本發(fā)明涉及新型的分泌信號(hào)、含有該分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒、包含用該質(zhì)粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的厭氧菌的基因遞送載體、含有該基因遞送載體的藥物組合物、以及利用了它們的缺血性疾病的診斷或治療方法。

背景技術(shù)：

近年，在惡性腫瘤的治療方法中，使用轉(zhuǎn)化厭氧菌作為基因遞送載體的方法受到關(guān)注，例如提出了使用進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的梭菌屬，向腫瘤部位遞送將抗腫瘤物質(zhì)的前藥轉(zhuǎn)換為抗腫瘤物質(zhì)的酶的硝基還原酶的表達(dá)基因的方法等(參照專利文獻(xiàn)1～3)。

但是，以往為了這些目的而使用的微生物都為將病原性的細(xì)菌突變化為低毒性而成的，不能否定進(jìn)行回復(fù)突變化而回復(fù)為原來(lái)的病原性菌、發(fā)揮有害性的可能性，進(jìn)而，由于運(yùn)動(dòng)性、侵襲性，存在不僅在疾病組織而且在正常組織也表現(xiàn)出作用而產(chǎn)生全身性的副作用癥狀的情況等，在安全性方面有可能存在問(wèn)題。

因此，已知為存在于人的腸內(nèi)、形成菌群的非病原性的腸內(nèi)細(xì)菌中、極其安全的專性厭氧細(xì)菌的雙歧乳桿菌受到關(guān)注，開(kāi)發(fā)了以表達(dá)將抗腫瘤物質(zhì)的5-氟尿嘧啶的前藥的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)換為5-fu的酶的胞嘧啶·脫氨酶的方式進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的雙歧乳桿菌、以表達(dá)作為具有抗腫瘤性的蛋白質(zhì)的tnfα的方式進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的雙歧乳桿菌(參照專利文獻(xiàn)4～6)。

該轉(zhuǎn)化雙歧乳桿菌具有下述特點(diǎn)：在將其靜脈內(nèi)給予厭氧性的疾病的實(shí)體腫瘤動(dòng)物模型的情況下，在低氧狀態(tài)的厭氧的疾病組織特異性植活、增殖，在沒(méi)有處于厭氧的環(huán)境下的正常組織快速消失(參照非專利文獻(xiàn)1、2)。

另一方面，在缺血性疾病的治療、特別是重癥缺血的治療中，嘗試了想要通過(guò)使得血管生成、側(cè)支循環(huán)發(fā)達(dá)來(lái)恢復(fù)血流的血管生成療法。血管生成療法若大致區(qū)分則存在細(xì)胞移植、蛋白質(zhì)給藥和基因治療這三種治療方法，但是從低侵襲性的觀點(diǎn)考慮，近年特別是基因治療受到關(guān)注。利用基因治療實(shí)現(xiàn)的血管生成中，例如通過(guò)肌肉內(nèi)注射、動(dòng)脈內(nèi)注入將編碼有肝細(xì)胞增殖因子(hepatocytegrowthfactor：hgf)、血管內(nèi)皮增殖因子(vascularendothelialgrowthfactor：vegf)等的基因?qū)氲交疾扛浇?，促進(jìn)患部附近的血管生成，由此使得血流恢復(fù)(例如參照非專利文獻(xiàn)3、4)。

這些血管生成療法，作為對(duì)于由于小動(dòng)脈水平的障礙而不能實(shí)現(xiàn)血運(yùn)重建或者效果不充分的患者、由于侵襲性的問(wèn)題而不能進(jìn)行外科的治療的患者等的選擇項(xiàng)之一受到關(guān)注，特別是關(guān)于利用基因治療的血管生成療法，近年進(jìn)行了很多臨床試驗(yàn)。

但是，以往的利用了基因治療的血管生成療法，由于沒(méi)有病變部位特異性，適用時(shí)仍然需要解決很多問(wèn)題，這些問(wèn)題如下所述：不能進(jìn)行全身給藥，與缺血部位相比非缺血部位中的血管生成得到促進(jìn)的偷竊現(xiàn)象令人擔(dān)憂，基因?qū)胄?、?dǎo)入基因的表達(dá)期間的控制是困難的，存在由于血管生成而癥狀有可能惡化的并發(fā)癥的情況下適用伴隨有大的危險(xiǎn)。

因此，本發(fā)明人等著眼于在厭氧的疾病組織特異性植活、增殖的厭氧菌，通過(guò)使用轉(zhuǎn)化雙歧乳桿菌，成功制作了僅特異性地集聚于缺血部位，在該缺血部位產(chǎn)生所希望的蛋白質(zhì)，治愈的同時(shí)由病變部位消失而不會(huì)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的基因遞送載體(專利文獻(xiàn)7)。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：美國(guó)專利第6416754號(hào)說(shuō)明書(shū)

專利文獻(xiàn)2：美國(guó)專利第6652849號(hào)說(shuō)明書(shū)

專利文獻(xiàn)3：美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2003/0103952號(hào)說(shuō)明書(shū)

專利文獻(xiàn)4：日本特開(kāi)2002-97144號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)5：國(guó)際公開(kāi)第2007/136107號(hào)

專利文獻(xiàn)6：國(guó)際公開(kāi)第2011/093465號(hào)

專利文獻(xiàn)7：國(guó)際公開(kāi)第2013/008881號(hào)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：yazawaetal.,cancergenetherapy,7(2):269-274,2000.非專利文獻(xiàn)2：yazawaetal.,breastcancerresearchandtreatment,66:165-170,2001.

非專利文獻(xiàn)3：guptaetal.,circ.res.,105:724-736,2009.

非專利文獻(xiàn)4：morishitaetal.,arteriosclerthrombvascbiol.,31:713-720,2011.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問(wèn)題

本發(fā)明的目的在于，提供能夠以目的蛋白質(zhì)的高效率穩(wěn)定地分泌表達(dá)的用于轉(zhuǎn)化厭氧菌的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒、包含用該質(zhì)粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的厭氧菌的基因遞送載體、含有該基因遞送載體的藥物組合物、以及利用了它們的缺血性疾病的診斷或治療方法。

用于解決問(wèn)題的方案

本發(fā)明人等在上述專利文獻(xiàn)7中報(bào)告了，制作整合了編碼有人fgf2的基因的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒pfgf12a，使用其進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的專性厭氧菌、例如長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105a/pfgf12a、短雙歧桿菌(bifidobacteriumbreve)jcm1192/pfgf12a等，通過(guò)全身給藥而僅在缺血性疾病部位特異性地集聚·生長(zhǎng)，在該缺血性疾病部位能夠表達(dá)·分泌人fgf2蛋白質(zhì)(專利文獻(xiàn)7)。

但是進(jìn)一步繼續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)下述新問(wèn)題：對(duì)于上述專利文獻(xiàn)7中主要使用的用轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pfgf12a進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的雙歧桿菌屬細(xì)菌而言，表達(dá)蛋白質(zhì)的分泌量不充分，另外分泌量也經(jīng)時(shí)地降低等，穩(wěn)定性欠缺。

因此，本發(fā)明人等為了解決該問(wèn)題而繼續(xù)深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)源自長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)的新型的分泌信號(hào)肽sp56及sp67，制作整合了編碼有這些信號(hào)肽的基因的質(zhì)粒，結(jié)果令人驚訝的是，用該質(zhì)粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的厭氧菌，與現(xiàn)有株相比，為蛋白質(zhì)分泌表達(dá)格外高，即使長(zhǎng)期培養(yǎng)也穩(wěn)定地分泌表達(dá)蛋白質(zhì)，即使反復(fù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)也表現(xiàn)出高的質(zhì)粒保持菌率的質(zhì)粒，進(jìn)一步繼續(xù)研究，結(jié)果完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容。

(1)一種轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其為厭氧菌的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其包含啟動(dòng)子單元，含有編碼有序列號(hào)1或序列號(hào)2所示的分泌信號(hào)肽的dna的分泌信號(hào)單元，和含有編碼有對(duì)于缺血性疾病的診斷或治療有用的蛋白質(zhì)的dna的目的基因單元。

(2)根據(jù)(1)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中，對(duì)于缺血性疾病的診斷或治療有用的蛋白質(zhì)為選自由成纖維細(xì)胞增殖因子(fgf)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子(ecgf)、血管內(nèi)皮增殖因子(vegf)、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖因子(hgf)、血管增殖因子(agf)、源自血小板的增殖因子(pdgf)、轉(zhuǎn)化增殖因子β(tgfβ)、促血管新生蛋白因子、蝶素(ephrin)等具有血管生成促進(jìn)活性的蛋白質(zhì)、前列腺素類等與血管擴(kuò)張相關(guān)的因子、粒細(xì)胞集落刺激因子(g-csf)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)等集落刺激因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(ngf)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(bdnf)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子(igf)、源自血小板的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子(pd-ecgf)組成的組中的一種。

(3)根據(jù)(1)或(2)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中，對(duì)于缺血性疾病的診斷或治療有用的蛋白質(zhì)為成纖維細(xì)胞增殖因子2(fgf2)。

(4)根據(jù)(1)～(3)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中，分泌信號(hào)單元還含有連接于編碼有序列號(hào)1或序列號(hào)2所示的分泌信號(hào)肽的dna的3’末端、編碼有間隔肽的dna。

(5)根據(jù)(4)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中，間隔肽以氨基酸長(zhǎng)度1～25、由序列號(hào)5或序列號(hào)6所示的氨基酸序列的n末端的氨基酸開(kāi)始的序列表示。

(6)根據(jù)(1)～(5)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中，分泌信號(hào)單元為編碼有序列號(hào)9或序列號(hào)10所示的氨基酸序列的dna。

(7)根據(jù)(1)～(6)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中，轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒為非穿梭質(zhì)粒。

(8)根據(jù)(1)～(7)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中，啟動(dòng)子單元中含有的啟動(dòng)子為序列號(hào)13所示的堿基序列或該堿基序列的一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或附加而成的序列。

(9)根據(jù)(1)～(8)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其中，轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒以pfgf110(序列號(hào)14)或pfgf111(序列號(hào)15)的堿基序列表示。

(10)一種基因遞送載體，其包含用(1)～(9)所述的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的厭氧菌。

(11)根據(jù)(10)所述的基因遞送載體，其中，厭氧菌為雙歧桿菌屬細(xì)菌。

(12)根據(jù)(11)所述的基因遞送載體，其中，雙歧桿菌屬細(xì)菌為長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)。

(13)一種藥物組合物，其含有(10)～(12)所述的基因遞送載體。

(14)根據(jù)(13)所述的藥物組合物，其中，藥物組合物還含有缺血性疾病部位中的基因遞送載體的植活·增殖促進(jìn)劑。

(15)根據(jù)(14)所述的藥物組合物，其中，植活·增殖促進(jìn)劑為選自由麥芽糖、乳果糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、蜜二糖、松三糖、蜜三糖組成的組中的至少一種。

(16)一種用于診斷或治療缺血性疾病的方法，其包括給予(10)～(12)所述的基因遞送載體。

(17)根據(jù)(16)所述的方法，其中，給藥為全身給藥。

發(fā)明的效果

本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒為具有新型的分泌信號(hào)的、對(duì)于用于診斷和/或治療缺血性疾病的轉(zhuǎn)化厭氧菌的制作有用的新型質(zhì)粒，通過(guò)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的厭氧菌能夠大量且穩(wěn)定地分泌目的蛋白質(zhì)。

而本發(fā)明的基因遞送載體由于包含用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的厭氧菌，即使全身給藥的情況下，也會(huì)在處于厭氧的環(huán)境下的缺血性疾病部位特異性地植活、增殖，可以在該疾病部位充分產(chǎn)生、分泌具有缺血性疾病的治療活性的蛋白質(zhì)。因此，作為基因遞送載體，進(jìn)而作為缺血性疾病治療劑是極其有用的。另外，由于在缺血性疾病部位特異性地植活，即使是靜脈注射等全身給藥，也會(huì)在缺血性疾病部位特異性地集聚而發(fā)揮效果。因此，無(wú)需大量給藥、多次給藥，可以降低給藥對(duì)象的負(fù)擔(dān)。進(jìn)而，缺血持續(xù)期間由于缺血性疾病部位的厭氧的環(huán)境得到維持而長(zhǎng)期生長(zhǎng)，而若一旦缺血緩解則已經(jīng)并非厭氧的環(huán)境，因此不能生長(zhǎng)而快速消失。

進(jìn)而，本發(fā)明的基因遞送載體由于基因遞送載體其本身能夠表達(dá)對(duì)于治療有用的蛋白質(zhì)，因此無(wú)需如以往那樣考慮到對(duì)缺血性部位或其附近的細(xì)胞的基因?qū)胄?，可以總是發(fā)揮高的蛋白質(zhì)表達(dá)效率。進(jìn)而，由于為特異性地遞送到缺血性部位的載體，并發(fā)癥的危險(xiǎn)性也小。因此，與以往相比能夠以進(jìn)一步低侵襲性實(shí)施副作用小、安全性高的血管生成治療。進(jìn)而，通過(guò)使得本發(fā)明的基因遞送載體同時(shí)表達(dá)標(biāo)記物，也能夠用于缺血性部位的診斷、處置的監(jiān)測(cè)。進(jìn)而，本發(fā)明的基因遞送載體能夠同時(shí)遞送多種基因，認(rèn)為通過(guò)整合給予多種有效的增殖因子，能夠更有效地且非侵襲地進(jìn)行治療。

附圖說(shuō)明

圖1表示關(guān)于人fgf2分泌穿梭質(zhì)粒的制作的示意圖。由pcd穿梭(shuttle)質(zhì)粒，用hfgf2(帶his標(biāo)簽)置換cd，制作pfgf-hu，進(jìn)而在啟動(dòng)子與hfgf2基因之間插入sp26l20，制作phusp26l20-fgf2，由此處去除his標(biāo)簽，制作phusp26l20-fgf2-dhis。

圖2表示關(guān)于人fgf2(帶標(biāo)簽)分泌穿梭質(zhì)粒的制作的示意圖。在直鏈化phu-fgf2片段插入sp56l20或sp67l20，分別制作phusp56l20-fgf2或phusp67l20-fgf2。

圖3表示關(guān)于人fgf2(沒(méi)有標(biāo)簽)分泌穿梭質(zhì)粒的制作的示意圖。在直鏈化phusp26l20-fgf2-dhis片段插入sp56l20或sp67l20，分別制作phusp56l20-fgf2-dhis或phusp67l20-fgf2-dhis。

圖4表示關(guān)于人fgf2(沒(méi)有標(biāo)簽)分泌非穿梭質(zhì)粒的制作的示意圖。由phusp56l20-fgf2-dhis和phusp67l20-fgf2-dhis分別去除pucori，制作pfgf110和pfgf111。

圖5表示fgf110株和fgf111株培養(yǎng)上清液的蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果。m：分子量標(biāo)記物、fgf110：fgf110株的培養(yǎng)上清液濃縮物、fgf111：fgf111株的培養(yǎng)上清液濃縮物、12a：fgf12a株的培養(yǎng)上清液濃縮物、r：重組人fgf2。對(duì)于fgf110株、fgf111株、fgf12a株，在與作為陽(yáng)性對(duì)象的重組體(分子量約17kda)相同的位置確認(rèn)了條帶。

圖6表示由sp56株和sp67株分泌的人fgf2蛋白質(zhì)的nih/3t3細(xì)胞增殖促進(jìn)活性?？v軸：表示450-630nm時(shí)的吸光度、橫軸：表示人fgf2濃度(ng/ml)。由sp56、sp67株分泌的人fgf2與rhfgf2同樣地具有濃度依存性的細(xì)胞增殖促進(jìn)活性。

圖7表示長(zhǎng)期培養(yǎng)時(shí)的人fgf2分泌量推移?？v軸：fgf2分泌量(ng/ml)、橫軸：培養(yǎng)時(shí)間。在2天、4天、7天中的任意一時(shí)點(diǎn)，fgf2分泌量由高到低的順序?yàn)閒gf110株、fgf111株、fgf12a株。fgf12a株的fgf2分泌量在培養(yǎng)第4天以后大幅降低，但是在fgf110株和fgf111株，直至最后為止觀察到穩(wěn)定的表達(dá)·分泌。

圖8表示fgf110的血流改善效果。縱軸：患側(cè)/健側(cè)血流比、橫軸：第2次手術(shù)后天數(shù)。在fgf110給藥組中，在14天以后，與pbs、be穿梭(shuttle)組相比表現(xiàn)出顯著的血流改善效果。該效果持續(xù)至36天為止。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明涉及源自雙歧桿菌屬菌的新型的分泌信號(hào)肽和編碼有該肽的分泌信號(hào)、含有該分泌信號(hào)的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒等。

以下對(duì)于本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

＜轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒＞

本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒的特征在于，通過(guò)新型的分泌信號(hào)單元的作用，能夠更穩(wěn)定地分泌更多的表達(dá)蛋白質(zhì)，因此通過(guò)使用上述轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，可以制作可以表達(dá)、以高效率分泌任意的目的蛋白質(zhì)的優(yōu)異的實(shí)用性高的進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的厭氧菌。

一方案中，本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，其為用于轉(zhuǎn)化厭氧菌的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，該轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒包含啟動(dòng)子單元，含有編碼有序列號(hào)1或序列號(hào)2所示的分泌信號(hào)肽的dna的分泌信號(hào)單元，和含有編碼有對(duì)于缺血性疾病的診斷或治療有用的蛋白質(zhì)(目的蛋白質(zhì))的dna的目的基因單元。

本說(shuō)明書(shū)中，“厭氧菌”指的是具有厭氧的性質(zhì)的細(xì)菌，“厭氧的性質(zhì)”指的是能夠在氧少或沒(méi)有的條件下生長(zhǎng)的性質(zhì)。通常厭氧菌可以分類為即使在氧的存在下也能夠生長(zhǎng)的兼性厭氧菌、和在氧的存在下不能生長(zhǎng)的專性厭氧菌，但是本發(fā)明的一方式中，優(yōu)選為例如雙歧桿菌屬菌等專性厭氧菌。本發(fā)明的厭氧菌所具有的厭氧的性質(zhì)可以為細(xì)菌天生所具有的性質(zhì)、也可以通過(guò)突變、轉(zhuǎn)化等突變化來(lái)得到。因此，本發(fā)明的一方式中，厭氧菌為以形成專性厭氧菌的方式突變化而成。例如即使為乳桿菌屬等兼性厭氧菌，若突變化為專性厭氧性即可。

優(yōu)選的方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化雙歧桿菌屬細(xì)菌，進(jìn)一步優(yōu)選的方式中，用于轉(zhuǎn)化長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)。

本說(shuō)明書(shū)中，“表達(dá)彈夾”指的是用于使得質(zhì)粒中含有的特定的蛋白質(zhì)或肽片段表達(dá)的基因組，該組含有啟動(dòng)子單元和目的基因單元，進(jìn)而可以任意含有其它的有用的單元。作為其它的有用的單元，可列舉出例如編碼有分泌信號(hào)等信號(hào)肽的基因、編碼有目的基因所編碼的蛋白質(zhì)的分子伴侶蛋白的基因等。

本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)中，“目的基因單元”指的是含有編碼有目的的蛋白質(zhì)(表達(dá)蛋白質(zhì))的基因的、與表達(dá)蛋白質(zhì)相關(guān)的基因組。目的基因單元，除了編碼有目的的蛋白質(zhì)的基因以外，還可以含有其它的dna。作為目的基因單元中能夠含有的其它的dna，雖然不限于此，但是可列舉出例如his-tag等編碼有標(biāo)記表達(dá)蛋白質(zhì)的肽的dna等。

本發(fā)明的質(zhì)粒，以使得通過(guò)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)在厭氧菌體中產(chǎn)生、釋放到菌體外而發(fā)揮治療效果的方式含有分泌信號(hào)單元。

本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)中，“分泌信號(hào)單元”指的是含有分泌信號(hào)序列的、編碼有用于將表達(dá)蛋白質(zhì)分泌到菌體外的氨基酸序列的基因組。本說(shuō)明書(shū)中，僅稱為“分泌信號(hào)”的情況下或者稱為“分泌信號(hào)序列”的情況下指的是編碼有分泌信號(hào)肽的基因或其dna序列。分泌信號(hào)單元，除了分泌信號(hào)序列之外例如還可以含有編碼有插入到目的基因與分泌信號(hào)序列之間的間隔肽的dna等其它的dna。

本發(fā)明的分泌信號(hào)單元中含有的分泌信號(hào)序列為編碼有sp56(序列號(hào)1)或sp67(序列號(hào)2)所示的新型的分泌信號(hào)肽的序列。需要說(shuō)明的是，對(duì)應(yīng)于序列號(hào)1和序列號(hào)2所示的分泌信號(hào)肽序列的分泌信號(hào)序列，除了分別以序列號(hào)3和序列號(hào)4表示的序列之外，還包括其簡(jiǎn)并序列。以下，本說(shuō)明書(shū)中，稱為“編碼有氨基酸序列的dna”或“對(duì)應(yīng)于氨基酸序列的堿基序列”等情況下，只要沒(méi)有特別記載，則除了作為例子示出的特定序列之外，還意圖包括其簡(jiǎn)并序列。

sp56(序列號(hào)1)或sp67(序列號(hào)2)所示的新型的分泌信號(hào)肽，為由長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)的注冊(cè)于基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的全部氨基酸序列，使用分泌信號(hào)肽預(yù)測(cè)程序抽出候補(bǔ)，由該候補(bǔ)之中進(jìn)一步選拔得到的分泌信號(hào)肽，通過(guò)本發(fā)明人等首次確認(rèn)為有用的分泌信號(hào)肽。

本發(fā)明的分泌信號(hào)肽sp56和sp67具有特別優(yōu)異的分泌活性，另外利用作為非病原性的專性厭氧菌的雙歧乳桿菌發(fā)揮功能，因此編碼有sp56和sp67的dna特別適用于厭氧的疾病、特別是缺血性疾病的診斷或治療用厭氧菌的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒。因此，另外含有編碼有sp56和sp67的dna的任意的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒也包含于本發(fā)明中。

一方式中，本發(fā)明的目的基因單元含有編碼有對(duì)于缺血性疾病的診斷或治療有用的蛋白質(zhì)的dna作為表達(dá)蛋白質(zhì)。

本說(shuō)明書(shū)中，“缺血”指的是由于血管的狹窄、閉塞而供給到組織的動(dòng)脈血量減少所導(dǎo)致的組織的氧·營(yíng)養(yǎng)缺乏狀態(tài)，持續(xù)性的缺血產(chǎn)生組織的萎縮、變性、壞死等。

本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒主要合適地用于血管生成治療、內(nèi)臟器官的保護(hù)等改善由于缺血而引起的不優(yōu)選的狀態(tài)的處置方法。因此，本說(shuō)明書(shū)中，“缺血性疾病”指的是無(wú)論自覺(jué)癥狀的有無(wú)，由于動(dòng)脈的狹窄、閉塞而組織的缺血持續(xù)的狀態(tài)或者由于上述缺血而引起的不優(yōu)選的狀態(tài)。作為缺血性疾病，雖然不限于此，但是可列舉出例如心絞痛、心肌梗塞等缺血性心疾病、腦梗塞等腦缺血疾病、煙霧病等慢性腦缺血疾病、脊髓缺血疾病、缺血性結(jié)腸炎、腸系膜動(dòng)脈閉塞癥等缺血性腸疾病、閉塞性動(dòng)脈硬化癥、伯格氏病等下肢缺血疾病、糖尿性視網(wǎng)膜病等視網(wǎng)膜缺血疾病等。

本說(shuō)明書(shū)中，“缺血性部位”指的是由于缺血而動(dòng)脈血量、營(yíng)養(yǎng)和氧減少的狀態(tài)的部位，與“缺血性疾病部位”或“缺血性疾病組織”互換使用。

作為對(duì)于缺血性疾病的診斷或治療有用的蛋白質(zhì)，雖然不限于此，但是可列舉出例如具有血管生成促進(jìn)活性的蛋白質(zhì)、與血管擴(kuò)張相關(guān)的蛋白質(zhì)等。作為具有血管生成促進(jìn)活性的蛋白質(zhì)，雖然不限于此，但是可列舉出例如成纖維細(xì)胞增殖因子(fgf)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子(ecgf)、血管內(nèi)皮增殖因子(vegf)、肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞增殖因子(hgf)、血管增殖因子(agf)、源自血小板的增殖因子(pdgf)、轉(zhuǎn)化增殖因子β(tgfβ)、促血管新生蛋白因子、蝶素(ephrin)等，作為與血管擴(kuò)張相關(guān)的因子，可列舉出前列腺素類等。作為其它的對(duì)于治療有用的蛋白質(zhì)，可列舉出集落刺激因子(例如粒細(xì)胞集落刺激因子(g-csf)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)等)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(ngf)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(bdnf)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(例如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3等)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(igf)、源自血小板的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子(pd-ecgf)等。作為對(duì)于缺血性疾病的診斷或治療有用的蛋白質(zhì)，特別優(yōu)選為成纖維細(xì)胞增殖因子2(fgf2)。

本發(fā)明中，“啟動(dòng)子單元”指的是含有啟動(dòng)子和任意其它的與轉(zhuǎn)錄控制相關(guān)的區(qū)域的單元，作為其它的與轉(zhuǎn)錄控制相關(guān)的區(qū)域，可列舉出例如操縱基因、終止子等。

本發(fā)明的啟動(dòng)子單元中含有的啟動(dòng)子若利用厭氧菌發(fā)揮功能則可以為任意的啟動(dòng)子，例如包括位于源自雙歧乳桿菌的分泌信號(hào)的上游的啟動(dòng)子或利用雙歧乳桿菌發(fā)揮功能的編碼有組朊樣dna結(jié)合蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子(hupromoter)等。一方式中，本發(fā)明的啟動(dòng)子單元中含有的啟動(dòng)子例如可以為hu啟動(dòng)子(序列號(hào)13)、p37啟動(dòng)子(序列號(hào)16)，優(yōu)選為hu啟動(dòng)子。本發(fā)明的啟動(dòng)子單元中含有的啟動(dòng)子，在不會(huì)失去作為啟動(dòng)子的功能的范圍內(nèi)，可以以其堿基序列的一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或附加而成的序列(功能的同等物)表示。

本發(fā)明的一方式中，啟動(dòng)子單元含有終止子。作為能夠含有的終止子，若利用雙歧乳桿菌發(fā)揮功能則可以為任意的終止子，但是優(yōu)選為利用雙歧乳桿菌發(fā)揮功能的編碼有組朊樣dna結(jié)合蛋白質(zhì)的基因的終止子(hu終止子)，特別是最優(yōu)選為以序列號(hào)38的堿基序列或者其一個(gè)或多個(gè)堿基缺失、置換或附加而成的序列所示的dna。

本發(fā)明的一方式中，分泌信號(hào)單元還含有連接于編碼有分泌信號(hào)肽的dna的3’末端、編碼有間隔肽的dna。

本說(shuō)明書(shū)中，“間隔肽”指的是插入到分泌信號(hào)肽與目的蛋白質(zhì)的n末端之間的肽。因此，編碼有間隔肽的dna形成表達(dá)彈夾中、存在于分泌信號(hào)的下游側(cè)且編碼有目的蛋白質(zhì)的基因的上游側(cè)的dna。

通過(guò)存在間隔肽，目的蛋白質(zhì)的分泌效率提高。因此優(yōu)選的一方式中，間隔肽為1～25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度、更優(yōu)選1～20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度、進(jìn)一步優(yōu)選5～20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。對(duì)于間隔肽的序列沒(méi)有特別限定，但是優(yōu)選的是，sp56的情況下，為序列號(hào)5所示的肽或含有其n末端的部分肽，sp67的情況下，為序列號(hào)6所示的肽或含有其n末端的部分肽。

序列號(hào)5及6分別為由在長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)中通過(guò)sp56和sp67分泌的蛋白質(zhì)的n末端～直至第25個(gè)氨基酸為止的序列構(gòu)成的肽。上述的優(yōu)選方式中，本發(fā)明的間隔肽，例如在sp56的情況下，可以為僅包含序列號(hào)5所示的肽的第1個(gè)氨基酸的1個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的部分序列、由序列號(hào)5的第1個(gè)氨基酸直至第15個(gè)氨基酸為止的15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的部分序列、由序列號(hào)5的第1個(gè)氨基酸直至第20個(gè)氨基酸為止的20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的部分序列、或者序列號(hào)5的25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的全部序列所示的肽等，在sp67的情況下，可以為僅包含序列號(hào)6所示的肽的第1個(gè)氨基酸的1個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的部分序列、由序列號(hào)6的第1個(gè)氨基酸直至第15個(gè)氨基酸為止的15個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的部分序列、由序列號(hào)6的第1個(gè)氨基酸直至第20個(gè)氨基酸為止的20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的部分序列、或者序列號(hào)6的25個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的全部序列所示的肽等。

需要說(shuō)明的是，對(duì)應(yīng)于序列號(hào)5和序列號(hào)6所示的氨基酸序列的堿基序列優(yōu)選分別以序列號(hào)7和序列號(hào)8表示。

本發(fā)明的更優(yōu)選的一方式中，分泌信號(hào)單元為編碼有包含sp56和20個(gè)氨基酸份的間隔肽的序列號(hào)9所示的氨基酸序列、或者包含sp67和20個(gè)氨基酸份的間隔肽的序列號(hào)10所示的氨基酸序列的dna。需要說(shuō)明的是，對(duì)應(yīng)于序列號(hào)9和序列號(hào)10所示的氨基酸序列的堿基序列優(yōu)選分別以序列號(hào)11和序列號(hào)12表示。

本發(fā)明的一方式中，作為轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，若包含啟動(dòng)子單元，含有編碼有序列號(hào)1或序列號(hào)2所示的分泌信號(hào)肽的dna的分泌信號(hào)單元，和含有編碼有對(duì)于缺血性疾病的診斷或治療有用的蛋白質(zhì)的dna的目的基因單元，為了轉(zhuǎn)化厭氧菌而發(fā)揮功能，不會(huì)損害該菌的厭氧的性質(zhì)，則能夠使用任意質(zhì)粒。但是，包含進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的厭氧菌的基因遞送載體形成藥物的情況下，轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒被水平轉(zhuǎn)移到例如大腸桿菌等體內(nèi)的其它細(xì)菌，通過(guò)水平轉(zhuǎn)移的其它細(xì)菌復(fù)制質(zhì)粒，其結(jié)果不能否定在沒(méi)有意圖的部位表達(dá)質(zhì)粒所編碼的蛋白質(zhì)的危險(xiǎn)性。因此，優(yōu)選的方式中，轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒為非穿梭質(zhì)粒。

本說(shuō)明書(shū)中，“穿梭質(zhì)?！敝傅氖悄軌蛟?種以上的不同宿主中復(fù)制的質(zhì)粒，與“穿梭載體質(zhì)?！被Q使用。因此，“非穿梭質(zhì)?！敝傅氖莾H在1種宿主中能夠復(fù)制的質(zhì)粒。即，在上述方式中，轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒僅具有利用轉(zhuǎn)化對(duì)象的厭氧菌發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)，不具有利用除此以外的菌發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)，為不能利用大腸桿菌等轉(zhuǎn)化厭氧菌以外的菌復(fù)制的質(zhì)粒。

本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)?？梢赃€含有其它的有用的基因。其它的有用的基因可列舉出例如抗壯觀霉素基因(spcm)等選擇標(biāo)記物基因、雙歧乳桿菌質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(ptb6)等復(fù)制起點(diǎn)、編碼有g(shù)fp等標(biāo)記蛋白質(zhì)的基因等。

優(yōu)選的方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒為pfgf110(序列號(hào)14)或pfgf111(序列號(hào)15)。

本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒例如可以如下所述制作。

例如根據(jù)通常的常規(guī)方法，向具有利用轉(zhuǎn)化菌和轉(zhuǎn)化菌以外的菌、例如雙歧乳桿菌和大腸桿菌分別發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)的穿梭質(zhì)粒插入至少一種的啟動(dòng)子單元、分泌信號(hào)單元、編碼有所希望的對(duì)于缺血性疾病的診斷或治療有用的蛋白質(zhì)的dna(目的基因單元)，由此可以制作穿梭質(zhì)粒。

接著根據(jù)需要，通過(guò)由該穿梭質(zhì)粒去除轉(zhuǎn)化菌以外的菌的復(fù)制起點(diǎn)，可以制作非穿梭質(zhì)粒。

需要說(shuō)明的是，上述各工序中的操作可以根據(jù)遺傳工程學(xué)領(lǐng)域的公知方法進(jìn)行。

＜基因遞送載體＞

一方案中，本發(fā)明涉及包含用上述本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的厭氧菌的基因遞送載體。

本發(fā)明的基因遞送載體為包含用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的上述厭氧菌的基因遞送載體，可以在處于厭氧的環(huán)境下的組織內(nèi)生長(zhǎng)并且可以表達(dá)·分泌具有目的的活性的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的基因遞送載體由于在缺血性疾病部位特異性地植活，因此目的蛋白質(zhì)必然地在缺血性疾病部位被特異性地表達(dá)·分泌。因此，可以表達(dá)用于缺血性疾病的診斷或治療的蛋白質(zhì)的本發(fā)明的基因遞送載體可以有效地診斷或處置缺血性疾病。

本發(fā)明的基因遞送載體由于在缺血性疾病部位特異性地植活，因此通過(guò)檢出該基因遞送載體的存在，能夠診斷缺血性疾病部位?；蜻f送載體的檢出例如可以通過(guò)標(biāo)記基因遞送載體來(lái)簡(jiǎn)便地進(jìn)行。從用于疾病的診斷的觀點(diǎn)考慮，檢出優(yōu)選侵襲性小，優(yōu)選由于標(biāo)記所導(dǎo)致的對(duì)生物體的不良影響小。因此，本發(fā)明的優(yōu)選方式中，基因遞送載體表達(dá)熒光蛋白質(zhì)作為對(duì)于診斷有用的蛋白質(zhì)。作為熒光蛋白質(zhì)，可列舉出各種綠色熒光蛋白質(zhì)(gfp)、紅色熒光蛋白質(zhì)(rfp)等。

本發(fā)明的基因遞送載體的前提在于對(duì)體內(nèi)給藥，因此需要所使用的厭氧菌不具有毒性或者毒性低。例如即使為梭菌屬、沙門氏菌屬等病原性的菌，若進(jìn)行了非病原性化則也可以用于本發(fā)明。因此，本發(fā)明的一方式中，本發(fā)明的厭氧菌可以將病原性的菌突變化為低毒性而得到。但是，突變化為低毒性的細(xì)菌有可能回復(fù)突變化而回復(fù)到原來(lái)的病原性菌、發(fā)揮有害性，因此優(yōu)選為天生非病原性的細(xì)菌。因此，本發(fā)明的優(yōu)選方式中，厭氧菌使用非病原性的腸內(nèi)細(xì)菌。

作為本發(fā)明中能夠使用的非病原性腸內(nèi)細(xì)菌，優(yōu)選列舉出雙歧桿菌屬菌(雙歧乳桿菌)。作為雙歧桿菌屬細(xì)菌，可列舉出例如青春雙岐桿菌(bifidobacteriumadolescentis)、角形雙歧桿菌(bifidobacteriumangulatum)、動(dòng)物雙岐桿菌(bifidobacteriumanimalis)、星狀雙歧桿菌(bifidobacteriumasteroides)、兩岐雙岐桿菌(bifidobacteriumbifidum)、牛雙歧桿菌(bifidobacteriumboum)、短雙歧桿菌(bifidobacteriumbreve)、鏈狀雙歧桿菌(bifidobacteriumcatenulatum)、豬雙歧桿菌(bifidobacteriumchoerinum)、棒狀雙歧桿菌(bifidobacteriumcoryneforme)、家兔雙歧桿菌(bifidobacteriumcuniculi)、齲齒雙歧桿菌(bifidobacteriumdenticolens)、齒雙歧桿菌(bifidobacteriumdentium)、沒(méi)食子雙歧桿菌(bifidobacteriumgallicum)、雞雙歧桿菌(bifidobacteriumgallinarum)、球雙歧桿菌(bifidobacteriumglobosum)、印度雙歧桿菌(bifidobacteriumindicum)、嬰兒雙岐桿菌(bifidobacteriuminfantis)、異形雙歧桿菌(bifidobacteriuminopinatum)、乳酸雙歧桿菌(bifidobacteriumlactis)、乳雙歧桿菌(bifidobacteriumlactentis)、游離雙歧桿菌(bifidobacteriumliberorum)、長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)、大雙歧桿菌(bifidobacteriummagnum)、瘤胃雙歧桿菌(bifidobacteriummerycicum)、最小雙歧桿菌(bifidobacteriumminimum)、(bifidobacteriummongoliens)、微小粒雙歧桿菌(bifidobacteriumparvulorum)、假鏈狀雙歧桿菌(bifidobacteriumpseudocatenulatum)、假長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumpseudolongum)、嗜冷雙歧桿菌(bifidobacteriumpsychraerophilum)、小雞雙歧桿菌(bifidobacteriumpullorum)、反芻動(dòng)物雙岐桿菌(bifidobacteriumruminale)、反芻雙歧桿菌(bifidobacteriumruminantium)、世紀(jì)雙歧桿菌(bifidobacteriumsaeculare)、史卡杜維雙歧桿菌(bifidobacteriumscardovii)、細(xì)長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumsubtile)、豬雙歧桿菌(bifidobacteriumsuis)、薩瑪茨德胡拉姆雙歧桿菌(bifidobacteriumthermacidophilum)、嗜熱雙歧桿菌(bifidobacteriumthermophilum)等，最優(yōu)選為長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)。

這些菌都為市售品或者可以由保藏組織容易地獲得。例如長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)atcc-15707、兩岐雙岐桿菌(bifidobacteriumbifidum)atcc-11863、嬰兒雙岐桿菌(bifidobacteriuminfantis)atcc-15697等可以由美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(atcc、theamericantypeculturecollection)容易地獲得。

另外，對(duì)于各菌的株也沒(méi)有特別限定，例如對(duì)于長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)的株，可列舉出長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105-a株、長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)ae-194b株、長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)bs-601株、長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)m101-2株，其中，優(yōu)選為長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105-a株。

對(duì)于短雙歧桿菌(bifidobacteriumbreve)的株，可列舉出例如短雙歧桿菌(bifidobacteriumbreve)標(biāo)準(zhǔn)株(jcm1192)、短雙歧桿菌(bifidobacteriumbreve)as-1株、短雙歧桿菌(bifidobacteriumbreve)i-53-8w株，其中，優(yōu)選為短雙歧桿菌(bifidobacteriumbreve)標(biāo)準(zhǔn)株、短雙歧桿菌(bifidobacteriumbreve)as-1株。

對(duì)于嬰兒雙岐桿菌(bifidobacteriuminfantis)的株，可列舉出例如嬰兒雙岐桿菌(bifidobacteriuminfantis)標(biāo)準(zhǔn)株(jcm1222)、嬰兒雙岐桿菌(bifidobacteriuminfantis)i-10-5株，其中，優(yōu)選為嬰兒雙岐桿菌(bifidobacteriuminfantis)標(biāo)準(zhǔn)株、嬰兒雙岐桿菌(bifidobacteriuminfantis)i-10-5株。

另外，對(duì)于乳雙歧桿菌(bifidobacteriumlactentis)的株，可列舉出例如乳雙歧桿菌(bifidobacteriumlactentis)標(biāo)準(zhǔn)株(jcm1220)。

本發(fā)明的基因遞送載體，可以通過(guò)使用上述本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，根據(jù)遺傳工程學(xué)領(lǐng)域的公知方法將進(jìn)行轉(zhuǎn)化的任意的厭氧菌轉(zhuǎn)化來(lái)制作。

本發(fā)明的基因遞送載體的制作，可以根據(jù)市售的實(shí)驗(yàn)書(shū)例如遺傳子マニュアル(講談社)、高木康敬編遺傳子操作實(shí)驗(yàn)法(講談社)、molecularcloningcoldspringharborlaboratory(1982)、molecularc1oning,2nded.coldspringharborlaboratory(1989)、methodsinenzymol.,194(1991)等中記載的方法進(jìn)行。

＜藥物組合物＞一方案中，本發(fā)明涉及含有上述本發(fā)明的基因遞送載體的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物，只要含有本發(fā)明的基因遞送載體則沒(méi)有特別限制。本發(fā)明的基因遞送載體含有至少一種即可，也可以含有兩種以上。進(jìn)而，本發(fā)明的藥物組合物可以與含有本發(fā)明的基因遞送載體以外的表現(xiàn)出缺血性疾病治療效果的化合物的藥物組合物、缺血性疾病治療劑組合來(lái)使用。

另外，本發(fā)明的藥物組合物只要不會(huì)阻礙本發(fā)明效果則除了本發(fā)明的基因遞送載體之外還可以含有任意的成分。作為這種任意成分，可列舉出例如可藥用的載體、賦形劑、稀釋劑、基因遞送載體的植活·增殖促進(jìn)劑等。作為植活·增殖促進(jìn)劑，雖然不限定于此，但是可列舉出例如麥芽糖、乳果糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、蜜二糖、松三糖、蜜三糖等本發(fā)明的基因遞送載體中使用的轉(zhuǎn)化菌能夠滋生的糖等。

對(duì)于本發(fā)明的藥物組合物的劑型沒(méi)有特別限制，可列舉出例如含有本發(fā)明的基因遞送載體的液體制劑或固體制劑。液體制劑可以通過(guò)將本發(fā)明的基因遞送載體的厭氧菌的培養(yǎng)液純化，向其中根據(jù)需要加入適當(dāng)?shù)纳睇}水或補(bǔ)液或者藥物添加物，并填充于安瓿或小瓶等來(lái)制造。另外，固體制劑可以通過(guò)向液體制劑添加適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑，填充于安瓿或小瓶等后進(jìn)行冷凍干燥或l干燥，或者向液體制劑添加適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑，進(jìn)行冷凍干燥或l干燥后，將其填充于安瓿或小瓶等來(lái)制造。

作為本發(fā)明的藥物組合物的給藥方法，經(jīng)口給藥、非經(jīng)口給藥都能夠?qū)嵤莾?yōu)選為非經(jīng)口給藥，例如可以進(jìn)行靜脈注射、皮下注射、局部注入、腦室內(nèi)給藥等，最優(yōu)選為靜脈注射、即全身給藥。

本發(fā)明的藥物組合物的基因遞送載體的給藥量，只要為對(duì)于在疾病部位可以生長(zhǎng)并且表達(dá)有效治療量的活性蛋白質(zhì)而言充分的量則沒(méi)有特別限制，但是從經(jīng)濟(jì)上的觀點(diǎn)和盡可能避免副作用的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選在得到必要的治療效果的范圍內(nèi)盡可能少。

本發(fā)明的藥物組合物中的基因遞送載體的給藥量根據(jù)疾病的程度、患者的體重、年齡、性別適當(dāng)選擇，可以根據(jù)改善的程度適當(dāng)增減。

例如，使用本發(fā)明的藥物組合物時(shí)，根據(jù)所使用的厭氧菌的菌自身所示出的疾病治療活性、所使用的厭氧菌所產(chǎn)生的具有疾病治療活性的蛋白質(zhì)等種類、和所使用的厭氧菌的該活性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生量等適當(dāng)設(shè)定。

具體而言，例如靜脈內(nèi)給藥的情況下，特別是要求降低由于菌塊所導(dǎo)致的栓塞等危險(xiǎn)，因此優(yōu)選將盡可能低濃度的注射用制劑分為多次來(lái)分注或者用適當(dāng)?shù)难a(bǔ)液稀釋來(lái)持續(xù)注入。例如成人的情況下，對(duì)于本發(fā)明的厭氧菌的菌體每1kg體重將10⁶～10¹²cfu分為1天1次～多次、1天～多天連續(xù)或者適當(dāng)隔著間隔給藥。更具體而言，對(duì)于含有本發(fā)明的雙歧乳桿菌的菌體10⁴～10¹⁰cfu/ml的制劑每1人成人將1～1000ml直接或者用適當(dāng)?shù)难a(bǔ)液稀釋、分為1天1次～數(shù)次、連續(xù)給藥1天～數(shù)天。

另外，對(duì)疾病組織直接給藥的局部給藥的情況下，要求菌盡可能對(duì)全部疾病組織植活、增殖，因此優(yōu)選將高濃度的注射劑給予到疾病組織的多個(gè)部位。例如成人的情況下，對(duì)于本發(fā)明的雙歧乳桿菌的菌體每1kg體重將10⁶～10¹²cfu1天1次～多次、根據(jù)需要1天～多天連續(xù)或者適當(dāng)隔著間隔給藥。更具體而言，對(duì)于含有本發(fā)明的雙歧乳桿菌的菌體10⁴～10¹⁰cfu/ml的制劑每1人成人將1～1000ml直接、1天數(shù)次根據(jù)需要1天～數(shù)天連續(xù)給藥。

確認(rèn)了治療期間中疾病組織中的菌消失的情況下，暫時(shí)中斷治療，與上述同樣地給予菌。

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中的“x和y組合而成”中包括x和y形成不同的形態(tài)的情況、x和y形成相同的形態(tài)(例如含有x和y的形態(tài))的情況中的任意一種情況。另外，x和y形成不同的形態(tài)的情況也包括x、y都還含有其它成分的情況。

本發(fā)明的基因遞送載體在缺血性疾病部位特異性地植活、增殖，在沒(méi)有處于厭氧的環(huán)境下的正常組織中不會(huì)增殖。因此，即使并非目的在于缺血性疾病部位的局部給藥、也將基因特異性地遞送到疾病部位。因此，從給藥的簡(jiǎn)便、侵襲性低等觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選本發(fā)明的藥物組合物全身給藥。

＜診斷方法或治療方法＞

一方案中，本發(fā)明涉及一種用于診斷或治療缺血性疾病的方法，其包括給予前述的任意一種基因遞送載體。

通過(guò)使用本發(fā)明的基因遞送載體，能夠以高效率進(jìn)行安全性高的診斷或治療。

本發(fā)明的方法中，將本發(fā)明的基因遞送載體給予具有缺血性疾病的對(duì)象。作為給藥方法，經(jīng)口給藥、非經(jīng)口給藥都能夠?qū)嵤?，但是?yōu)選為非經(jīng)口給藥，例如可以進(jìn)行靜脈注射、皮下注射、局部注入、腦室內(nèi)給藥等，最優(yōu)選為靜脈注射、即全身給藥。

因此，本發(fā)明的方法的優(yōu)選方式中，將本發(fā)明的基因遞送載體全身給藥。本發(fā)明的基因遞送載體由于可以將基因特異性地遞送到缺血性疾病部位，因此即使不使用導(dǎo)管、肌肉內(nèi)注射等來(lái)對(duì)患部直接給藥，而是利用靜脈注射等進(jìn)行全身給藥的情況下，也可以在缺血性疾病部位特異性地植活、增殖而發(fā)揮效果。因此，能夠進(jìn)行即使與以往的治療方法相比侵襲性也非常低的治療。

實(shí)施例

以下通過(guò)參考例和實(shí)施例對(duì)于本發(fā)明進(jìn)行更具體說(shuō)明，但是本發(fā)明的技術(shù)范圍不被這些例示所限定。

實(shí)施例1：分泌信號(hào)肽的鑒定按照以下的步驟，鑒定分泌信號(hào)肽sp56和sp67。對(duì)于源自注冊(cè)于ncbi的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)的長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)ncc2705株的蛋白質(zhì)的全部氨基酸序列，利用預(yù)測(cè)分泌信號(hào)的有無(wú)的信號(hào)序列預(yù)測(cè)程序signalp4.1server(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/)進(jìn)行解析。通過(guò)該解析，對(duì)于預(yù)測(cè)在蛋白質(zhì)的n末端具有分泌信號(hào)肽序列的蛋白質(zhì)的一部分的氨基酸序列，利用推定跨膜區(qū)(tm)的程序tmhmmserverv.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/)進(jìn)行拓?fù)浞治?。由該拓?fù)浞治鼋Y(jié)果，選定推定在蛋白質(zhì)的n末端存在tm的蛋白質(zhì)。選定這些蛋白質(zhì)作為預(yù)想具有tm的源自長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)ncc2705株的分泌信號(hào)肽。對(duì)應(yīng)于所選定的分泌信號(hào)肽的氨基酸序列的長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105a株的氨基酸序列中，由各蛋白質(zhì)的氨基酸序列n末端直至通過(guò)signalp解析推定為蛋白酶切斷推定部位的氨基酸序列為止作為各分泌信號(hào)肽序列(sp56和sp67)。另外，間隔肽序列為由各信號(hào)序列的c末端連接的20個(gè)氨基酸殘基、將它們作為分泌信號(hào)單元。所使用的分泌信號(hào)單元的序列如以下所示。sp56和其間隔肽(序列號(hào)9)、sp67和其間隔肽(序列號(hào)10)。

實(shí)施例2：各種hfgf2分泌質(zhì)粒的制作

質(zhì)粒制作中使用的pcr用引物如表1所示。

[表1]

1.質(zhì)粒pfgf-hu的制作

(1)人fgf2-histag插入片段(插入片段1)的制造

含有編碼有在c末端融合組氨酸標(biāo)簽的人fgf2的dna的質(zhì)粒“hfgf2inpuc57”由genscript公司獲得。hfgf2的dna序列，為基于hfgf2(由genbankaccessionno.#nm_002006的aug開(kāi)始翻譯的約18kda的蛋白質(zhì))的氨基酸序列，將密碼子最合適化于雙歧乳桿菌用的人工dna序列(序列號(hào)31)。將該質(zhì)粒hfgf2inpuc571ng作為模板，使用fgf4引物(正向)和fgf3引物(反向)的引物組進(jìn)行pcr擴(kuò)增。引物序列，以插入片段和載體片段的末端15bp重復(fù)的方式設(shè)計(jì)。各引物濃度設(shè)為0.2μm、反應(yīng)容量設(shè)為50μl，使用primestarhs(premix)試劑盒(takarabioinc.)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。作為擴(kuò)增的程序，在98℃下10秒(變性反應(yīng))、在55℃下5秒(退火反應(yīng))、在72℃下30秒(延伸反應(yīng))，將此作為1次循環(huán)，進(jìn)行30次循環(huán)后，在72℃下進(jìn)行30秒追加延伸反應(yīng)，制造約0.5kbp的hfgf2-histag插入片段(插入片段1)。

(2)載體片段1的制造

將質(zhì)粒pcd穿梭(國(guó)際公開(kāi)號(hào)第2009/128272號(hào))(序列號(hào)32)1ng作為模板，使用fgf1引物(正向)和fgf2引物(反向)的引物組，與上述同樣地進(jìn)行pcr擴(kuò)增。但是，pcr的延伸反應(yīng)在72℃下設(shè)為4分鐘。載體片段1的長(zhǎng)度為約3.9kbp。

(3)in-fusion反應(yīng)

使用in-fusion(注冊(cè)商標(biāo))hdcloning試劑盒(takarabioinc.制)將上述制造的插入片段1和載體片段1連接。即，向微型管添加上述載體片段50ng和插入片段13ng，進(jìn)一步添加試劑盒內(nèi)的5×in-fusionhdenzymepremix2μl、cloningenhancer1μl，利用0.1×te緩沖液(1mmtris-hcl、0.1mmedta、ph7.5)將反應(yīng)液容量調(diào)整為10μl。將其在37℃下保溫15分鐘后，進(jìn)一步在50℃下保溫15分鐘。其它的步驟根據(jù)試劑盒的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，制造in-fusion反應(yīng)液1。

(4)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒pfgf-hu的dna序列確認(rèn)

使用上述in-fusion反應(yīng)液1，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行大腸桿菌top10感應(yīng)細(xì)胞(invitrogen)的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的菌懸浮液涂布于含有75μg/ml壯觀霉素的lb瓊脂培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)一晩。利用含有75μg/ml壯觀霉素的lb液體培養(yǎng)基將形成于上述瓊脂培養(yǎng)基上的大腸桿菌菌落在37℃下振蕩培養(yǎng)一晩，由此使用qiaprepspinminiprep試劑盒(qiagen公司制)抽提質(zhì)粒。為了確定所抽提的質(zhì)粒中的含有上述人fgf2表達(dá)彈夾的區(qū)域(5’-hu啟動(dòng)子-人fgf2蛋白質(zhì)-his標(biāo)簽-hu終止子-3’)的序列，使用bigdye(注冊(cè)商標(biāo))terminatorv3.1cyclesequencing試劑盒(appliedbiosystems公司制)進(jìn)行序列反應(yīng)。所抽提的質(zhì)粒命名為pfgf-hu。

2.質(zhì)粒phusp56l20-fgf2和phusp67l20-fgf2的制作

(1)sp56l20和sp67l20插入片段(插入片段2和3)的制造

將長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105-a株的基因組dna作為模板，使用表1中記載的sp56-ins＿f1引物(正向)和sp56-ins＿r1＿fgf引物(反向)的引物組，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。引物序列以插入片段和載體片段的末端15bp重復(fù)的方式設(shè)計(jì)。各引物濃度設(shè)為0.2μm、反應(yīng)容量設(shè)為20μl，使用primestarhs(premix)試劑盒(takarabioinc.)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。作為擴(kuò)增的程序，在98℃下10秒、在65℃下5秒、在72℃下20秒，將此作為1次循環(huán)，進(jìn)行30次循環(huán)后，在72℃下進(jìn)行30秒延伸反應(yīng)，制造約0.2kbp的sp56l20插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物(插入片段2)。

對(duì)于sp67l20插入片段(插入片段3)而言，作為pcr擴(kuò)增引物，使用sp67-ins＿f1引物(正向)和sp67-ins＿r1＿fgf引物，除此之外與上述同樣地制造。

(2)含有編碼有人fgf2蛋白質(zhì)的dna的載體片段2的制造

將質(zhì)粒pfgf-hu作為模板，使用表1記載的fgf35引物(正向)和huprom＿r引物(反向)的引物組，利用與上述插入片段的制造相同的方法進(jìn)行pcr擴(kuò)增。但是，pcr的反應(yīng)容量設(shè)為50μl。作為擴(kuò)增的程序，在98℃下10秒、在65℃下5秒、在72℃下4分鐘30秒，將此作為1次循環(huán)，進(jìn)行30次循環(huán)后，在72℃下進(jìn)行30秒延伸反應(yīng)，制造約4.3kbp的載體片段擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)于該pcr產(chǎn)物利用0.8％瓊脂糖凝膠(含有溴化乙錠)進(jìn)行電泳，利用uv照射的同時(shí)切出含有約4.3kbp的dna條帶的凝膠。由該凝膠使用qiaquickgelextractionkit(qiagen公司制)抽提dna，作為載體片段2(直鏈化phu-fgf2片段、序列號(hào)33)。

(3)in-fusion反應(yīng)

分別使用in-fusion(注冊(cè)商標(biāo))hdcloning試劑盒(takarabioinc.制)將上述制造的插入片段2或插入片段3和載體片段2連接。即，向微型管添加上述載體片段擴(kuò)增產(chǎn)物68ng和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物6.15ng(插入片段2的情況)或6.55ng(插入片段3的情況)，進(jìn)一步添加試劑盒內(nèi)的5×in-fusionhdenzymepremix2μl、cloningenhancer1μl，利用0.1×te緩沖液(1mmtris-hcl、0.1mmedta、ph7.5)將反應(yīng)液容量調(diào)整為10μl。將其在37℃下保溫15分鐘后，進(jìn)一步在50℃下保溫15分鐘。其它步驟根據(jù)試劑盒的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)制造in-fusion反應(yīng)液2。

(4)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化1和質(zhì)粒phusp56l20-fgf2以及phusp67l20-fgf2的dna序列確認(rèn)

使用上述in-fusion反應(yīng)液2，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行大腸桿菌hst16cr感應(yīng)細(xì)胞(takarabioinc.制)的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的菌懸浮液涂布于含有75μg/ml壯觀霉素的lb瓊脂培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)一晩。利用含有75μg/ml壯觀霉素的lb液體培養(yǎng)基將形成于上述瓊脂培養(yǎng)基上的大腸桿菌菌落在37℃下振蕩培養(yǎng)一晩，由此使用qiaprepspinminiprep試劑盒(qiagen公司制)抽提質(zhì)粒。所抽提的質(zhì)粒中的含有上述人fgf2分泌表達(dá)彈夾的區(qū)域(5’-hu啟動(dòng)子-sp56l20-人fgf2蛋白質(zhì)-his標(biāo)簽-hu終止子-3’)或(5’-hu啟動(dòng)子-sp67l20-人fgf2蛋白質(zhì)-his標(biāo)簽-hu終止子-3’)的序列與上述1.(4)同樣地進(jìn)行。所抽提的質(zhì)粒分別命名為phusp56l20-fgf2和phusp67l20-fgf2。各質(zhì)粒含有人fgf2分泌表達(dá)彈夾的區(qū)域的序列分別如序列號(hào)34及35所示。

3.質(zhì)粒phusp26l20-fgf2-dhis的制作

(1)sp26l20插入片段(插入片段4)的制造

將長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105a的基因組dna80ng作為模板，使用hu＿sp26＿f引物(正向)和fgf＿sp26l20＿r引物(反向)的引物組，與上述2.(1)同樣地進(jìn)行pcr擴(kuò)增。但是，pcr的延伸反應(yīng)，在72℃下14秒、pcr溶液量設(shè)為20μl。插入片段的長(zhǎng)度為約0.1kbp。

(2)in-fusion反應(yīng)

使用上述制造的插入片段4和載體片段2，與上述2.(3)同樣地進(jìn)行in-fusion反應(yīng)，制造in-fusion反應(yīng)液3。但是，in-fusion反應(yīng)中使用的載體量設(shè)為50ng、插入量設(shè)為4.2ng。

(3)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化2和質(zhì)粒phusp26l20-fgf2的dna序列確認(rèn)

使用上述in-fusion反應(yīng)液3，利用與上述1.(4)相同的方法，進(jìn)行大腸桿菌top10感應(yīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、由重組大腸桿菌抽提dna、含有人fgf2表達(dá)彈夾的區(qū)域(5’-hu啟動(dòng)子-sp26l20-人fgf2蛋白質(zhì)-his標(biāo)簽-hu終止子-3’)的序列確定。所抽提的質(zhì)粒命名為phusp26l20-fgf2。

(4)人fgf2插入片段(插入片段5)的制造

將質(zhì)粒phusp26l20-fgf21ng作為模板，使用fgf35引物(正向)和fgf-his＿r引物(反向)的引物組，與上述2.(1)同樣地進(jìn)行pcr擴(kuò)增。但是，pcr的退火溫度設(shè)為60℃、延伸反應(yīng)在72℃下設(shè)為35秒。插入片段的長(zhǎng)度為約0.5kbp。

(5)載體片段3的制造

將質(zhì)粒phusp26l20-fgf21ng作為模板，使用fgf-his＿f引物(正向)和fgf＿sp26l20＿r引物(反向)的引物組，與上述2.(2)同樣地進(jìn)行pcr擴(kuò)增。但是，pcr的退火溫度設(shè)為60℃、延伸反應(yīng)在72℃下設(shè)為4分鐘10秒。載體片段的長(zhǎng)度為約4kbp。

(6)in-fusion反應(yīng)

使用上述制造的插入片段5和載體片段3，與上述2.(3)同樣地進(jìn)行in-fusion反應(yīng)，制造in-fusion反應(yīng)液4。但是，in-fusion反應(yīng)中使用的載體量設(shè)為20ng、插入量設(shè)為4ng。

(7)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化3和質(zhì)粒phusp26l20-fgf2-dhis序列確認(rèn)

使用上述in-fusion反應(yīng)液4，利用與上述2.(4)相同的方法進(jìn)行大腸桿菌的轉(zhuǎn)化、由重組大腸桿菌抽提dna。使用所抽提的dna，進(jìn)行含有人fgf2表達(dá)彈夾的區(qū)域(5’-hu啟動(dòng)子-sp26l20-人fgf2蛋白質(zhì)-hu終止子-3’)的序列確定。所抽提的質(zhì)粒命名為phusp26l20-fgf2-dhis。

4.質(zhì)粒phusp56l20-fgf2-dhis和phusp67l20-fgf2-dhis的制作

(1)含有編碼有人fgf2蛋白質(zhì)的dna的載體片段4的制造

將質(zhì)粒phusp26l20-fgf2-dhis作為模板，除此之外利用與上述2.(2)相同的方法進(jìn)行pcr，制造載體片段4(直鏈化phusp26l20-fgf2-dhis片段、序列號(hào)36)。

(2)in-fusion反應(yīng)

對(duì)于上述制造的插入片段2或3(sp56或sp67)和載體片段4利用與上述2.(3)相同的方法進(jìn)行，制造in-fusion反應(yīng)液5。但是，載體量設(shè)為75ng。

(3)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化4和質(zhì)粒phusp56l20-fgf2-dhis以及phusp67l20-fgf2-dhis的dna序列確認(rèn)

根據(jù)與上述2.(4)相同的步驟，使用上述in-fusion反應(yīng)液5進(jìn)行上述大腸桿菌hst16cr感應(yīng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、由重組大腸桿菌抽提質(zhì)粒。所抽提的質(zhì)粒的全長(zhǎng)序列的確定根據(jù)同樣的步驟進(jìn)行。所抽提的質(zhì)粒命名為phusp56l20-fgf2-dhis和phusp67l20-fgf2-dhis。

5.質(zhì)粒pfgf110和pfgf111的制作

(1)由質(zhì)粒phusp56l20-fgf2-dhis和phusp67l20-fgf2-dhis去除pucori

上述質(zhì)粒phusp56l20-fgf2-dhis或phusp67l20-fgf2-dhis3μg利用限制性內(nèi)切酶bamhi(thermoscientific公司)和bglii(thermoscientific公司)消化，切斷為約0.7kbp的含有pucori的dna片段和除此之外的部分(約3.8kbp)的兩個(gè)片段。對(duì)于該反應(yīng)液利用0.8％瓊脂糖凝膠(含有溴化乙錠)進(jìn)行電泳，照射uv的同時(shí)切出含有約3.8kbp的dna條帶的凝膠。由該凝膠使用qiaquickgelextractionkit(qiagen公司制)抽提dna，它們分別作為直鏈化非穿梭質(zhì)粒pfgf110和pfgf111。

(2)非穿梭質(zhì)粒pfgf110和pfgf111的制作

上述直鏈化非穿梭質(zhì)粒的自身連接使用rapiddnaligationkit(thermoscientific公司)如下所述進(jìn)行。即，向上述直鏈化非穿梭質(zhì)粒400ng加入上述試劑盒隨附的5×rapidligationbuffer80μl、t4dnaligase8μl，利用0.1×te設(shè)為400μl。將其每80μl分注到5根微型管，22℃下反應(yīng)5分鐘，進(jìn)行自身連接反應(yīng)。將該反應(yīng)液匯總為一，根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行進(jìn)行proteinasek處理、接著進(jìn)行利用苯酚·氯仿進(jìn)行的除蛋白質(zhì)、氯仿抽提和醇沉淀。將進(jìn)行了醇沉淀的dna溶解于0.1×te，作為非穿梭質(zhì)粒pfgf110(序列號(hào)14)和pfgf111(序列號(hào)15)。

實(shí)施例3：重組雙歧乳桿菌的制作

(1)fgf110株和fgf111株的制作

使用上述制作的非穿梭質(zhì)粒pfgf110和pfgf111的dna溶液，通過(guò)電穿孔系統(tǒng)(genepulserii、bio-radlaboratories,inc.制)進(jìn)行長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105-a株的轉(zhuǎn)化。電擊(2kv、25μf、200ω)后，向小玻璃管(2mm間隙)即刻添加800μl的imr液體培養(yǎng)基和50μl的維生素c添加液(每100ml含有抗壞血酸35g、l-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物2g和碳酸鈉11g的溶液)的混合液，將其回收到滅菌過(guò)的2ml微型管。擰松該2ml管的蓋，與脫氧·二氧化碳產(chǎn)生劑(anaeropack(注冊(cè)商標(biāo))·kenki、mitsubishigaschemicalcompany,inc.制)一起裝入到密閉容器，利用設(shè)定于37℃的培養(yǎng)箱保溫3小時(shí)。

將保溫后的各菌懸浮液涂布于含有75μg/ml壯觀霉素的imr瓊脂培養(yǎng)基。將這些板與上述脫氧·二氧化碳產(chǎn)生劑一起裝入到密閉容器，利用設(shè)定于37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天。

形成于上述含有壯觀霉素的imr瓊脂培養(yǎng)基上的菌落中，利用質(zhì)粒pfgf110的轉(zhuǎn)化體作為長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105-a/pfgf110株(以下稱為fgf110株)、利用質(zhì)粒pfgf111的轉(zhuǎn)化體作為長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105-a/pfgf111株(以下稱為fgf111株)。

(2)sp56株和sp67株的制作

使用穿梭質(zhì)粒phusp56l20-fgf2和phusp67l20-fgf2，通過(guò)與上述(1)相同的方法，進(jìn)行長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105-a株的轉(zhuǎn)化，分別得到長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105-a/phusp56l20-fgf2株(以下稱為sp56株)、和長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105-a/phusp67l20-fgf2株(以下稱為sp67株)。

(3)陰性對(duì)照株的制作

使用作為載體骨架的wo2011/093467中記載的pbe穿梭(shuttle)(序列號(hào)37)，通過(guò)與上述(fgf110株和fgf111株的制作)相同的方法，進(jìn)行長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105-a株的轉(zhuǎn)化，得到長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105-a/pbe穿梭株(以下稱為be穿梭(shuttle)株)。

實(shí)施例4：表達(dá)蛋白質(zhì)的解析

(1)重組雙歧桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)

將上述fgf110株、fgf111株和專利文獻(xiàn)7(wo2013/008881)中記載的長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105a/pfgf12a株(以下稱為fgf12a株)接種于添加有壯觀霉素(終濃度75μg/ml)和維生素c添加液100μl的mrs(becton,dickinsonandcompany制)液體培養(yǎng)基10ml，在37℃下進(jìn)行24小時(shí)厭氧培養(yǎng)，作為活化培養(yǎng)液。接著，向dmem(catno.11885-084：lifetechnologiescorporation制):mrs以9:1的比率混合而成的培養(yǎng)基20ml添加維生素c添加液100μl、壯觀霉素75μg/ml，接種上述活化培養(yǎng)液100μl。將其在37℃下進(jìn)行15小時(shí)厭氧培養(yǎng)。

(2)樣品制造

對(duì)于上述重組雙歧乳桿菌培養(yǎng)液的上清液根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行三氯乙酸(tca)沉淀，利用1×sds樣品緩沖液再溶解。將其在95℃下進(jìn)行3分鐘加熱處理，供于蛋白質(zhì)印跡解析。

(3)蛋白質(zhì)印跡

對(duì)于上述各培養(yǎng)上清液濃縮物(相當(dāng)于培養(yǎng)上清液0.2ml)和作為陽(yáng)性對(duì)照的重組人fgf2(peprotech公司、分子量17.2kda)，利用mini-protean(注冊(cè)商標(biāo))tgx^tm凝膠(4～20％)(bio-radlaboratories,inc.制)進(jìn)行電泳，使用iblot轉(zhuǎn)移裝置(lifetechnologiescorporation制)將凝膠轉(zhuǎn)印到pvdf膜(membrane)(iblottransferstacks、lifetechnologiescorporation制)。將蛋白質(zhì)印跡結(jié)束后的pvdf膜封閉(2％eclprimeblockingagent(gehealthcarejapan公司制)inttbs)。作為一次抗體，加入antifgf-2humanrabbitpoly(h-131、santacruzbiotechnologyinc.)，4℃下振蕩一晩。一次抗體反應(yīng)后，對(duì)于膜利用ttbs重復(fù)約5分鐘的洗滌6次，加入二次抗體goatanti-rabbitigghrp(santacruzbiotechnologyinc.)，室溫下振蕩1小時(shí)。使用westernlightningultra(perkinelmerco.,ltd.制)使得抗體反應(yīng)結(jié)束后的膜發(fā)光。對(duì)其利用圖像裝置(fluor-smax、bio-radlaboratories,inc.)進(jìn)行解析。

(4)結(jié)果

結(jié)果如圖5所示。對(duì)于fgf110株和fgf111株，確認(rèn)了所預(yù)想的分子量約20kda的條帶。

實(shí)施例5：由雙歧乳桿菌進(jìn)行了his-tag純化的fgf2的生理活性測(cè)定

(1)由sp56株和sp67株的培養(yǎng)上清液純化人fgf2

通過(guò)與上述實(shí)施例4相同的方法，進(jìn)行sp56株和sp67株的培養(yǎng)。將該培養(yǎng)液離心分離，回收上清液，利用常規(guī)方法進(jìn)行硫酸銨沉淀。進(jìn)而，使用具有組氨酸標(biāo)簽的蛋白質(zhì)用純化試劑盒(talon(注冊(cè)商標(biāo))metalaffinityresin、takarabioinc.制)，進(jìn)行了親和純化。對(duì)于其使用超濾過(guò)濾片(amiconultra-4、10k、millipore)，將緩沖液置換為pbs，得到純化人fgf2溶液。對(duì)于該純化溶液中的人fgf2量使用quantikineelisafgf2basicimmunoassay(r&dsystems；dfb50)進(jìn)行測(cè)定。

(2)sp56株和sp67株分泌物中的fgf2蛋白質(zhì)的增殖促進(jìn)活性

對(duì)于fgf2的生理活性而言，將由sp56株和sp67株的培養(yǎng)上清液如上所述純化的人fgf2添加到nih/3t3細(xì)胞(小鼠成纖維用細(xì)胞株)，利用細(xì)胞增殖促進(jìn)活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。即，將nih/3t3細(xì)胞利用dmem培養(yǎng)基(10％(v/v)fbs)在37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)后，利用dmem培養(yǎng)基(5％(v/v)fbs)接種于96孔板各1×10³個(gè)，37℃下在5％co2的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。接著，將源自上述sp56株和sp67株的人fgf2純化物或重組hfgf2(r&dsystems)，與以fgf2濃度為0.25ng/ml～10ng/ml的方式和dmem培養(yǎng)基(5％(v/v)fbs)混合的培養(yǎng)基更換。作為陰性對(duì)照，也同樣地進(jìn)行對(duì)替代fgf2溶液混合有pbs(-)的培養(yǎng)基的更換。將該板在37℃下在5％co2的條件下培養(yǎng)4天。

向上述板添加cellcountingkit-8(株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所)各100μl后，進(jìn)而在37℃下、5％co2的條件下保溫2小時(shí)，測(cè)定波長(zhǎng)450nm和630nm(參照波長(zhǎng))時(shí)的吸光度，由此測(cè)定對(duì)于上述nih/3t3細(xì)胞的細(xì)胞增殖促進(jìn)活性。

(3)結(jié)果

結(jié)果如圖6所示。

由sp56、sp67株分泌的人fgf2具有濃度依存性的細(xì)胞增殖促進(jìn)活性。

實(shí)施例6：fgf2分泌量的穩(wěn)定性比較

(1)方法

以1％將wo2013/008881中記載的長(zhǎng)雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)105a/pfgf12a株和上述fgf110株、fgf110株的甘油系接種于mrs(75μg/ml壯觀霉素、1％維生素c添加液)培養(yǎng)基10ml，37℃下厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，作為活化培養(yǎng)液。接著以1％將活化培養(yǎng)液接種于相同的培養(yǎng)基，同樣地培養(yǎng)24小時(shí)作為繼代培養(yǎng)液。以后每24小時(shí)重復(fù)同樣的繼代。

在人fgf2分泌量測(cè)定前一天，以0.5％將上述繼代培養(yǎng)液接種于作為人fgf2測(cè)定用培養(yǎng)基的dmem:mrs(9:1)(含有75μg/ml壯觀霉素、1％維生素c添加液)培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)13小時(shí)。人fgf2分泌量測(cè)定在由甘油系的培養(yǎng)后第2天、第4天、第7天進(jìn)行。

將人fgf2測(cè)定用培養(yǎng)基中的培養(yǎng)液離心分離，得到培養(yǎng)上清液。對(duì)于該培養(yǎng)上清液中的fgf2蛋白質(zhì)量使用quantikineelisafgf2basicimmunoassay(r&dsystems；dfb50)進(jìn)行測(cè)定。

(2)結(jié)果

結(jié)果如圖7所示。

fgf2分泌量由高到低的順序?yàn)閒gf110株、fgf111株、fgf12a株。

fgf12a株在培養(yǎng)第4天以后，fgf2分泌量大幅降低。

實(shí)施例7：fgf110株給藥慢性缺血模型小鼠患肢血流量的推移

為了驗(yàn)證本發(fā)明的基因遞送載體在缺血性疾病部位的治療效果，制作下肢缺血的小鼠模型，給予人fgf2分泌雙歧乳桿菌進(jìn)行研究。

(1)小鼠下肢缺血模型(necroticmodel)的制作

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用19周齡、雌性的balb/c小鼠(japanslc,inc.)。對(duì)于麻醉而言，將戊巴比妥(共立制藥株式會(huì)社)稀釋到2.5mg/ml的稀釋物每20g體重0.4ml注射到腹腔內(nèi)。麻醉的同時(shí)，將肝素鈉(nipro)(用生理鹽水稀釋到50u/ml)0.2ml注射到腹腔內(nèi)。由腹部進(jìn)行小腿的除毛后，用9-0聚丙烯線將大腿動(dòng)脈結(jié)扎，切除大腿動(dòng)脈中樞。創(chuàng)內(nèi)用生理鹽水洗滌后，用6-0尼龍線縫合創(chuàng)傷。手后復(fù)溫，皮下注射肝素0.2ml。在術(shù)后第1、2天也皮下注射肝素0.4ml。

初次術(shù)后第6天進(jìn)行初次同樣麻醉，肝素給藥后，將大腿動(dòng)脈末梢結(jié)扎、切除。與初次同樣術(shù)后直至第2天為止進(jìn)行肝素給藥。另外由重組雙歧乳桿菌給藥后連日腹腔內(nèi)給予10％麥芽糖1ml。

(2)利用激光多普勒血流計(jì)進(jìn)行的血流測(cè)定

將小鼠麻醉后，使用激光多普勒血流計(jì)(moorinstruments公司制)進(jìn)行血流測(cè)定。對(duì)于由距骨小腿關(guān)節(jié)以下直至指尖為止的血流，對(duì)于兩側(cè)將血流定量，以患側(cè)/健側(cè)比表示。血流測(cè)定將第2次手術(shù)作為0天，在2天、7天、14天、21天、36天進(jìn)行。

(3)重組雙歧乳桿菌的給藥

向作為人fgf2分泌雙歧乳桿菌的fgf110株的冷凍制劑添加pbs，調(diào)整菌濃度來(lái)使用。下肢缺血模型第2次手術(shù)作為0天，在3天、4天、11天、18天、25天、32天由尾靜脈一天二次給予0.6×10⁹cfu。作為對(duì)比組，設(shè)定等量給予be穿梭株的冷凍制劑的組、和等水分量(0.2ml)給予pbs的組。

(4)結(jié)果

fgf110給藥組中，在14天以后示出與pbs、be穿梭組相比顯著的血流改善效果。該效果持續(xù)至36天。(表2、圖8)

[表2]

表2fgf110的血流改善效果

實(shí)施例8：用非選擇培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)后的質(zhì)粒保持穩(wěn)定性

(1)方法

除了上述制作的fgf110株和fgf111株之外，以1％將作為陰性對(duì)照株的be穿梭株的甘油系接種于mrs(75μg/ml壯觀霉素、1％維生素c添加液)培養(yǎng)基5ml，37℃下厭氧培養(yǎng)24小時(shí)，作為活化培養(yǎng)液。以1％將該活化培養(yǎng)液接種于相同的培養(yǎng)基，同樣地培養(yǎng)24小時(shí)，作為前培養(yǎng)液。以后，接種于不含有壯觀霉素的作為非選擇培養(yǎng)基的mrs(含有1％維生素c添加液)培養(yǎng)基5ml，每24小時(shí)在相同培養(yǎng)基繼代，重復(fù)非選擇培養(yǎng)基中的繼代培養(yǎng)。7次繼代的培養(yǎng)液用厭氧性稀釋液適當(dāng)稀釋，將其涂布于bl瓊脂培養(yǎng)基，37℃下厭氧培養(yǎng)2天。

隨機(jī)選擇形成于bl瓊脂培養(yǎng)基上的菌落100個(gè)，將這些菌落穿刺于bl-bs和bl瓊脂培養(yǎng)基，37℃下厭氧培養(yǎng)1天。確認(rèn)了各培養(yǎng)基上的穿刺痕跡中的雙歧乳桿菌的生長(zhǎng)，算出(bl-bs瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)部位)/(bl瓊脂培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)部位)×100，作為質(zhì)粒保持菌率。

(2)結(jié)果

結(jié)果如表3所示。測(cè)定質(zhì)粒保持穩(wěn)定性，結(jié)果fgf110株、fgf111株都表現(xiàn)出非常高的質(zhì)粒保持菌率。

[表3]

表3質(zhì)粒保持穩(wěn)定性

產(chǎn)業(yè)上的可利用性

通過(guò)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，能夠提供能夠目的蛋白質(zhì)高、穩(wěn)定地分泌表達(dá)的用于轉(zhuǎn)化厭氧菌的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒。因此，與以往的方法相比，能夠低侵襲、高效率地簡(jiǎn)便地進(jìn)行血管生成療法。另外，由于用上述質(zhì)粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的厭氧菌其本身形成基因遞送載體，對(duì)目的部位的基因的導(dǎo)入效率等不會(huì)成為問(wèn)題，與以往相比能夠進(jìn)行非常高效率的處置。由此，即使是對(duì)于高齡者等雖然本來(lái)血管生成療法應(yīng)該是有效的但是侵襲性高、全身性的副作用成為障礙而不能進(jìn)行處置的對(duì)象等也能夠有效地進(jìn)行處置。