本發(fā)明涉及一種萃取根皮苷的方法，特別涉及一種從蘋果渣中萃取根皮苷的方法。

背景技術(shù)：
根皮苷(phlorizin)是根皮素(phloretin)的葡萄糖苷，屬于二氫查爾酮類物質(zhì)，具有抗氧化、降血糖、美白、預(yù)防骨質(zhì)酥松等生理活性。因?yàn)楦ぼ帐氢c依賴葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SGLT)的靶向抑制劑，能夠?qū)Ｒ坏摹⒏?jìng)爭(zhēng)性的抑制腎小管中SGLT1和SGTL2對(duì)葡萄糖的重吸收，從而降低體內(nèi)血糖水平，因此，根皮苷的降血糖活性不依賴于胰島素，且對(duì)Ⅱ型糖尿病及其并發(fā)癥具有良好的防治效果。此外，根皮苷還是一種甜度較高的天然甜味劑，對(duì)糖尿病人是一種極好的糖類替代品。正因?yàn)楦ぼ站邆湟陨溪?dú)特的功能與性質(zhì)，使其在功能性食品、新型藥物和化妝品開發(fā)中的用量逐年上升，歐美國(guó)家已經(jīng)有用根皮苷作為先導(dǎo)化合物生產(chǎn)的藥品上市，相比之下，我國(guó)對(duì)于根皮苷的開發(fā)比較緩慢。根皮苷在1835年由法國(guó)化學(xué)家從蘋果樹皮中分離得到，此后在蘋果樹根、莖、葉以及蘋果果實(shí)、皮渣中相繼發(fā)現(xiàn)根皮苷的存在。近年來(lái)，在多穗石柯、荔枝皮與湖北海棠中也分離得到了根皮苷。根皮苷在蘋果皮中含量較高。我國(guó)是世界第一大蘋果生產(chǎn)國(guó)與消費(fèi)國(guó)，蘋果渣尤其蘋果皮渣是主要加工副產(chǎn)物，其中蘊(yùn)含豐富的根皮苷資源。目前除少量皮渣被用于生產(chǎn)果膠和飼料外，大量皮渣被遺棄，不僅造成資源浪費(fèi)，而且嚴(yán)重污染環(huán)境。若能高效的從蘋果皮渣中分離純化根皮苷，不僅能夠保護(hù)環(huán)境，更能變廢為寶，推動(dòng)產(chǎn)業(yè)中根皮苷的開發(fā)與利用。目前，根皮苷的提取方法有水提法、醇提法及超聲或微波輔助提取法，提取得到的根皮苷粗提物雜質(zhì)含量高，根皮苷純度低，還需進(jìn)行進(jìn)一步的純化過(guò)程。萃取是根皮苷純化過(guò)程中的常用步驟。例如專利名稱為“從薔薇科植物的皮根枝葉及榨汁廢料中提取根皮苷的工藝(CN100463913C)”，“一種從鎖陽(yáng)中提取分離高純度根皮苷的方法(CN103626811A)”，“一種從植物中高效提取根皮苷的方法(CN103864864A)均涉及到根皮苷的萃取。但這些萃取方法均采用有機(jī)溶劑萃取，例如乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷等，造成產(chǎn)品中有機(jī)溶劑殘留，不利于根皮苷的開發(fā)利用；且有機(jī)溶劑萃取過(guò)程中乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，分相時(shí)間較慢，不利于工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種雙水相萃取蘋果渣中根皮苷的方法。該方法克服了現(xiàn)有萃取工藝的諸多不足，不僅能夠使根皮苷與水溶性多糖分離，達(dá)到純化根皮苷的目的，而且無(wú)有毒有機(jī)溶劑殘留，萃取過(guò)程中無(wú)乳化現(xiàn)象，分相時(shí)間短，易于工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)。本發(fā)明提供的一種雙水相萃取蘋果渣中根皮苷的方法，包括以下步驟：(1)將蘋果渣勻漿后，加入乙醇或乙醇的水溶液，攪拌提取，得提取液；(2)通過(guò)離心或減壓過(guò)濾對(duì)所述提取液進(jìn)行固液分離，收集上清液；(3)在所述上清液中加入無(wú)機(jī)鹽的水溶液，形成雙水相體系，攪拌萃取，靜置分層后收集上層的乙醇相，減壓蒸餾，收集餾出液，即得所述根皮苷。上述雙水相萃取根皮苷的方法，步驟(1)中，所述蘋果渣為蘋果經(jīng)榨汁、過(guò)濾后剩余的蘋果渣，包括但不僅限于蘋果渣、蘋果皮或蘋果皮渣；每1g所述蘋果渣中可加入10～20mL所述乙醇或乙醇的水溶液，具體可加入10～15mL、15～20mL、10mL、15mL或20mL；所述乙醇的水溶液中乙醇的體積濃度可為40～100％，，但不為100％，具體可為60％～80％、60％～70％、70％～80％、60％、70％或80％。上述雙水相萃取根皮苷的方法，步驟(1)中，所述提取的時(shí)間可為2h～4h，具體可為2h～3h、3h～4h、2h、3h或4h。上述雙水相萃取根皮苷的方法，步驟(2)中，所述離心的轉(zhuǎn)速可為3000～10000rpm，具體可為5000rpm；所述離心的時(shí)間可為10～20min，具體可為15min。上述雙水相萃取根皮苷的方法，步驟(3)中，所述無(wú)機(jī)鹽為氯化鈉、硫酸銨、硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鉀、磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀中的至少一種。優(yōu)選硫酸銨所述無(wú)機(jī)鹽為硫酸銨，所述硫酸銨的水溶液中硫酸銨的質(zhì)量體積濃度可為0.4g/mL～0.43g/mL，具體可為0.4g/mL或0.43g/mL。上述雙水相萃取根皮苷的方法，步驟(3)中，所述雙水相體系中，所述乙醇的體積濃度可為31％～51％，具體可為36％～45％、36％～43％、43％～45％、36％、43％或45％；所述無(wú)機(jī)鹽的質(zhì)量體積濃度可為0.12～0.24g/mL，具體可為0.12～0.16g/mL、0.16～0.24g/mL、0.12g/mL、0.16g/mL或0.24g/mL。上述雙水相萃取根皮苷的方法，步驟(3)中，所述攪拌萃取的時(shí)間可為10min～30min，具體可為10min～15min、15min～30min、10min、15min或30min。上述雙水相萃取根皮苷的方法，步驟(3)中，所述減壓蒸餾在真空度低于0.09Mpa的條件下進(jìn)行，具體可為0.085Mpa；所述減壓蒸餾的溫度可為40～45℃，具體可為40℃～42℃、42～45℃、40℃、42℃或45℃。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：常規(guī)雙水相萃取需要先對(duì)提取液進(jìn)行濃縮，再加入配制好的雙水相體系進(jìn)行萃取，本發(fā)明研究了根皮苷參與下的乙醇/硫酸銨雙水相體系相圖，在此基礎(chǔ)上，能夠略去濃縮步驟，在溶劑提取根皮苷并分離得到的上清液中，直接加入硫酸銨水溶液，形成雙水相體系，簡(jiǎn)化操作。同時(shí)，與有機(jī)溶劑萃取相比，本發(fā)明無(wú)有毒有機(jī)溶劑殘留，無(wú)乳化現(xiàn)象，分相時(shí)間快，蛋白質(zhì)及多糖含量減少一半以上，萃取液中根皮苷濃度較高，根皮苷粗提物純度達(dá)到40％以上，有利于后期繼續(xù)純化。附圖說(shuō)明圖1為根皮苷參與下的乙醇/硫酸銨雙水相體系相圖。圖2為實(shí)施例2中乙醇提取蘋果渣中根皮苷的色譜圖。圖3為實(shí)施例2中乙醇/硫酸銨雙水相提取蘋果渣中根皮苷的色譜圖。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中采用HPLC分析和檢測(cè)根皮苷含量，分析條件為：C18柱；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：水(含2％甲酸)；流速1.0mL/min；梯度洗脫程序?yàn)椋?-15min(但不為0min)：20％A，80％B；15-17min(但不為17min)：30％A，70％B；17-18min(但不為18min)：80％A，20％B；18-20min(但不為20min)：20％A，80％B；20min：20％A，80％B。實(shí)施例1、根皮苷參與下的乙醇/硫酸銨雙水相體系研究(1)乙醇/硫酸銨雙水相相圖的繪制：精確配制2mL的0.4g/mL的硫酸銨水溶液，緩慢滴加乙醇液體，并在漩渦混合器上混合，觀察溶液的澄清程度，直至試管內(nèi)溶液開始出現(xiàn)渾濁為止，記錄乙醇的加入量，測(cè)量溶液體積并稱重。加入0.1mL水，使溶液變澄清，再緩慢滴加乙醇直至溶液渾濁，如此反復(fù)操作，計(jì)算每次達(dá)到渾濁時(shí)，乙醇的體積濃度與硫酸銨的質(zhì)量體積濃度。(2)有根皮苷參與的乙醇/硫酸銨雙水相相圖的繪制：取10mL體積濃度為70％的乙醇溶劑的蘋果皮渣提取液，緩慢滴加配制好的質(zhì)量體積濃度為0.4g/mL的硫酸銨水溶液，并在漩渦混合器上混合，觀察溶液的澄清程度，直至試管內(nèi)溶液開始出現(xiàn)渾濁為止，記錄滴加的硫酸銨水溶液的體積，再滴加0.5mL水，使溶液變澄清，再緩慢滴加硫酸銨水溶液，如此反復(fù)操作，計(jì)算每次達(dá)到渾濁時(shí)，乙醇的體積濃度與硫酸銨的質(zhì)量體積濃度。以硫酸銨的質(zhì)量體積濃度為橫坐標(biāo)，乙醇的體積濃度為縱坐標(biāo)，繪制雙水相相圖，見圖1。當(dāng)成相組分的配比在曲線的下方時(shí)，系統(tǒng)為均勻的單相，混合后溶液澄清透明，稱為均相區(qū)；當(dāng)配比在曲線的上方時(shí)，能自動(dòng)分成兩相，稱為兩相區(qū)；若配比在曲線上，混合后，溶液恰好由澄清變?yōu)闇啙帷Ｓ蓤D1看以看出，在根皮苷的參與下，乙醇/硫酸銨的雙水相體系被改變，一些能夠形成雙水相的配比在根皮苷的參與下，并不能形成雙水相。實(shí)施例2、雙水相萃取蘋果渣中的根皮苷(1)取10個(gè)蘋果，洗凈，除去果柄和萼片，切成小塊，榨汁機(jī)榨汁，8層紗布過(guò)濾，濾渣為蘋果渣。(2)稱取20g蘋果渣，粉碎機(jī)粉碎勻漿，加入體積濃度為70％的乙醇的水溶液300mL，攪拌提取4h。(3)收集上一步的提取液，5000rpm，離心15min后，收集澄清的上清液。取10μL上清液，過(guò)0.22μM微孔濾膜，采用HPLC分析根皮苷含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。(4)在上一步離心獲得的上清液中，加入180mL硫酸銨質(zhì)量體積濃度為0.4g/mL的硫酸銨水溶液，形成雙水相體系，其中，乙醇體積濃度為43％，硫酸銨的質(zhì)量體積濃度為0.16g/mL，充分?jǐn)嚢栎腿?0min，靜置分層后，收集上相乙醇相，在溫度40℃，真空度0.085MPa條件下，減壓蒸餾回收乙醇，得到干燥根皮苷提取物產(chǎn)品，通過(guò)HPLC檢測(cè)，采用面積歸一法分析，根皮苷純度為42.8％。結(jié)果見圖3。實(shí)施例3、雙水相萃取蘋果渣中的根皮苷(1)取10個(gè)蘋果，洗凈，除去果柄和萼片，切成小塊，榨汁機(jī)榨汁，8層紗布過(guò)濾，濾渣為蘋果渣。(2)稱取20g蘋果渣，粉碎機(jī)粉碎勻漿，加入體積濃度為80％的乙醇的水溶液200mL，攪拌提取2h。(3)收集上一步的提取液，5000rpm，離心15min后，收集澄清的上清液。(4)在上一步離心獲得的上清液中，加入240mL硫酸銨質(zhì)量體積濃度為0.4g/mL的硫酸銨水溶液，形成雙水相體系，其中，乙醇體積濃度為36％，硫酸銨的質(zhì)量體積濃度為0.24g/mL，充分?jǐn)嚢栎腿?0min，靜置分層后，收集上相乙醇相，在溫度42℃，真空度0.085MPa條件下，減壓蒸餾回收乙醇，得到干燥根皮苷提取物產(chǎn)品。通過(guò)HPLC檢測(cè)，采用面積歸一法分析，根皮苷的純度為40.4％。實(shí)施例4、雙水相萃取蘋果渣中的根皮苷(1)取10個(gè)蘋果，洗凈，除去果柄和萼片，切成小塊，榨汁機(jī)榨汁，8層紗布過(guò)濾，濾渣為蘋果皮渣。(2)稱取20g蘋果渣，粉碎機(jī)粉碎勻漿，加入體積濃度為60％的乙醇的水溶液400mL，攪拌提取3h。(3)收集上一步的提取液，減壓過(guò)濾后，收集澄清的上清液。(4)在上一步過(guò)濾獲得的上清液中，加入130mL質(zhì)量體積濃度為0.43g/mL的硫酸銨水溶液，形成雙水相體系，其中，乙醇體積濃度為45％，硫酸銨的質(zhì)量體積濃度為0.12g/mL，充分?jǐn)嚢栎腿?5min，靜置分層后，收集上相乙醇相，在溫度45℃，真空度0.085MPa條件下，減壓蒸餾回收乙醇，得到干燥根皮苷提取物產(chǎn)品。通過(guò)HPLC檢測(cè)，采用面積歸一法分析，根皮苷的純度為41.3％。