察該探針在常見金屬離子存在下，對OH^-的選擇性。圖10所示，分別在不同pH(pH 7.30,8.15)條件下，探針對金屬離子幾乎沒有響應(yīng)，證明了對OH^-具有很高的選擇性。圖10中物質(zhì)的順序和濃度依次為:1.空白；2.Ca²⁺(150mM)；3.Na⁺(150mM)；4.K⁺(150mM)；5.Zn²⁺(0.2mM)；6.Mg²⁺(2.0mM)；7.Hg²⁺(0.2mM)；8.Fe²⁺(0.2mM)；9.Al³⁺(0.2mM)；10.Pb²⁺(0.2mM)；11.Mn²⁺(0.2mM)；12.Co²⁺(0.2mM)；13.Cr³⁺(0.2mM)；14.Cd²⁺(0.2mM)；15.Fe³⁺(0.2mM)；16.Ni²⁺(0.2mM)；17.Cu²⁺(0.2mM).

實施例10大腸桿菌(E.coli)成像圖

將接種好的大腸桿菌(E.coli)與實施1中的探針分別在pH 7.30,9,50,10.50,和11.50的條件下于搖床中共同孵育2h,在激光共聚焦顯微鏡下觀察。分別固定激發(fā)波長為405nm和458nm,收集發(fā)射波段分別為綠色通道(410-490nm)和橙色通道(510-600nm)。隨著pH逐漸增強,大腸桿菌的橙色熒光逐漸減弱甚至粹滅，而綠色熒光逐漸增強(圖11)。

實施例11人肺腺癌細(xì)胞(A549)成像圖

實驗之前用無水DMSO溶解固體ECBT得到濃度為1mM熒光探針PMPA儲備液。分別在pH7.30，8.00，8.50和9.00的條件下取上述15μL熒光探針PMPA儲備液加入含有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)基，置于37℃的5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育15min后，用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)清洗三次，以除去培養(yǎng)基中過量的未進入細(xì)胞的探針儲備液，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。分別固定激發(fā)波長為405nm和458nm,收集發(fā)射波段分別為綠色通道(410-490nm)和橙色通道(510-600nm)。隨著pH增強,細(xì)胞內(nèi)橙色熒光逐漸減弱，而綠色熒光逐漸增強(圖12)。

實施例12熒光探針的HSO₃^-變化的紫外吸收光譜圖

在2.0mLPBS緩沖溶液(pH＝4.0)的體系中加入30.0μL熒光探針儲備液進行HSO₃^-紫外滴定實驗，并記錄其紫外吸收光譜(圖13)。隨著HSO₃^-量的增加，在345nm和427nm處的紫外吸收均下降。

實施例13熒光探針隨HSO₃^-變化的熒光滴定圖

在2.0mLPBS緩沖溶液(pH＝4.0)的體系中加入30.0μL熒光探針儲備液進行HSO₃^-熒光滴定實驗，在熒光分光光度儀上檢測，隨著HSO₃^-的增加，527nm處的熒光強度逐漸減弱(圖14)。儀器參數(shù):激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫寬度分別為5.0nm、5.0nm，電壓為600V，熒光探針溶液的最大激發(fā)波長為：λ_ex為410nm和最大發(fā)射波長為λ_em 527nm。以HSO₃^-濃度為橫坐標(biāo)，以相對熒光強度△F為縱坐標(biāo)繪制圖，并利用Sigmoidal進行擬合，得到HSO₃^-濃度的工作曲線，線性回歸方程為：△F＝64.53[HSO₃^-]+12.46。線性相關(guān)系數(shù)為R²＝0.9943，最佳線性響應(yīng)范圍為0μM-6.5μM，檢出限(LOD)0.32μM(圖15)。

實施例14熒光探針對常見陰離子的響應(yīng)情況

在2.0mLPBS緩沖溶液(pH＝4.0)的體系中加入30.0μL熒光探針儲備液，再分別加入其它陰離子(F^-、Cl^-、Br^-、I^-、CO₃^2-、HCO₃^2-、NO₃^-、SO₄^2-、AcO^-、SCN^-、S₂O₃^2-、S^2-、HS^-)，使其最終濃度為0.5mM,再加入HSO₃^2-，使其最終濃度為7.0μM，分別測其熒光光譜，繪制不同陰離子對應(yīng)527nm熒光強度的柱狀圖。經(jīng)試驗驗證，其它陰離子不干擾體系對HSO₃^2-的檢測(圖16)。

實施例15人肺腺癌細(xì)胞(A549)成像圖

1)先將兩個培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液抽出，并用pH＝7.40的PBS緩沖液洗滌。

2)然后向兩個培養(yǎng)皿中加入含有15.0μL探針PNPA(1mM，用DMSO溶解)的2.0mLPBS(pH7.40)緩沖溶液孵育20min左右，后抽出，在用pH＝7.40的PBS緩沖液進行洗滌。

3)2.0向其中一個孔板中加入含有6.0μL(1×10^-3M)HSO₃^-的2.0mL pH＝4.00的PBS緩沖溶液孵育20min左右，另一個孔板中只加入2.0mL pH＝4.00的PBS緩沖溶液孵育20min左右，后抽出，再用pH＝7.40的PBS緩沖溶液進行洗滌,最后在培養(yǎng)皿中加入2.0mL pH＝7.40的PBS溶液在激光共聚焦顯微鏡下觀察。固定激發(fā)波長為458nm,收集發(fā)射波長橙色通道(480-600nm)。在熒光共聚焦顯微鏡下可以看到在只加入探針時，細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)橙色熒光，加入)HSO₃^-后橙色減弱甚至消失(圖17)。