本發(fā)明屬于熒光染料技術領域，具體涉及一種含薁基團的α-腈基苯乙烯衍生物的多通道發(fā)光的熒光探針，以及該類化合物的制備方法，和該類化合物的應用。

背景技術：

由于熒光分析有高的靈敏度和選擇性，近年來在醫(yī)學檢驗、藥物分析、環(huán)境檢測等方面有廣泛的應用（thomas,j.a.,chem.soc.rev.,2015,44,4494）。傳統(tǒng)的熒光分子探針有特定的激發(fā)和發(fā)射波長，單一熒光探針不能根據(jù)樣品實際需要的激發(fā)和發(fā)射進行波長的變化，極大的限制了在實際中的應用。而多通道發(fā)光的熒光探針可以在根據(jù)樣品性質靈活的選擇不同的激發(fā)波長，同時采集不同的發(fā)射區(qū)間，在實際樣品分析中有很大的優(yōu)勢。

薁是一種非常好的ph響應性化合物，在中性環(huán)境中，薁的發(fā)光是違反kasha規(guī)則的，它幾乎沒有s1-s0的發(fā)光，只有s2-s0的發(fā)光（murai,m.,etal.chem.sci.2014,5,3753.）。當被質子化后，薁的熒光發(fā)射有明顯的增強，同時出現(xiàn)明顯的紅移現(xiàn)象，當原位加入堿中和體系中的酸之后，熒光發(fā)射又恢復到中性的狀態(tài)，酸和堿像開關一樣調控著含薁化合物的發(fā)光情況，這個過程可以反復多次，且熒光強度沒有明顯的衰減。但是目前基于薁結構的熒光探針方面研究仍然較少。

α-腈基二苯乙烯結構中，雙鍵是重要的光敏基團，可以由光照調控其順反異構的變化，這一性質可以用于分子開關、光敏調控等體系（zhu,l.,etal.j.am.chem.soc.2013,135,5175-5182.）。但目前對α-腈基二苯乙烯的研究主要集中在“聚集誘導發(fā)光”方面，還沒有多通道可控發(fā)光的報道。

上轉換發(fā)光即反-斯托克斯發(fā)光，是由波長長頻率低的光激發(fā)出波長短頻率高的光。具有上轉換發(fā)光性質的材料可以將紅外光轉變?yōu)榭梢姽?。近年來，這類材料在激光技術、光纖通訊技術、光信息存儲等領域都有較多的應用。但是目前針對此領域的研究主要集中在稀土化合物，此類化合物發(fā)光效率低，毒性較大，不適合應用于生物體系。本發(fā)明所報導的是一類具有上轉換發(fā)光性質的有機小分子，其結構簡單，發(fā)光性質良好，適用于生物成像及其他檢測領域，有良好的應用前景。

綜合以上研究背景，開發(fā)一種能針對不同外界刺激產生不同熒光信號的多通道發(fā)光的新型熒光探針，具有重要的意義，這類熒光探針將在分析檢測、細胞標記、智能材料方面有重要作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種能針對不同外界刺激產生不同熒光信號的多通道發(fā)光的熒光探針及其制備方法和應用。

本發(fā)明首先設計、合成一種含薁-腈基苯乙烯的衍生物；然后將其直接溶于有機溶劑中，通過調整激發(fā)波長和溶液ph，能夠出現(xiàn)可見、近紅外和上轉換三種發(fā)光模式，可以作為一種多通道發(fā)光檢測的熒光探針；在體系與酸作用后，出現(xiàn)新的近紅外熒光發(fā)射譜帶，在體系與堿作用后，紫外吸收有明顯的變化，根據(jù)這些性質，這類化合物可以作為一種良好的ph探針。

本發(fā)明采用如下技術方案，利用薁作為對酸響應的活性位點，α-腈基苯乙烯作為對光照刺激響應的基團，聯(lián)合兩者不同的性質，實現(xiàn)了多通道可控熒光發(fā)射和靈敏的ph響應。

相對于現(xiàn)有的熒光探針，本發(fā)明所提供的3-薁基-2-苯基丙烯腈衍生物具有合成簡單、功能多樣的優(yōu)點。解決了現(xiàn)有技術中探針發(fā)光單一、成本較高、合成路線復雜的技術問題。

本發(fā)明提供的多通道發(fā)光的熒光探針，為3-薁基-2-苯基丙烯腈衍生物，其結構式如通式i所示，

通式i

其中，r為羥基、1-8個碳原子的烷氧基、硝基或氨基。

進一步的，r為羥基、4-6個碳原子的烷氧基、硝基或氨基。

進一步的，r為羥基、4個碳原子的烷氧基、硝基或氨基。

上述化合物具有多種發(fā)光性質，經(jīng)過酸或光照作用后熒光均有明顯的增強，具有上轉換、近紅外和可見三種發(fā)光狀態(tài)，可作為一類優(yōu)良的多通道檢測熒光探針，用于水體、土壤及生物體內的熒光標記或熒光檢測。

本發(fā)明還提供上述熒光探針的制備方法，其合成路線如下所示：

。

具體步驟如下：

（a）制備3-(6-薁基)-2-(4-取代苯基)丙烯腈：在氮氣保護下，將1，8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯加入到6-薁甲醛（即化合物2）和4-取代苯乙腈（即化合物3）的吡啶溶液中，在回流條件下反應8-12小時，得到縮合產物3-(6-薁基)-2-(4-取代苯基)丙烯腈（式i所示化合物）；

（b）制備3-(6-薁基)-2-(4-正丁氧基苯基)丙烯腈：在氮氣保護下，將3-(6-薁基)-2-(4-羥基苯基)丙烯腈溶于干燥的丙酮中，加入碳酸鉀和溴代正丁烷，在25-80℃下反應4-20小時，得到3-(6-薁基)-2-(4-正丁氧基苯基)丙烯腈；

（c）制備3-(6-薁基)-2-(4-氨基苯基)丙烯腈：在氮氣保護下，將3-(6-薁基)-2-(4-硝基苯基)丙烯腈溶于乙醇中，加入氯化亞錫，在25-80℃下反應0.5-10小時，得到3-(6-薁基)-2-(4-氨基苯基)丙烯腈。

進一步：

在步驟（a）中，在一個反應容器中，加入6-薁甲醛和4-取代苯乙腈，氮氣保護下，加入1，8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯，注入干燥的吡啶，6-薁甲醛和吡啶的摩爾體積比為0.8~1.2mmol：10~30ml，6-薁甲醛、4-取代苯乙腈、1，8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯的摩爾比為0.8~1.2mmol：0.8~2mmol：0.8~2mmol，在80-100℃下攪拌反應2-12小時，真空濃縮，柱層析分離，得3-(6-薁基)-2-(4-取代苯基)丙烯腈。

在步驟（b）中，碳酸鉀與溴代烷和3-(6-薁基)-2-(4-取代苯基)丙烯腈(化合物i-1)的摩爾質量比為1-4mmol：1-50mmol：1-2mmol。

在步驟（c）中，氯化亞錫與3-(6-薁基)-2-(4-硝基苯基)(化合物i-3)的摩爾質量比為1-20mmol：1-2mmol。

上述通式i的化合物，包含了化合物i-1、i-2,、i-3、i-4四個結構；其中，化合物i-1和化合物i-3直接由步驟（a）得到，化合物i-2和化合物i-4分別通過由化合物i-1和i-3再進行一步反應得到?；衔飅-2和i-4在后面進行了具體發(fā)光性質的實驗。

本發(fā)明所述的熒光探針可用于上轉換發(fā)光，即通式i化合物在溶液中以633nm波長激發(fā)，在490nm處出現(xiàn)上轉換發(fā)光。

本發(fā)明所述含氰基的薁-苯乙烯的化合物可以用于檢測氫離子，該化合物可與氫離子反應生成具有通式ii結構的化合物，導致熒光改變，從而檢測氫離子：

通式ii

通式ii中，r與通式i表示的化合物中的r相同。

所述通式i結構的化合物用于檢測氫離子的工序如下：

（1）將通式i結構的化合物與氫離子反應；

（2）測定由上述工序中的反應引起的體系熒光變化。

本發(fā)明所述的化合物可用于水體、土壤或生物體系中的檢測。

附圖說明

圖1.本發(fā)明提供的多通道熒光探針應用的原理示意圖。

圖2.0.5μmol/l化合物i-2的上轉換發(fā)光圖譜，用633nm的激光激發(fā)，可以在490nm處產生上轉換熒光發(fā)光，溶液體系為三氯甲烷，橫坐標為波長，縱坐標為吸光度。

圖3.0.5μmol/l化合物i-2在以254nm的紫外光照10min后，以365nm的紫外光激發(fā)，在480nm處的熒光發(fā)射有明顯增強，溶液體系為三氯甲烷，橫坐標為波長，縱坐標為吸光度。

圖4.0.5μmol/l化合物i-2在加入0.5mol/l的三氟乙酸后，用520nm波長的光激發(fā)，在630nm處有很強的熒光發(fā)射，溶液體系為三氯甲烷，橫坐標為波長，縱坐標為熒光強度值。

圖5.0.5μmol/l化合物i-4在加入0.05mol/l的三氟乙酸后，用365nm的紫外光激發(fā)，發(fā)射波長從485nm藍移至440nm，同時熒光強度增強。溶液體系為三氯甲烷，橫坐標為波長，縱坐標為熒光強度值。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述，其目的僅在于更好地理解本發(fā)明的內容。因此，所舉之例并不限制本發(fā)明的保護范圍。

下列實施例中所說的室溫是：25-28℃；所用原料及試劑均未市售品。

實施例1

（1）化合物i-1的合成

在50ml的圓底燒瓶中加入6-醛基薁（1mmol）和5ml吡啶，隨后加入乙?；?4-羥基苯乙腈(1.2mmol)、1，8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯(1.2mmol)，在氮氣保護下100℃反應12小時。反應結束后加入適量二氯甲烷稀釋，倒入稀鹽酸中，用二氯甲烷萃取三次（15ml×3），合并有機層，用飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥。真空濃縮后經(jīng)柱層析分離純化，以石油醚：乙酸乙酯=5：1（v/v）為洗脫劑，得綠色粉末狀固體2，產率70%。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)：8.38(d,j=10.6hz,2h),7.97(t,j=3.8hz,1h),7.66–7.64(m,1h),7.64–7.61(m,2h),7.58(d,j=10.5hz,2h),7.43(d,j=3.7hz,2h),6.96–6.91(m,2h).hrmsm/z:[m+h]⁺calcd.forc19h13no,272.1070;found,272.1359.；

（2）化合物i-2的合成

在50ml的圓底燒瓶中加入20ml丙酮、化合物2、碳酸鉀和1-溴正丁烷，在氮氣保護下回流8小時，過濾，濾液真空濃縮后經(jīng)柱層析分離純化，以石油醚：乙酸乙酯=10：1（v/v）為洗脫劑，得綠色粉末狀固體i-2，產率95%。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)：8.38(d,j=10.6hz,2h),7.96(t,j=3.7hz,1h),7.68–7.63(m,3h),7.58(d,j=10.5hz,2h),7.43(d,j=3.7hz,2h),7.00–6.95(m,2h),4.03(t,j=6.5hz,2h),1.81(ddd,j=14.4,11.1,6.5hz,2h),1.55–1.48(m,2h),1.02–0.97(m,4h).hrmsm/z:[m+h]⁺calcd.forc23h21no,328.1696;found,328.1059.；

（3）化合物i-3的合成

在50ml的圓底燒瓶中加入10ml吡啶、6-醛基薁（1mmol）和4-硝基苯乙腈（1mmol），攪拌下滴入1，8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯，在氮氣保護下回流8小時，過濾，濾餅經(jīng)柱層析分離純化，以石油醚：乙酸乙酯=5：1（v/v）為洗脫劑，得棕色粉末狀固體i-3，產率80%。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)：8.42(d,j=10.6hz,2h),8.37–8.32(m,2h),8.04(t,j=3.7hz,1h),7.93–7.88(m,3h),7.63(d,j=10.4hz,2h),7.49(d,j=3.7hz,2h).hrmsm/z:[m+h]⁺calcd.forc19h12n2o2,301.0972;found,301.0719.；

（4）化合物i-4的合成

在50ml的圓底燒瓶中加入20ml無水乙醇、化合物i-3和氯化亞錫，在氮氣保護下回流4小時，反應完畢后倒入飽和碳酸氫鈉中，劇烈攪拌30min，過濾，濾液用二氯甲烷萃取三次（3×20ml），合并有機相，經(jīng)干燥后，真空濃縮后經(jīng)柱層析分離純化，以石油醚：乙酸乙酯=5：1（v/v）為洗脫劑，得墨綠色粉末狀固體i-4，產率75%。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ(ppm)：8.37(d,j=10.6hz,2h),7.94(t,j=3.7hz,1h),7.61–7.52(m,5h),7.41(d,j=3.7hz,2h),6.77–6.71(m,2h),3.95(s,2h).hrmsm/z:[m+h]⁺calcd.forc19h14n2,271.1230;found,271.0725.。

實施例2

（1）化合物i-2的性質測試

將上述所得化合物i-2溶解于三氯甲烷中，配置成0.5μmol/l的溶液。將2ml溶液加入到1cm×1cm×4cm的帶塞比色皿中，測試其上轉換發(fā)光光譜，λex=633nm，結果如圖2所示，化合物i-2在490nm處有很強的上轉換發(fā)光。測試上述溶的下轉換發(fā)光光譜，λex=365nm，，結果如圖3所示，化合物i-2在480nm處有很強的熒光發(fā)射。在化合物i-2的三氯甲烷溶液中加入一定量的三氟乙酸均勻混合1分鐘后，測試化合物i-2的熒光發(fā)射光譜，λex=520nm，結果如圖4所示，由于三氟乙酸的加入，溶液在630nm處出現(xiàn)了很強的熒光發(fā)射；

（2）化合物i-4的性質測試

將上述所得化合物i-4溶解于三氯甲烷中，配置成0.5μmol/l的溶液。將2ml溶液加入到1cm×1cm×4cm的帶塞比色皿中，然后用微量注射器分別加入一定體積的三氟乙酸后均勻混合1分鐘后，測試化合物i-3的熒光發(fā)射光譜，λex=365nm，結果如圖5所示，由于三氟乙酸的加入，溶液的熒光發(fā)射從485nm藍移至440nm，同時熒光強度增強。