本發(fā)明一般涉及重組質(zhì)粒，特別涉及當(dāng)被轉(zhuǎn)化進(jìn)入乳酸細(xì)菌細(xì)胞時能夠表達(dá)靶向免疫細(xì)胞的重組蛋白質(zhì)的質(zhì)粒，其中所述蛋白質(zhì)選自由鼠和人cxcl121α、cxcl17和ym1組成的組。本發(fā)明還涉及用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的乳酸細(xì)菌，以及所述乳酸細(xì)菌用于人和動物傷口愈合的用途。
背景技術(shù)：
：傷口愈合的過程具有重疊的階段(凝血期、炎癥期和增殖/重塑期)，其中局部微環(huán)境的組成隨著時間的推移而變化，不同的細(xì)胞類型發(fā)揮不同的作用。愈合過程中的關(guān)鍵細(xì)胞參與者是血小板、角質(zhì)形成細(xì)胞/上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞、不同的免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。機(jī)體中的所有組織都可能受傷，并且愈合過程對器官有一定的特異性，但受損細(xì)胞引起的初始信號是相似的。最受關(guān)注的傷口愈合形式是在皮膚上。組織損傷破壞體內(nèi)平衡，引發(fā)凝血過程并激活交感神經(jīng)系統(tǒng)。形成血塊的血小板釋放信號，主要是pdgf(血小板衍生生長因子)和tgf(轉(zhuǎn)化生長因子)改變局部環(huán)境(參考文獻(xiàn)1)。受傷的和應(yīng)激細(xì)胞釋放引發(fā)免疫細(xì)胞如嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞募集的報(bào)警信號。在傷口組織內(nèi)，免疫細(xì)胞分泌各種趨化因子、生長因子如vegf-a、fgf和egf(血管內(nèi)皮生長因子a、成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子)，ros(活性氧類)和基質(zhì)消化酶，其改變微環(huán)境并允許愈合過程進(jìn)入巨噬細(xì)胞去除壞死組織和死組織的增生期。來自傷口邊緣的細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞向內(nèi)移動到傷口中心，并用一層膠原和細(xì)胞外基質(zhì)覆蓋傷口表面。然后使傷口內(nèi)的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為表達(dá)收縮性α-sma(α-平滑肌肌動蛋白)的肌成纖維細(xì)胞，使傷口收縮并最終閉合。從成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變?nèi)Q于來自微環(huán)境的信號，其中一些來源于免疫細(xì)胞，主要是巨噬細(xì)胞。在此過程中，血管生長成新形成的組織、肉芽組織。在這個階段，除了免疫細(xì)胞募集和遷移到病變部位之外，通常還會增加流向相鄰區(qū)域的血流量以增加氧氣和營養(yǎng)物的可用性。傷口閉合后，病變部位由角質(zhì)形成細(xì)胞/上皮細(xì)胞重新上皮化，從而恢復(fù)器官屏障的完整性。即使在傷口閉合后，也會發(fā)生一些組織重塑以使基質(zhì)結(jié)構(gòu)正常化，并且大多數(shù)涉及的免疫細(xì)胞死亡或離開該部位。此外，在這個階段，死亡或垂死的細(xì)胞被剩余的組織巨噬細(xì)胞攝取并清除(吞噬)(參考文獻(xiàn)1)。更快的傷口愈合減輕患者的并發(fā)癥和不適。受傷或延遲的皮膚或粘膜傷口愈合是導(dǎo)致疼痛、直接暴露于病原體、喪失組織功能和喪失溫度和流體平衡調(diào)節(jié)的全球臨床問題。有幾種情況，其中嚴(yán)格控制的傷口愈合過程受損，并且皮膚或粘膜傷口比正常情況下更長時間保持不愈合，在最壞的情況下變成慢性的。減少血液流向皮膚，特別是在四肢，顯著降低愈合過程的效率。皮膚灌注減少或脈管系統(tǒng)功能受損的幾種臨床情況如pad(外周動脈疾病)、間歇性跛行、靜脈功能不全或動脈硬化斑塊的血管阻塞。受損的流向傷口區(qū)域的血流量導(dǎo)致氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)不足，輔助組織重建的細(xì)胞死于壞死或無法在位點(diǎn)處執(zhí)行任務(wù)。此外，如果無法被充分供應(yīng)，周圍的組織將失去功能并最終開始死亡。組織在重塑階段代謝非?；钴S，并且氧耗高。妨礙皮膚傷口愈合的另一個因素是高血糖癥和糖尿病。在高血糖條件下，細(xì)胞信號傳導(dǎo)和免疫系統(tǒng)功能受損。糖尿病導(dǎo)致的并發(fā)癥包括微血管變化和周圍神經(jīng)元的損傷。因此，糖尿病患者經(jīng)常在腳上發(fā)展出慢性創(chuàng)傷，通常稱為糖尿病足。今天針對這些患者的可用治療方法是采用手術(shù)清創(chuàng)或膠原酶來去除死亡組織并配合全身抗生素治療和閉合傷口敷料。在一些實(shí)驗(yàn)研究中，生長因子和生物材料已被應(yīng)用于慢性傷口(參考文獻(xiàn)2)?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1(sdf-1)，也被稱為c-x-c基序趨化因子12(cxcl12)，其是在機(jī)體中由cxcl12基因編碼的趨化因子蛋白。wo2009/079451公開了一種用于促進(jìn)受試者中傷口愈合的方法，其包括直接對傷口或接近傷口的區(qū)域施用有效地促進(jìn)受試者傷口愈合的量的sdf-1。已證實(shí)如果在愈合過程中在飲用水中補(bǔ)充某些益生菌(羅伊氏乳桿菌(lactobacillusreuteri)atccpta6475)能夠促進(jìn)傷口愈合(參考文獻(xiàn)9)，即攝取細(xì)菌。此外，植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)的培養(yǎng)物的上清液已被證明可抑制通常感染慢性傷口的銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)產(chǎn)生的生物膜(參考文獻(xiàn)10)。已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明經(jīng)過修飾以表達(dá)特定蛋白質(zhì)(例如細(xì)胞因子)的乳酸細(xì)菌可用于促進(jìn)傷口愈合。乳酸細(xì)菌稀疏存在于人體皮膚上(參考文獻(xiàn)13)，并且不是用于任何介入皮膚的細(xì)菌的預(yù)期選擇。乳桿菌(lactobacilli)難以發(fā)揮作用，因?yàn)樗鼈兩L相對緩慢，并且與更常用的細(xì)菌如大腸桿菌(e.coli)和金黃色葡萄球菌(s.aureus)相比需要特殊的培養(yǎng)基和條件。此外，乳桿菌具有有限的關(guān)于轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)折疊的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。為此，有必要優(yōu)化編碼異源蛋白質(zhì)的核苷酸序列以適應(yīng)特異性細(xì)菌菌株。傷口愈合的不同階段包括可以變化以改變愈合過程的不同關(guān)鍵事件。愈合過程中的血管重構(gòu)高度依賴于調(diào)節(jié)vegf-a(血管內(nèi)皮生長因子a)和一系列趨化因子例如cxcl12(也稱為sdf-1；seqidno：3和6)表達(dá)的缺氧誘導(dǎo)因子1α(hif-1α)的誘導(dǎo)。cxcl12在組織中組成性表達(dá)，并通過在白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的受體cxcr4發(fā)揮誘導(dǎo)多種細(xì)胞行為的作用(參考文獻(xiàn)3)。發(fā)現(xiàn)cxcl12在專注于組織重塑的巨噬細(xì)胞中具有高水平(參考文獻(xiàn)4)。利用慢病毒載體的cxcl12的皮膚過表達(dá)改善了糖尿病小鼠的傷口愈合(參考文獻(xiàn)5)。另一個最近發(fā)現(xiàn)的趨化因子是cxcl17(seqidno：9和12)，其對組織巨噬細(xì)胞的表型與cxcl12具有相似的作用。與cxcl12相似，cxcl17與細(xì)胞培養(yǎng)物中測量的vegf-a共同調(diào)節(jié)(參考文獻(xiàn)6)。cxcl17主要發(fā)現(xiàn)在粘膜組織中，據(jù)報(bào)道對皮膚上也發(fā)現(xiàn)的病原菌具有直接抗菌作用，而對干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)的存活沒有影響(參考文獻(xiàn)7)。另一種目標(biāo)蛋白質(zhì)是幾丁質(zhì)酶樣蛋白質(zhì)ym1(seqidno：15和18)。殼多糖是細(xì)菌生物膜中常見的多糖。ym1既能阻礙生物膜的生成，又能誘導(dǎo)對組織重塑和傷口愈合很重要的巨噬細(xì)胞功能，并由于它不被血管細(xì)胞或上皮細(xì)胞吸收而對巨噬細(xì)胞具有特異性(參考文獻(xiàn)8)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：因此，在第一方面，本發(fā)明提供了能夠在乳酸細(xì)菌中表達(dá)蛋白質(zhì)(即，當(dāng)被轉(zhuǎn)化進(jìn)入乳酸細(xì)菌細(xì)胞時)的重組質(zhì)粒，其中所述蛋白質(zhì)可用于改善人或動物受試者的傷口愈合，例如皮膚或粘膜傷口愈合。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)由于其靶向免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞及其前體的能力而可用于傷口愈合。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)是細(xì)胞因子或趨化因子。最優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)選自由鼠cxcl12，特別是鼠cxcl12-1α(seqidno：3)；人cxcl12，特別是人cxcl12-1α(seqidno：6)；鼠cxcl17(seqidno：9)；人cxcl17(seqidno：12)；鼠ym1(seqidno：15)；和人ym1(seqidno：18)組成的組。本發(fā)明的第一方面更具體地提供了能夠在乳酸細(xì)菌中表達(dá)重組蛋白(即，當(dāng)被轉(zhuǎn)化進(jìn)入乳酸細(xì)菌細(xì)胞)的質(zhì)粒，其中所述質(zhì)粒包含編碼選自cxcl12、cxcl17和ym1的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。更具體地，核苷酸序列可以編碼鼠cxcl12，特別是鼠cxcl12-1α；人cxcl12，特別是人cxcl12-1α；鼠cxcl17；人cxcl17；鼠ym1；或人ym1。在一個實(shí)施方案中，質(zhì)粒包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述蛋白質(zhì)選自具有seqidno：3或2所示氨基酸序列或與其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的鼠cxcl12-1α；具有seqidno：6或5所示氨基酸序列或與其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的人cxcl12-1α；具有seqidno：9或8所示氨基酸序列或與其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的鼠cxcl17；具有seqidno：12或11所示氨基酸序列或與其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的人cxcl17；具有seqidno：15或14所示氨基酸序列或與其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的鼠ym1；和如seqidno：18或17所示或與其具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的人ym1。更具體地說，質(zhì)粒用于在乳酸細(xì)菌中表達(dá)蛋白質(zhì)，因此提供或適應(yīng)于這種用途(例如，其被設(shè)計(jì)、選擇、適應(yīng)或修飾以用于在乳酸細(xì)菌中的特異性或特別的用途)。因此，在一個實(shí)施方案中，質(zhì)粒用于在相對于一般的細(xì)菌或微生物的乳酸細(xì)菌中的特異性表達(dá)。該質(zhì)?？梢酝ㄟ^調(diào)控元件(調(diào)節(jié)序列)和/或編碼序列(例如被選擇或修飾以用于在乳酸細(xì)菌中表達(dá))而適用于在乳酸細(xì)菌中表達(dá)。因此，在更具體的方面，質(zhì)粒包含允許在乳酸細(xì)菌中表達(dá)或特異性表達(dá)的一種或多種調(diào)節(jié)(即表達(dá)控制)序列。因此，質(zhì)?？梢院衼碓从诨蜻m合于或特異性于在乳酸細(xì)菌中表達(dá)的表達(dá)控制序列。合適的表達(dá)控制序列包括例如在匹配閱讀框中與編碼要表達(dá)的蛋白質(zhì)的核苷酸序列連接的翻譯(例如起始密碼子和終止密碼子、核糖體結(jié)合位點(diǎn))和轉(zhuǎn)錄控制元件(例如啟動子-操縱子區(qū)、終止停止序列)。調(diào)節(jié)序列可操縱地連接至編碼所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列，以使得它們驅(qū)動或控制蛋白質(zhì)的表達(dá)?？蓪①|(zhì)粒引入乳酸細(xì)菌細(xì)胞。合適的轉(zhuǎn)化技術(shù)在文獻(xiàn)中有很好的描述?？梢栽谠试S從質(zhì)粒表達(dá)所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)或以其它方式保持細(xì)菌細(xì)胞。這可以包括受試者的傷口中的狀況。在一個實(shí)施方案中，控制蛋白質(zhì)表達(dá)的質(zhì)粒中的啟動子是允許或特異于在乳酸細(xì)菌中表達(dá)的啟動子。因此，質(zhì)?？梢园谀軌蛟谌樗峒?xì)菌中表達(dá)蛋白質(zhì)的(或可操縱連接至)啟動子的控制下編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，質(zhì)粒包含乳酸細(xì)菌啟動子，即控制蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動子是來源于乳酸細(xì)菌的啟動子，或更特別是獲得于或來源于乳酸細(xì)菌中表達(dá)的基因。在一些實(shí)施方案中，除了乳酸細(xì)菌啟動子之外，質(zhì)粒還可以包含獲得于或來源于乳酸細(xì)菌的其它控制蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)控元件或序列。因此，例如這樣的其它乳酸細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)控制元件或序列可以包括增強(qiáng)子、終止子和/或翻譯控制元件或如上所述的序列。在一些實(shí)施方案中，質(zhì)粒還可包含控制或調(diào)控從啟動子開始表達(dá)的調(diào)控元件或序列，例如，操縱子序列等或如下面進(jìn)一步討論的一種或多種調(diào)控基因。可選地或另外地，通過針對在乳酸細(xì)菌中表達(dá)而對編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，可以使質(zhì)粒適用于(或經(jīng)過修飾等)在乳酸細(xì)菌中的使用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于表達(dá)蛋白質(zhì)的啟動子是受調(diào)控的(可調(diào)控的)或可誘導(dǎo)的啟動子。因此，通過提供或使細(xì)菌與激活或啟動(誘導(dǎo))啟動子的調(diào)控分子或誘導(dǎo)劑接觸，可以控制或調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)(例如引發(fā)，如在期望的或合適的時間)。這在將蛋白質(zhì)遞送到傷口的情況下是有利的。因此，本發(fā)明的另一方面提供了用于在乳酸細(xì)菌中表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)，所述表達(dá)系統(tǒng)包含(i)如本文所定義的質(zhì)粒，其中所述質(zhì)粒包含在誘導(dǎo)型啟動子控制下編碼所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述質(zhì)粒能夠在乳酸細(xì)菌中表達(dá)所述蛋白質(zhì)；和(ii)用于啟動子的誘導(dǎo)劑(或調(diào)控分子)。表達(dá)系統(tǒng)可以方便地以包含上述組分(i)和(ii)的試劑盒的形式提供。本發(fā)明的另一方面是用如本文定義的本發(fā)明的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的(即包含)細(xì)菌(bacterium)或細(xì)菌(bacteria)(即細(xì)菌細(xì)胞或菌株)。特別地，細(xì)菌是乳酸細(xì)菌，并且因此本發(fā)明提供了包含本文定義的本發(fā)明的質(zhì)粒的乳酸細(xì)菌(或乳酸細(xì)菌)?？商鎿Q地表示為，本發(fā)明的這個方面提供了已經(jīng)引入了本發(fā)明的質(zhì)粒的細(xì)菌(或細(xì)菌細(xì)胞)。如本文進(jìn)一步描述的，本發(fā)明的質(zhì)粒和細(xì)菌可用于促進(jìn)愈合，并因此在促進(jìn)傷口愈合方面具有特別的用途，本文定義的傷口通常包括受損組織(見下文)。因此，本發(fā)明的另外的方面提供了這種質(zhì)粒和細(xì)菌在治療中的用途，更具體地在傷口愈合中的用途。可以將細(xì)菌以藥物組合物形式施用于待治療的受試者的傷口。因此，本發(fā)明的另一方面提供了包含本文定義的本發(fā)明的細(xì)菌以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。更一般地，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明細(xì)菌的益生菌產(chǎn)品。這樣的產(chǎn)品或藥物組合物可以方便地采取包含本發(fā)明的細(xì)菌的傷口敷料的形式。因此，在另一方面，本發(fā)明提供了包含如上文所定義的本發(fā)明細(xì)菌和至少一種敷料材料的傷口敷料。本發(fā)明的另一方面提供了本文所定義的本發(fā)明的質(zhì)粒或細(xì)菌用于制造用于傷口愈合的藥物(或益生菌產(chǎn)品)的用途。還提供了治療受試者以愈合傷口的方法，所述方法包括向所述受試者或所述受試者的傷口施用有效促進(jìn)傷口愈合的量的本文所定義的本發(fā)明的細(xì)菌。本發(fā)明的另一方面提供了用于愈合傷口的試劑盒，所述試劑盒包括：(i)包含本文所定義的本發(fā)明的質(zhì)粒的乳酸細(xì)菌，其中所述質(zhì)粒包含在誘導(dǎo)型啟動子控制下編碼所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述質(zhì)粒能夠在乳酸細(xì)菌中表達(dá)所述蛋白質(zhì)；和(ii)用于啟動子的誘導(dǎo)劑(或調(diào)控分子)。本發(fā)明的另一方面包括藥物產(chǎn)品(例如試劑盒或組合產(chǎn)品)，其包含：(i)包含本文所定義的本發(fā)明的質(zhì)粒的乳酸細(xì)菌，其中所述質(zhì)粒包含在誘導(dǎo)型啟動子控制下編碼所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述質(zhì)粒能夠在乳酸細(xì)菌中表達(dá)所述蛋白質(zhì)；和(ii)用于啟動子的誘導(dǎo)劑(或調(diào)控分子)，所述藥物產(chǎn)品作為組合制劑用于在傷口愈合(或用于處理受試者傷口)中分開、順序或同時使用。本文廣義地使用術(shù)語“傷口愈合”包括促進(jìn)或改善傷口愈合的任何方面。因此，上文闡述的本發(fā)明的各個方面可以替代地用關(guān)于質(zhì)粒或細(xì)菌在促進(jìn)或增強(qiáng)或改善傷口愈合或僅僅促進(jìn)或增強(qiáng)愈合中的用途來定義。因此，傷口愈合可以包括或包含導(dǎo)致更快傷口愈合或傷口更完全愈合的任何效果，或者甚至在傷口愈合中任何改良或改善傷口愈合，例如減少愈合時間，如實(shí)現(xiàn)傷口部分或完全閉合的時間減少，改善傷口外觀(例如已愈合的或正在愈合的傷口的外觀)，減少或改善瘢痕形成，促進(jìn)慢性或頑固性傷口愈合等(即將本發(fā)明的細(xì)菌應(yīng)用于傷口可以誘導(dǎo)或引起或開始傷口的愈合，該傷口迄今尚未愈合或未出現(xiàn)任何愈合跡象)。傷口將在下面更詳細(xì)地討論。具有待治療傷口的受試者可以是任何人或動物受試者，包括例如家畜、牲畜、實(shí)驗(yàn)室動物、競技動物(sportsanimals)或動物園動物。動物優(yōu)選是哺乳動物，但是也包括其它動物，例如，鳥類。因此，動物可以是靈長類動物、嚙齒動物(例如小鼠或大鼠)或馬、狗或貓。最優(yōu)選受試者是人。乳酸細(xì)菌(lab)或乳桿菌屬(lactobacillales)是具有共同的代謝和生理特征的革蘭氏陽性、低gc、耐酸、通常非孢子生成的、非呼吸性的棒狀(芽孢桿菌(bacillus))或球形(球菌(coccus))細(xì)菌的分支。這些細(xì)菌產(chǎn)生乳酸作為碳水化合物發(fā)酵的主要代謝最終產(chǎn)物，其以耐酸性(低ph范圍)增加為特征。lab的這些特征允許它們在天然發(fā)酵中優(yōu)于其它細(xì)菌，因?yàn)閘ab可以承受由有機(jī)酸產(chǎn)生(例如乳酸)而增加的酸度。因此，lab在食物發(fā)酵中起重要作用，因?yàn)樗峄种聘瘮┑纳L。幾種lab菌株還產(chǎn)生蛋白質(zhì)細(xì)菌素，其進(jìn)一步抑制病原微生物的腐敗和生長。lab通常被認(rèn)為是安全(gras)的狀態(tài)，并且是食品工業(yè)中采用的最重要的微生物群體之一。包含乳酸細(xì)菌分支的核心屬是乳桿菌屬(lactobacillus)、明串珠菌屬(leuconostoc)、片球菌屬(pediococcus)、乳球菌屬(lactococcus)、和鏈球菌屬(streptococcus)、以及更外圍的氣球菌屬(aerococcus)、肉桿菌屬(carnobacterium)、腸球菌屬(enterococcus)、酒球菌屬(oenococcus)、芽孢乳桿菌屬(sporolactobacillus)、四聯(lián)球菌屬(tetragenococcus)、漫游球菌屬(vagococcus)和魏斯氏菌屬(weissella)。這些屬的任何乳酸細(xì)菌都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，特別是來自乳桿菌屬(lactobacillus)或乳球菌屬(lactococcus)的細(xì)菌。質(zhì)?？梢跃幋a一種或多種所述蛋白質(zhì)。因此，它可以編碼cxcl12、cxcl17和/或ym1蛋白(例如cxcl12、cxcl17或ym1的2個或更多個)的組合?？蛇x地，它可以編碼2種或更多種類型的cxcl12、cxcl17和/或ym1蛋白(例如鼠和人cxcl12等)。當(dāng)編碼多于一種蛋白質(zhì)時，由在單個啟動子控制下可以從編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列表達(dá)該蛋白質(zhì)，或者可以使用多于一種的啟動子。例如，每種蛋白質(zhì)可以由單獨(dú)的啟動子表達(dá)，其可以相同或不同。用于從同一質(zhì)粒一起表達(dá)2種或更多種蛋白質(zhì)的技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且包括例如翻譯偶聯(lián)技術(shù)等，用于實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)的手段是本領(lǐng)域已知和可獲得的。例如，采用p2a和t2a序列可以在一個啟動子下同時表達(dá)多個轉(zhuǎn)基因。cxcl12、cxcl17或ym1蛋白可以是自然或天然蛋白質(zhì)(即，核苷酸序列可以編碼具有自然中發(fā)現(xiàn)的氨基酸序列的蛋白質(zhì))，并且可以來自產(chǎn)生這些蛋白質(zhì)的任何物質(zhì)。通常，蛋白質(zhì)將是哺乳動物蛋白質(zhì)，且如上所述，人和鼠蛋白質(zhì)是優(yōu)選的。然而，天然核苷酸序列或蛋白質(zhì)序列可以被修飾，例如通過一個或多個氨基酸增加、插入、缺失和/或取代，只要蛋白質(zhì)的功能或活性沒有實(shí)質(zhì)上或顯著的改變，例如，只要蛋白質(zhì)的活性基本上被保留。蛋白質(zhì)可以是天然蛋白質(zhì)的片段或截短的變體。例如，序列修飾的變體蛋白質(zhì)可以表現(xiàn)出從其來源的親本蛋白質(zhì)的至少80％、85％、90％或95％的活性。這可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的用于上述蛋白質(zhì)的活性的測試進(jìn)行評估。例如，活性測試可以在結(jié)扎后所述蛋白質(zhì)處理的培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)受體磷酸化或鈣通流量體系中，在對受感染蛋白質(zhì)的細(xì)胞募集模型中的細(xì)胞體外或體內(nèi)趨化性的體系中進(jìn)行?；谮吇缘捏w外測定描述于參考文獻(xiàn)22和32中。參考文獻(xiàn)33描述了可以采用的另外的體外趨化因子活性測試。因此，術(shù)語“cxcl12”、“cxcl17”或“ym1”不僅包括天然蛋白質(zhì)，還包括它們的功能性等同變體或衍生物。因此，蛋白質(zhì)可以是合成的或序列修飾的變體，或者可以包括一種或多種其它修飾，例如，翻譯后修飾等。如上所述，被編碼的蛋白質(zhì)可以具有如上所述的天然的人或鼠蛋白質(zhì)的氨基酸序列，即seqidno：3和6分別為鼠和人cxcl12、9和12分別為鼠和人cxcl17、15和18分別為鼠和人ym1，或者與任何上述序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。有利地，如上所述，可以對編碼這些天然蛋白質(zhì)的核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化以用于在乳酸細(xì)菌中表達(dá)。這可產(chǎn)生具有經(jīng)過修飾的氨基酸序列的被編碼的蛋白質(zhì)。例如，經(jīng)密碼子優(yōu)化的序列可以編碼序列，例如適合(或更適合)乳酸細(xì)菌的分泌序列。因此，與天然蛋白質(zhì)相比，由經(jīng)密碼子優(yōu)化的核苷酸序列編碼的“優(yōu)化”蛋白質(zhì)可以包括改變的或取代的前導(dǎo)序列或信號序列(例如分泌序列)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，由密碼子優(yōu)化的序列編碼的蛋白質(zhì)的成熟或裂解形式與天然蛋白質(zhì)相同。由經(jīng)密碼子優(yōu)化的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)可以具有如seqidno：2、5、8、11、14或17所示的氨基酸序列，如下表iv所列。因此，由質(zhì)粒編碼的蛋白質(zhì)可以具有如seqidno：2和5所示的分別為鼠和人cxcl12的氨基酸序列，8和11分別為鼠和人cxcl17，以及14和17分別為鼠和人ym1，或與任何上述序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，被編碼的蛋白質(zhì)可以與任何上述氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。序列同一性可以容易地通過本領(lǐng)域已知和且容易獲得的方法和軟件來確定。因此，可以通過任何方便的方法來評估序列同一性。然而，為了確定序列之間的序列同一性程度，進(jìn)行序列多重比對的計(jì)算機(jī)程序是有用的，例如clustalw(參考文獻(xiàn)24)。比較和對齊成對序列的程序，如align(參考文獻(xiàn)25)、fasta(參考文獻(xiàn)26和參考文獻(xiàn)27)、blast和空位blast(gappedblast)(參考文獻(xiàn)28)也可用于此目的，并且可以采用默認(rèn)設(shè)置。此外，歐洲生物信息學(xué)研究所的dali服務(wù)器提供基于結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列比對(參考文獻(xiàn)29、參考文獻(xiàn)30和參考文獻(xiàn)31)。采用標(biāo)準(zhǔn)blast參數(shù)(例如采用來自所有可獲得有機(jī)體的序列，矩陣blosum62，缺口成本：存在11，延伸1)可以確定多重序列比對和百分比同一性計(jì)算?；蛘撸梢圆捎靡韵鲁绦蚝蛥?shù)：程序：alignplus4，版本4.10(sciedcentralclonemanagerprofessionalsuite)。dna比較：全局比較，標(biāo)準(zhǔn)線性評分矩陣，不匹配罰分＝2，開放缺口罰分＝4，延伸缺口罰分＝1。氨基酸比較：全局比較，blosum62評分矩陣。如本文所定義的天然存在的多肽序列的變體可以以合成的方式生成，例如通過采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)，例如標(biāo)準(zhǔn)誘變技術(shù)，諸如定點(diǎn)或隨機(jī)誘變(例如采用基因改組或易錯pcr)。本文定義的蛋白質(zhì)的衍生物也可以被編碼。衍生物是指如上所述的蛋白質(zhì)或其變體，其中氨基酸是經(jīng)過化學(xué)修飾的，例如通過糖基化等等。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)相對于天然蛋白質(zhì)的序列包含氨基酸取代時，取代可優(yōu)選為保守取代。術(shù)語“保守氨基酸取代”是指氨基酸被具有相似物理化學(xué)性質(zhì)的氨基酸(即相同類別/組的氨基酸)替代(取代)的任何氨基酸取代。例如，小殘基甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、絲氨酸(s)或蘇氨酸(t)；疏水性或脂肪族殘基亮氨酸(l)、異亮氨酸(i)；纈氨酸(v)或甲硫氨酸(m)；親水性殘基天冬酰胺(n)和谷氨酰胺(q)；酸性殘基天冬氨酸(d)和谷氨酸(e)；帶正電(堿性)殘基精氨酸(r)、賴氨酸(k)或組氨酸(h)；或芳香族殘基苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)和色氨酸(w))可以互換取代，而基本上不改變蛋白質(zhì)的功能或活性。如上所述，優(yōu)選使用誘導(dǎo)型啟動子來表達(dá)蛋白質(zhì)?！罢T導(dǎo)型”是指可以調(diào)控或控制其功能(即，允許或引起編碼核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄的活性或作用)的任何啟動子。術(shù)語“誘導(dǎo)型”因此是同義詞，可以與“可調(diào)控”(或“受調(diào)控的”)互換使用。因此，不存在蛋白質(zhì)的組成型表達(dá)。因此，蛋白質(zhì)的表達(dá)可以被誘導(dǎo)或啟動(或更特別地啟動和關(guān)閉)。更具體地，可以在有限的或限定的時間內(nèi)誘導(dǎo)或啟動表達(dá)。這可能是因?yàn)楸磉_(dá)在一段時間后停止，和/或因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞死亡。在一些實(shí)施方案中，可能沒有從啟動子的表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)，直到啟動子被誘導(dǎo)(或者可選地被稱為活化)。然而，與任何生物系統(tǒng)一樣，缺乏活性可能不是絕對的，并且在不存在啟動子活化或誘導(dǎo)的情況下可能存在一些基礎(chǔ)啟動子活性。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，未誘導(dǎo)的啟動子的任何基礎(chǔ)表達(dá)是低的、最小的或不顯著的，或者更優(yōu)選的是微量的或可忽略的。因此，與啟動子未被誘導(dǎo)時相比，當(dāng)啟動子被誘導(dǎo)時，從誘導(dǎo)型啟動子的表達(dá)有利地可測量或顯著地增加?？烧T導(dǎo)的啟動子是本領(lǐng)域熟知的，包括用于在乳酸細(xì)菌中使用的誘導(dǎo)型啟動子，并且可以使用任何合適的適合于在乳酸細(xì)菌中表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子可以在誘導(dǎo)劑或活化劑分子的存在下被誘導(dǎo)(或活化)，誘導(dǎo)劑或活化劑分子可以直接或間接地作用在啟動子上，并且可以加入以誘導(dǎo)啟動子，或更一般地引起或?qū)崿F(xiàn)啟動子誘導(dǎo)或激活，并允許蛋白質(zhì)的表達(dá)，或者通過含有質(zhì)粒的細(xì)菌的條件的改變可以誘導(dǎo)(或激活)，例如通過引入乳酸細(xì)菌中條件的改變，例如，饑餓或消耗特定營養(yǎng)物質(zhì)。啟動子的誘導(dǎo)劑可以由調(diào)控基因編碼，在一個實(shí)施方案中調(diào)控基因本身可以被誘導(dǎo)或活化。因此，術(shù)語“誘導(dǎo)劑”在本文中廣泛地用于包括任何調(diào)控分子，或?qū)嶋H上任何許可條件，其可以激活或啟動誘導(dǎo)型啟動子，或者允許或引起誘導(dǎo)型啟動子被誘導(dǎo)。因此，誘導(dǎo)型啟動子的誘導(dǎo)可以包括引入(例如接觸包含質(zhì)粒的乳酸細(xì)菌)調(diào)控分子或允許啟動子誘導(dǎo)(活化)的條件。在一些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)劑可以是活化肽。這可以直接或間接地誘導(dǎo)啟動子，例如如下文進(jìn)一步描述的。如上所述，優(yōu)選獲得于或來源于乳酸細(xì)菌的啟動子。這些可以是天然啟動子或經(jīng)修飾的或突變的啟動子。例如可以通過使乳酸細(xì)菌在傷口中生長，并通過確定哪些基因在傷口中的細(xì)菌中表達(dá)或上調(diào)來鑒定合適的啟動子。然后可以鑒定來自這些基因的啟動子。可替換的，乳酸細(xì)菌中的或用于乳酸細(xì)菌中的許多不同的啟動子和表達(dá)系統(tǒng)是已經(jīng)被鑒定出來并進(jìn)行描述的，或者是本領(lǐng)域可獲得的，包括含有此類啟動子的表達(dá)質(zhì)?；蛴糜趌ab的表達(dá)系統(tǒng)?？梢允褂萌魏芜@樣的已知質(zhì)粒或表達(dá)系統(tǒng)作為本發(fā)明的重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域已知各種誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)用于lab例如乳桿菌。一個實(shí)例包括基于參考文獻(xiàn)19中所述的植物乳桿菌(l.plantarum)nc8的錳轉(zhuǎn)運(yùn)體的錳饑餓誘導(dǎo)型啟動子的自動誘導(dǎo)系統(tǒng)。該系統(tǒng)不需要添加用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的外部誘導(dǎo)物。duong等人(參考文獻(xiàn)20)描述了基于寬范圍的pwv01復(fù)制子乳桿菌使用的表達(dá)載體，并含有來自涉及低聚果糖(fos)、乳糖或海藻糖代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)或糖酵解的操縱子的啟動子。這樣的啟動子可以被其特異性碳水化合物誘導(dǎo)并被葡萄糖抑制。更具體地，誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)可以包含參與生產(chǎn)lab蛋白質(zhì)，特別是細(xì)菌素的誘導(dǎo)型啟動子。這種啟動子的活性可以由基于細(xì)菌素調(diào)節(jié)子的同源調(diào)控系統(tǒng)來控制，例如雙組分調(diào)控(信號轉(zhuǎn)導(dǎo))系統(tǒng)，該系統(tǒng)響應(yīng)于外部添加的活化肽(即肽形式的誘導(dǎo)劑/調(diào)控分子)和編碼組氨酸蛋白激酶和響應(yīng)調(diào)節(jié)因子的基因，這些基因是由活化肽誘導(dǎo)后激活該啟動子所需要的。在一個實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)可以基于乳鏈菌肽控制的表達(dá)(nice)系統(tǒng)，基于nisa啟動子和nisrk調(diào)控基因的組合。該系統(tǒng)基于來自乳酸乳球菌(lactococcuslactis)乳鏈菌肽基因簇的啟動子和調(diào)控基因，并且已經(jīng)用于開發(fā)用于乳酸球菌(lactococci)、乳酸桿菌和其它革蘭氏陽性菌的調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)(在參考文獻(xiàn)15和參考文獻(xiàn)21中簡要敘述)。雖然nice系統(tǒng)在乳酸球菌中效率高且受到很好的調(diào)控，但這些系統(tǒng)可以表現(xiàn)出顯著的基礎(chǔ)活性。這可以通過將組氨酸激酶和響應(yīng)調(diào)控基因整合到染色體中，將表達(dá)系統(tǒng)限制到特定設(shè)計(jì)的宿主菌株進(jìn)行規(guī)避。在另一個實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)可以基于參與由sakacina調(diào)節(jié)子產(chǎn)生ii類細(xì)菌素sakacina(sap基因)或由sakacinp調(diào)節(jié)子產(chǎn)生sakacinp(spp基因)的基因和啟動子。這樣的載體被稱為psip載體，含有來源于sakacina或sakacinp結(jié)構(gòu)基因的啟動子元件，并具有用于翻譯融合克隆的工程化ncoi位點(diǎn)。含有來自調(diào)節(jié)子和/或不同復(fù)制子的不同啟動子的各種這樣的載體在參考文獻(xiàn)21和參考文獻(xiàn)15中有描述，任何這些載體可以用作本發(fā)明的重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)。在代表性的實(shí)施方案中，啟動子可以是來自sakacina或p調(diào)節(jié)子的psapa、psppa或porfx啟動子，以及其相關(guān)或同源的調(diào)控基因。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于圖12所示的并描述于參考文獻(xiàn)21中的載體psip411，質(zhì)粒含有psh71復(fù)制子、來自sakacinp調(diào)節(jié)子的porfx啟動子和同源調(diào)控基因。本申請中質(zhì)粒psip411被命名為plab112。在這樣的實(shí)施方案中使用的誘導(dǎo)劑優(yōu)選為基于肽sppip的活化肽，例如具有seqidno：19的序列的活化肽或與其具有至少80％(或更特別是至少85、90或95)序列同一性的氨基酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組質(zhì)粒來源于具有seqidno：20所示核苷酸序列的命名為plab112的質(zhì)粒。使用誘導(dǎo)型啟動子(或誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng))可以提供更受控制的、特別是在傷口環(huán)境中延長蛋白質(zhì)表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)，即當(dāng)將細(xì)菌施用于受試者或傷口時。為了在促進(jìn)傷口愈合方面有更好的效果，有利的是利用細(xì)菌使蛋白質(zhì)在傷口部位(例如傷口表面)表達(dá)一段時間，例如至少40、45、50、55或60分鐘，特別是至少1小時或更長時間。因此，蛋白質(zhì)可以在有限的，定義的或延長的時間段內(nèi)表達(dá)。下面實(shí)施例中呈現(xiàn)的結(jié)果表明，利用根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)粒和細(xì)菌，可以使蛋白質(zhì)在傷口表面表達(dá)約1小時的時間段。在一些實(shí)施方案中，質(zhì)粒和細(xì)菌可以被優(yōu)化以允許蛋白質(zhì)(例如在傷口中)表達(dá)2、3或4小時或更長時間。因此，蛋白質(zhì)的連續(xù)表達(dá)和遞送是期望的，并且這可以通過利用本發(fā)明的經(jīng)過轉(zhuǎn)化細(xì)菌來提供?！斑B續(xù)”或“延長”是指在一段時間內(nèi)(例如在至少一個小時的時間段(或類似地，如上所述))存在蛋白質(zhì)表達(dá)、和由此的蛋白質(zhì)遞送。特別地，這允許蛋白質(zhì)在與直接施用蛋白質(zhì)(即作為蛋白質(zhì)產(chǎn)品而不是由細(xì)菌表達(dá))相比在一段時間內(nèi)更加有效。如上所述，編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列可以被密碼子優(yōu)化以用于在lab中表達(dá)。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，重組質(zhì)粒中編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列(或插入片段)可以選自seqidno：1、4、7、10、13和16所示的分別編碼鼠cxcl12、人cxcl12、鼠cxcl17、人cxcl17、鼠ym1和人ym1或與其具有至少80％序列同一性的核苷酸序列的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列。因此，在代表性實(shí)施方案中，重組質(zhì)?？梢赃x自由以下質(zhì)粒組成的組：命名為mlrck1的質(zhì)粒，其包含如seqidno：1所示的核苷酸序列；mlrck1.4，其包含seqidno：1所示的核苷酸序列；mlrck1.7，其包含seqidno：1所示的核苷酸序列；hlrck1，其包含seqidno：4所示的核苷酸序列；mlrck2，其包含seqidno：7所示的核苷酸序列；hlrck2，其包含seqidno：10所示的核苷酸序列；hlrmp1，其包含seqidno：13所示的核苷酸序列；以及mlrmp2，其包含如seqidno：16所示的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的質(zhì)粒包含與以下密經(jīng)碼子優(yōu)化的插入片段mlrck1(即與seqidno：1的核苷酸序列)、mlrck1.4(即與seqidno：1的核苷酸序列)、mlrck1.7(即與seqidno：1的核苷酸序列)、hlrck1(即與seqidno：4的核苷酸序列)、mlrck2(即與seqidno：7的核苷酸序列)、hlrck2(即與seqidno：10的核苷酸序列)、hlrmp1(即與seqidno：13的核苷酸序列)、和mlrmp2(即與seqidno：16的核苷酸序列)的核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的核苷酸序列。核苷酸分子的序列同一性可以通過本領(lǐng)域已知和廣泛可獲得的方法和軟件來確定，例如通過利用用gcg包的fasta搜索，其具有默認(rèn)值和可變pam因子(pamfactor)，和在12.0處設(shè)置的缺口建立罰分和在4.0處設(shè)置的缺口延伸罰分(具有6個核苷酸的窗口)。這樣的序列同一性的相關(guān)核苷酸序列可以在功能上等同于seqidno：1、4、10、13或16所示的核苷酸序列。如果這些核苷酸序列編碼會被認(rèn)為與相應(yīng)的cxcl12、cxcl17或ym1蛋白質(zhì)的功能等同物的多肽，則這些核苷酸序列可以被認(rèn)為在功能上等同。優(yōu)選的功能等同物是編碼如上所述的優(yōu)選蛋白質(zhì)的那些。另一方面，本發(fā)明提供用上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌株。所述細(xì)菌菌株優(yōu)選乳酸細(xì)菌菌株如乳桿菌屬菌株或乳球菌屬(例如乳酸乳球菌)菌株。更優(yōu)選地，細(xì)菌菌株是羅伊氏乳桿菌，例如羅伊氏乳桿菌r2lc或者羅伊氏乳桿菌dsm20016。通過對六名受試者的前臂皮膚生物群進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析而確定在人皮膚上沒有發(fā)現(xiàn)所述菌株(羅伊氏乳桿菌r2lc/dsm20016和乳酸乳球菌)(參考文獻(xiàn)13)。除了質(zhì)粒、表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和試劑盒之外，本發(fā)明的另外的產(chǎn)品還包括含有細(xì)菌的藥物組合物和醫(yī)療裝置。這樣的組合物和裝置可以特別包括傷口敷料、包裝材料、拭子，植入物等，或甚至可以引入或存在于傷口部位(例如在手術(shù)傷口部位)處的任何全部或部分內(nèi)在的醫(yī)療裝置，例如線或?qū)Ч芑蛑踩胛?。還包括益生菌產(chǎn)品，即含有細(xì)菌用于施用給受試者的產(chǎn)品，例如，用于口服施用，例如用于食用或攝取，或局部施用于傷口或直接施用于傷口部位，例如，在手術(shù)期間，或經(jīng)直腸途徑、經(jīng)陰道途徑等。因此，根據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)品(例如質(zhì)粒、細(xì)菌菌株、益生菌和傷口敷料等)可用于醫(yī)學(xué)治療，特別是用于促進(jìn)人或動物受試者的傷口愈合。如本文所用，術(shù)語“促進(jìn)傷口愈合”是指提高、改善、增加或誘導(dǎo)傷口的閉合、愈合或修復(fù)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，人或動物受試者由于潛在醫(yī)學(xué)狀況導(dǎo)致傷口愈合受損而需要傷口愈合，例如減少的外周血液灌注(周圍動脈疾病)、高血糖或神經(jīng)病變，或者受試者可能由于任何原因的免疫功能低下，例如由于潛在疾病(無論是獲得性還是遺傳性)或作為治療的效果。特別地，受試者可能患有糖尿病。要治愈的傷口可以包括對受試者機(jī)體的任何部分的任何傷害、創(chuàng)傷或損傷。可以通過該方法治療的傷口的實(shí)例包括急性病癥或傷口；例如熱灼傷(熱或冷)、化學(xué)灼傷、輻射灼傷、電灼傷、過度暴露于紫外線輻射引起的灼傷(如曬傷)；對身體組織的損害，例如由于勞動和分娩而產(chǎn)生的會陰；在醫(yī)療過程中受的傷，例如外陰切開術(shù)、創(chuàng)傷性損傷，包括切口、手術(shù)切口、擦傷；意外傷害；手術(shù)后損傷以及慢性病情；例如壓瘡、褥瘡、潰瘍、與糖尿病和循環(huán)不良相關(guān)的病癥，以及所有類型的痤瘡。此外，傷口可以包括皮炎、牙科手術(shù)后的傷口；牙周疾病；創(chuàng)傷后的傷口；和腫瘤相關(guān)的傷口。其它實(shí)例是例如胃炎或炎癥性腸病期間發(fā)生的胃腸道創(chuàng)傷。因此，術(shù)語“傷口”在本文中廣泛地用于包括任何違反組織的完整性或?qū)M織的任何傷害或損傷。因此，該術(shù)語包括組織的任何傷害、創(chuàng)傷或損傷或任何損傷，無論如何(例如由于意外損傷或創(chuàng)傷、手術(shù)或其它預(yù)期或有目的的損傷或疾病)引起的。創(chuàng)傷可能包括任何物理或機(jī)械損傷或由包括病原體或生物或化學(xué)試劑的外部試劑引起的任何傷害。組織傷害也可能由缺氧、缺血或再灌注引起。傷口可以包括任何類型的燒傷。傷口可以是急性或慢性的。慢性傷口可以描述為在愈合階段停滯不前的任何傷口，例如在炎癥期，或在30、40、50或60天或更長時間內(nèi)未愈合的任何傷口。傷口可以存在于機(jī)體的內(nèi)表面或外表面或組織中。在特定實(shí)施例中，傷口在機(jī)體的外表面上或組織上，例如皮膚(skin)(即皮膚，cutaneous)傷口或粘膜傷口，特別是機(jī)體的外部粘膜組織或表面(例如在眼睛、耳朵或鼻子上等)上的傷口。在另一個實(shí)施方案中，它是胃腸道傷口。在不同的實(shí)施方案中，它不是胃腸道傷口(即它是不同于胃腸道傷口的傷口)。細(xì)菌可以以任何方便或期望的方式施用，例如以經(jīng)口的方式或以局部的方式，或者通過直接給施用至傷口部位，例如通過直接注射或輸注或應(yīng)用或引入含有細(xì)菌的藥物組合物或敷料或裝置。在其它實(shí)施方案中，其可以施用于口腔、或以鼻內(nèi)方式或通過吸入、以直腸或陰道的方式施用。因此，可以將細(xì)菌施用于、或經(jīng)由身體的任何孔。為了施用至胃腸道傷口，可以以經(jīng)口的方式施用細(xì)菌。根據(jù)規(guī)程并采用本領(lǐng)域公知的手段和途徑，細(xì)菌可以以任何方便或期望的方式配制或制備以通過任何上述途徑施用。因此，除了藥物組合物、醫(yī)療裝置和敷料等之外，本發(fā)明的益生菌產(chǎn)品可以以營養(yǎng)補(bǔ)充劑或食品或在營養(yǎng)補(bǔ)充劑或食品中配制和提供，例如功能性食品?？诜┯媒o藥形式包括粉劑、片劑、膠囊劑和溶液劑等。對于局部施用，產(chǎn)物可以配制成液體例如懸浮液或噴霧劑或氣霧劑(粉末或液體)、凝膠、霜劑、洗劑、糊劑、軟膏或藥膏等，或作為任何形式的敷料，例如繃帶、石膏、襯墊、條、拭子、海綿、墊等、帶有或不帶有固體支撐物或基底。此外，細(xì)菌可以設(shè)置(例如涂覆)在諸如植入物(例如假體植入物)、管、線或?qū)Ч艿鹊尼t(yī)療裝置的表面上。細(xì)菌可以以任何方便或期望的形式提供，例如，作為活性或生長中培養(yǎng)物或以凍干的或冷凍干燥的形式。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌菌株可以配制成用于局部或口服施用以治療皮膚或粘膜的表面?zhèn)?。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌菌株的益生菌產(chǎn)品。所述益生菌產(chǎn)品是例如藥物組合物，優(yōu)選用于口服施用。可選地，對于局部應(yīng)用，益生菌產(chǎn)品是例如洗劑或洗劑浸泡的傷口敷料，其包含根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌菌株。本發(fā)明的產(chǎn)品(即藥物組合物或裝置或敷料等)也可含有誘導(dǎo)劑(其中使用誘導(dǎo)型啟動子)。這可以作為產(chǎn)品的一部分提供(例如摻入或包括在敷料中)或單獨(dú)提供，例如作為試劑盒或組合產(chǎn)品的一部分，如上所定義。當(dāng)共同配制在產(chǎn)品(例如敷料或裝置)中時，可以以細(xì)菌與誘導(dǎo)物分開并在使用時放在一起(或使二者接觸)的形式提供細(xì)菌和誘導(dǎo)劑。例如，細(xì)菌和誘導(dǎo)劑可以在分開的隔室中，并在使用時放在一起(例如接觸或混合)，或者可以由屏障(例如膜或其它分隔物)分隔開，在使用時可以破壞或瓦解或打開該屏障?？蛇x地，可以將誘導(dǎo)劑單獨(dú)配制和提供(例如，在還含有細(xì)菌的試劑盒，或含有細(xì)菌的產(chǎn)品中)，并且可以在使用期間將誘導(dǎo)劑和細(xì)菌(或含有細(xì)菌的產(chǎn)品)放在一起(例如接觸)。這可以在施用給受試者之前、期間或之后進(jìn)行。例如，可以首先施用包含細(xì)菌的產(chǎn)品，然后可以將誘導(dǎo)劑加入或應(yīng)用于細(xì)菌。在另一個實(shí)施方案中，可以在施用前(例如，就在之前或緊接前)或在施用期間對細(xì)菌和誘導(dǎo)劑進(jìn)行預(yù)混合。當(dāng)以凍干或冷凍干燥的形式提供細(xì)菌時，可能期望在施用之前(例如在使用之前或使用期間)將細(xì)菌重構(gòu)或重新懸浮。這可以取決于傷口和所使用的產(chǎn)品的格式。例如，在存在一些傷口的情況下，可能出現(xiàn)足夠的液體以允許細(xì)菌被重構(gòu)/重新懸浮并變得活躍。然而，在其它實(shí)施方案中，可能需要提供用于將細(xì)菌重構(gòu)(或可替換地表達(dá)為，用于懸浮或重新懸浮)的液體。這可以在單獨(dú)的器皿(vessel)或容器(container)(例如作為試劑盒或組合產(chǎn)品的一部分)中或在容器或器皿或裝置的單獨(dú)隔室中提供。液體可以包含或含有誘導(dǎo)劑，或者當(dāng)存在誘導(dǎo)劑時，可以在單獨(dú)的器皿或容器或隔室中提供誘導(dǎo)劑。液體可以是任何用于重構(gòu)或懸浮冷凍干燥的細(xì)菌的合適的液體，例如，水或水溶液，或緩沖液或生長基或培養(yǎng)基。因此，作為示例，兩隔室系統(tǒng)(例如在敷料或裝置或容器或器皿(例如瓶)中)可以在包括一個隔室中的冷凍干燥的細(xì)菌和在另一個隔室中的液體。液體可以任選地含有誘導(dǎo)劑。在使用中或使用前，可以混合兩個隔室或使兩個隔室接觸，并施用于傷口。在更具體的實(shí)施方案中，可以以液體形式將細(xì)菌施用于傷口，然后可以施加單獨(dú)的敷料。因此，在一個簡單的實(shí)施方案中可以看出，試劑盒可以簡單地包含含有冷凍干燥的細(xì)菌的第一器皿或容器和含有用于重構(gòu)細(xì)菌的液體的第二器皿或容器。任選地，試劑盒還可以含有誘導(dǎo)劑，其也包含在第二器皿中或單獨(dú)的第三器皿或容器中。因此，例如，所述益生菌產(chǎn)品優(yōu)選包含能夠激活需要在乳酸細(xì)菌株中表達(dá)的蛋白質(zhì)的表達(dá)的活化肽。所述活化肽優(yōu)選為肽sppip(即包含seqidno：19的氨基酸序列的肽或與其具有至少80％序列同一性的序列)。對于皮膚傷口，所述傷口敷料可以包含在一個隔室中的冷凍干燥的細(xì)菌和另一隔室中的活化肽。當(dāng)施加于傷口時，將兩個隔室放在一起，以使細(xì)菌與活化肽接觸?？蛇x地，細(xì)菌可以包含在防水石膏的粘合劑側(cè)上的凝膠狀結(jié)構(gòu)中或與滲出物接觸的敷料的一側(cè)。在使用時，將活化肽手工施加于細(xì)菌，并將膏藥或敷料施加于傷口部位?；罹部梢园谒z體中，例如天然明膠。通過交聯(lián)可以將細(xì)菌摻入水膠體例如明膠膜中，對其進(jìn)行塑化和干燥，并在儲存期間使細(xì)菌保持活性直到水合作用?；罹部梢园庠诮宦?lián)的電紡絲水凝膠纖維中。在這種形式下，不需要對細(xì)菌進(jìn)行冷凍干燥。對于胃腸道中的傷口，設(shè)計(jì)包含至少兩個單獨(dú)的隔室的片劑，其中一個隔室包含冷凍干燥的細(xì)菌，而另一個隔室包含液體和活化肽。在攝取前擠壓片劑，以使分隔兩個隔室的內(nèi)膜被破壞并將內(nèi)容物混合在一起。對于口腔中(例如在牙齦上)的傷口，可以以高粘性糊劑施用根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌。具體地，用于局部施用于皮膚的制劑可以包括以藥學(xué)上可接受的載體施用的膏劑、霜劑、凝膠劑和糊劑?？梢圆捎萌绫绢I(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的油性或水溶性軟膏基質(zhì)來制備局部制劑。例如，這些制劑可以包括植物油、動物脂肪、更優(yōu)選從石油獲得的半固體烴類。采用的特定成分可以包括白色軟膏、黃色軟膏、乙酰酯蠟、油酸、橄欖油、石蠟、凡士林、白凡士林、鯨蠟、淀粉甘油酯、白蠟、黃蠟、羊毛脂、無水羊毛脂和單硬脂酸甘油酯。還可以使用各種水溶性軟膏基質(zhì)，包括例如二醇醚和衍生物、聚乙二醇、聚氧乙烯40硬脂酸酯和聚山梨醇酯。細(xì)菌菌株可以在提供基質(zhì)、固體支持物和/或傷口敷料中和/或上，以將活性物質(zhì)遞送到傷口。固體支持體或基質(zhì)可以是醫(yī)療裝置或其一部分。如本文所用，術(shù)語“基質(zhì)”或“固體支持物”和“傷口敷料”廣泛地指任何在針對傷口制備、并施加至傷口時以用于保護(hù)、吸收、引流傷口等的基質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了附著于或包含轉(zhuǎn)化的細(xì)菌菌株的傷口愈合材料或敷料，即敷料是用于施用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的載體。可選地，載體可以是石膏或繃帶。本發(fā)明可以包括市售可得的多種類型的基質(zhì)和/或襯墊物中的任何一種，傷口愈合材料的選擇將取決于待治療的傷口的性質(zhì)。下面簡要描述最常用的傷口敷料。透明膜敷料由例如聚氨酯、聚酰胺或明膠制成。這些合成膜對水蒸氣氧氣和其它氣體是可透過的，但對水和細(xì)菌是不可透過的，具有低吸水性，適用于低滲出物的傷口)，凝膠(與聚氨酯泡沫結(jié)合的親水膠體顆粒)，水膠體(含有大約至少60％的水的交聯(lián)聚合物，具有較高的吸收能力并且從傷口床中除去有毒成分并保持傷口部位的濕度水平和溫度)，泡沫(親水或疏水性，例如通過改性聚氨酯泡沫制成的聚合物泡沫敷料，具有良好的吸收性且對水蒸氣是可透過的)，海藻酸鈣(來自藻膠基團(tuán)的海藻酸鈣的非織造纖維復(fù)合物，藻酸鹽具有非常高的吸收能力。它們還促進(jìn)自溶清創(chuàng)，因?yàn)樵逅猁}和滲出物之間的離子交換將不溶性的藻酸鈣轉(zhuǎn)變成可溶性海藻酸鈉，為傷口床提供理想用于傷口愈合的濕潤的、完整的表面)和玻璃紙(纖維素與增塑劑)。根據(jù)為傷口提供的測量結(jié)果可以確定傷口的形狀和尺寸并根據(jù)確切部位定制傷口敷料。由于傷口部位在機(jī)械強(qiáng)度、厚度、敏感性等方面可能不同，所以可以將基質(zhì)模制成具體地解決該部位的機(jī)械需求和/或其它需求。例如，對于高度受神經(jīng)支配的位置，例如指尖，可以最小化襯底的厚度。其它傷口部位，例如手指、腳踝、膝蓋、肘部等可能暴露于更高的機(jī)械應(yīng)力并且需要多層基底。在另一方面，本發(fā)明提供了用于愈合人或動物受試者中傷口的方法，包括向需要其的人或動物受試者施用根據(jù)本發(fā)明的細(xì)菌菌株。所述細(xì)菌菌株優(yōu)選包含在如上所述的藥物組合物或傷口敷料中。在這樣的方法中，人或動物受試者由于潛在的醫(yī)療狀況優(yōu)選需要傷口愈合，該潛在的醫(yī)療狀況導(dǎo)致受損傷口愈合，例如減少的外周血液灌注(周圍動脈疾病)、高血糖或神經(jīng)病變。以下實(shí)施例中獲得并包含的結(jié)果證明了本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。特別地，與例如直接的蛋白質(zhì)制劑(即僅蛋白質(zhì)，無細(xì)菌)或只是單獨(dú)的細(xì)菌(未被修飾以表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)菌，例如不含重組質(zhì)粒)相比，通過利用本發(fā)明的表達(dá)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化細(xì)菌可以獲得改善的傷口愈合(例如，在更好或更快的傷口閉合方面)。此外，與施用從轉(zhuǎn)化的細(xì)菌培養(yǎng)物獲得的上清液相比，可以看到當(dāng)給傷口施用細(xì)菌時的改善的效果。因此，通過表達(dá)蛋白質(zhì)的乳酸細(xì)菌宿主將蛋白質(zhì)遞送到傷口是有利的。相信可能會有協(xié)同效應(yīng)。換句話說，細(xì)菌在傷口愈合的作用和蛋白質(zhì)在傷口愈合的作用之間可能存在協(xié)同作用。因此，在一些實(shí)施方案中，相對于相應(yīng)的未轉(zhuǎn)化細(xì)菌(即不含質(zhì)粒)的作用和蛋白質(zhì)當(dāng)作為蛋白質(zhì)提供時的作用(即不是從原位細(xì)菌表達(dá))，可能比轉(zhuǎn)化細(xì)菌對傷口愈合具有更大的累積效應(yīng)。在這方面相信細(xì)菌降低ph的作用，例如，在傷口部位可能有助于提高或增強(qiáng)或促進(jìn)蛋白質(zhì)的活性。雖然不希望受理論束縛，但還認(rèn)為根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化細(xì)菌的施用可以在提升創(chuàng)傷部位的巨噬細(xì)胞活性方面具有有益的作用。例如，可以增加巨噬細(xì)胞的數(shù)量。轉(zhuǎn)化細(xì)菌對傷口愈合的影響可能是或可能不是立即的，并且可能需要一些時間才能看到(在可以觀察到改善傷口愈合之前，例如，1、2、3、4、5或6個或更多小時可以看到或更長，例如8、10、12、15、18、20或24小時或更長，或1、2、3、4、5或6天或更多天可以看到，例如8、10、12、15、18、20或24天或更多天)。對于老年人的慢性傷口，可能需要更長時間才能看到治療組與對照組之間的差異，例如可能需要約12周。本發(fā)明的特別和重要的用途在于治療慢性傷口，特別是潰瘍，特別是治療糖尿病足潰瘍。糖尿病患者慢性足潰瘍患病率約為18％。2013年，歐洲人口達(dá)74250萬人，轉(zhuǎn)化成糖尿病患病人數(shù)達(dá)3270萬人，其中290-580萬人有慢性足潰瘍。這種類型的潰瘍的平均持續(xù)時間在幾個月的范圍內(nèi)，當(dāng)給予標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理時，少于25％的傷口在12周內(nèi)愈合。這種情況的最終階段是患肢的截肢。目前患有慢性足潰瘍的人的治療分為初級保健、家庭護(hù)理、養(yǎng)老院、親屬、自我管理和到醫(yī)院傷口診所的訪問。目前的治療依賴于采用手術(shù)清創(chuàng)術(shù)卸載、去除死亡組織、反復(fù)更換傷口敷料、全身性抗生素，并且在特殊情況下，用活的幼蟲或膠原酶治療以及在瑞典的幾個地方提供高壓氧治療。如果潛在病因還包括較大動脈阻塞，可以通過旁路靜脈移植來以手術(shù)方式矯正。如今，傷口每兩到三天進(jìn)行治療。用建議的經(jīng)過修飾的乳酸細(xì)菌以任何建議的形式或制劑進(jìn)行治療不會破壞該常規(guī)途徑。因此，通過本發(fā)明的治療來改善這些傷口的愈合因此將具有相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)利益以及對患者的個人利益。細(xì)菌是活性的，并且在體內(nèi)產(chǎn)生編碼的蛋白質(zhì)并將其遞送到傷口表面一段時間(例如約1小時)。它們可能會變得不活躍而死亡。緩慢的或死亡的乳酸細(xì)菌能夠在傷口/敷料環(huán)境中沒有風(fēng)險，直到敷料正常更換為止。與蛋白質(zhì)藥物化合物相比，根據(jù)本發(fā)明的生物治療劑將具有顯著更低的生產(chǎn)成本。這是因?yàn)樯镏委焺┲苯釉趥谥挟a(chǎn)生活性蛋白本身。開放性傷口如糖尿病足潰瘍以及足部功能喪失，引起相當(dāng)?shù)牟贿m，甚至致使患者的殘疾，并可能對生活質(zhì)量產(chǎn)生顯著的負(fù)面影響，包括重大風(fēng)險或感染以及因此長期使用抗生素，最終截肢。因此，改善的傷口愈合對患者將具有巨大的個人利益，并且還具有減少抗生素使用(以及因此抗生素耐藥性的擴(kuò)散)的益處。相信根據(jù)本發(fā)明治療這樣的慢性傷口可以增加傷口中的內(nèi)源性報(bào)警信號，并且在停滯不前的或慢性的傷口中開始愈合過程，并加速愈合時間。此外，本發(fā)明可以具有醫(yī)療人員使用的靈活性和易用性的優(yōu)點(diǎn)。附圖說明將參考以下非限制性實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述根據(jù)本發(fā)明的代表性方法和優(yōu)選實(shí)施方案，其中：圖1、mlrck1乳酸乳球菌隨著時間推移的生長(a)和ph(b)，mlrck1乳酸乳球菌來自過夜培養(yǎng)物的再次接種且起始o(jì)d0.285和0.51時加入10或50ng/ml啟動子活化肽sppip。圖2、羅伊氏乳桿菌r2lc中通過隨著時間進(jìn)行生物成像體外測量的plab112_luc的表達(dá)，羅伊氏乳桿菌r2lc來自起始o(jì)d0.5的過夜培養(yǎng)物的再次接種。獲取時間0的基線圖像。之后立即加入啟動子活化肽sppip(50ng/ml)和底物d-螢光素(150μg/ml)。在5分鐘時對板進(jìn)行成像，然后每30分鐘進(jìn)行成像持續(xù)1400分鐘。所有樣品中采用的介質(zhì)均為mrs。肽是啟動子活化肽sppip。每組由八個樣品組成。圖3、羅伊氏乳桿菌r2lc中的plab112_luc的表達(dá)，從過夜培養(yǎng)物重新接種至起始o(jì)d0.5并施用于1天齡的皮膚全層傷口。通過隨時間進(jìn)行非侵入性生物成像測量體內(nèi)表達(dá)。在具有1天齡皮膚全層傷口的5只麻醉小鼠上獲得時間0的基線圖像。然后將25μl用啟動子活化肽sppip(50ng/ml)激活的羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_luc和底物d-熒光素(150μg/ml)加入到傷口中間，在5分鐘的時候?qū)π∈筮M(jìn)行成像，然后每15分鐘進(jìn)行成像持續(xù)270分鐘。圖4、健康小鼠的傷口愈合時間。至傷口表面50％(a)、75％(b)或全部(100％)(c)愈合的時間，所有組n＝5。a、b、c，單因素方差分析，bonferroni比較所有列。圖5、健康小鼠隨時間推移的傷口尺寸(a)和傷口暴露(b)。每天從包含比例尺的圖像中測量傷口尺寸，所有組n＝5。a，雙因素方差分析，bonferroni比較所有列，d0-d5分析。由于時間和處理而改變。r2lc_plab112_lrck1.4在d1和d2與對照組相比使傷口的尺寸變小。b，單因素方差分析，bonferroni比較所有列，分析所有天。對于整個愈合過程，r2lc_plab112_lrck1.4使傷口暴露減少。圖6、傷口誘導(dǎo)前股動脈結(jié)扎的缺血誘導(dǎo)，所有組中n＝4。采用激光散斑對比分析，隨著時間的推移，在麻醉小鼠的缺血肢體(a)和對側(cè)相應(yīng)的未受影響的肢體(b)中測量皮膚血流量。數(shù)據(jù)按灌注單位(pfu)表示。a和b，雙因素方差分析，bonferroni比較所有列，分析d0-d7。沒有觀察到因?yàn)闀r間或處理的變化。圖7、傷口誘導(dǎo)時缺血小鼠的傷口愈合時間。至傷口表面50％(a)、75％(b)或全部(100％)(c)愈合的時間，所有組n＝4。a，b，c，單因素方差分析，bonferroni比較所有列。圖8、局部缺血的小鼠在傷口誘導(dǎo)時間和部位的隨時間推移的傷口尺寸和傷口暴露。每天從包含比例尺的圖像中測量傷口尺寸，所有組n＝4。a，雙因素方差分析，bonferroni比較所有列，分析d0-d7。由于時間和處理而改變。通過r2lc_plab112_lrck1.4在d1和d2與對照組相比傷口的尺寸變小。b，單因素方差分析，bonferroni比較所有列，分析所有天。對于整個愈合過程，r2lc_plab112_lrck1.4使傷口暴露減少。圖9、在采用單次注射一水合四氧嘧啶誘發(fā)糖尿病之后的體重(a)和血糖(b)。糖尿病對照組，n＝4，糖尿病r2lc_plab112_luc，n＝5，糖尿病r2lc_plab_lrck1.4，n＝4。a和b，雙因素方差分析，bonferroni比較所有列，分析d0-d6。沒有觀察到因?yàn)闀r間或處理的變化。圖10、傷口誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的傷口愈合時間。至傷口表面50％(a)、75％(b)或全部(100％)(c)愈合的時間，糖尿病對照組，n＝4，糖尿病r2lc_plab112_luc，n＝5，糖尿病r2lc_plab_lrck1.4，n＝4。a，b，c，單因素方差分析，bonferroni比較所有列。圖11、傷口誘導(dǎo)的糖尿病小鼠隨時間推移的傷口尺寸和傷口暴露。每天從含有比例尺的圖像中測量傷口尺寸，糖尿病對照組，n＝4，糖尿病r2lc_plab112_luc，n＝5，糖尿病r2lc_plab_lrck1.4，n＝4。a，雙因素方差分析，bonferroni比較所有列，分析d0-d6。由于時間而改變。b，單因素方差分析，bonferroni比較所有列，分析所有天。沒有差異(p＝0.08)。圖12、psip411質(zhì)粒。圖13、通過非侵入性生物成像(ivisspectrum)在11天(n＝10)內(nèi)通過檢測發(fā)光信號，定量在傷口邊緣的真皮中的質(zhì)粒表達(dá)(40μgdna)。圖14、健康小鼠的傷口愈合時間。至傷口表面50％(a)、75％(b)或全部(100％)(c)愈合的時間，(n＝8pctr，n＝9pcxcl12)。a、b、c，學(xué)生非配對雙尾t檢驗(yàn)。圖15、健康小鼠隨時間推移的傷口尺寸(a)和傷口暴露(b)。每天從包含比例尺的圖像中測量傷口尺寸(n＝8pctr，n＝9pcxcl12)。(a)雙因素方差分析，bonferroni比較所有列，分析d0-d7。由于時間而改變。(b)學(xué)生雙尾非配對t檢驗(yàn)。整個愈合過程pcxcl12使傷口暴露的趨勢(p＝0.08)減少。表16、以光密度(od)和菌落形成單位/ml(cfu/ml)表示的羅伊氏乳桿菌r2lc的細(xì)菌濃度的測量。圖17、用不同濃度的羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_lrck1.4處理的健康小鼠隨時間推移的傷口尺寸(a)和傷口暴露(b)。每天從包含標(biāo)度的圖像中測量傷口尺寸。a，雙因素方差分析，bonferroni比較所有列，分析d0-d2。由于時間和處理而改變。(a)雙因素方差分析bonferroni比較所有列，(b)單因素方差分析，bonferroni比較所有列(p<0.05)。與沒有接受處理的傷口相比，用羅伊氏乳桿菌r2lc__plab112_lrck1.4處理，在od0.2、0.5、1.0和1.25處，使傷口暴露減少。(對照，n＝15；od0.2，n＝4；0.5，n＝10，od1.0，n＝4；od1.25，n＝5)。圖18、在以不同濃度的鼠cxcl121α處理的健康小鼠中，每天在一個時間點(diǎn)隨時間推移(持續(xù)兩天)的傷口尺寸(a)和傷口暴露(b)。每天從包含比例尺的圖像中測量傷口尺寸。a，雙因素方差分析，bonferroni比較所有列，分析d0-d2。由于時間而改變。b，傷口暴露的最初兩天。(對照組，n＝15；0.2μgcxcl121α，n＝4；0.6μgcxcl121α，n＝5，1.0μgcxcl121α，n＝4)。圖19、每天每10分鐘一次持續(xù)1小時用0.2μg重組蛋白處理的健康小鼠隨時間推移的傷口尺寸(a)和傷口暴露(b)。每天從包含比例尺的圖像中測量傷口尺寸。a，雙因素方差分析，bonferroni比較所有列，分析d0-d2。由于時間而改變。b，傷口暴露的最初兩天。(無處理，n＝15；cxcl121α，n＝6；cxcl17，n＝9，ym1，n＝9)。圖20、在人皮膚表皮穿刺活檢傷口中測量的再上皮化。圖a顯示了在未使用或使用lb_luc或lb_lrck1處理的帶有具有表皮傷口的圓形皮膚培養(yǎng)24小時后在培養(yǎng)基中測量的ph。圖b顯示了在培養(yǎng)14天后，從傷口邊緣新長出的表皮套在暴露的真皮上的長度。*表示差異，單因素方差分析，bonferroni比較所選列(p<0.05)。圖21、通過隨時間推移進(jìn)行的生物成像在體外測量的從冷凍干燥狀態(tài)復(fù)蘇后立即在羅伊氏乳桿菌r2lc中體外表達(dá)plab112_luc。獲取時間0的基線圖像。然后立即加入啟動子活化肽sppip(50ng/ml)和底物d-熒光素(150μg/ml)。在5分鐘時對板成像，然后每5-15分鐘進(jìn)行成像持續(xù)930分鐘。所有樣品中使用的介質(zhì)均為mrs。肽是啟動子活化肽sppip。每組由四個樣品組成。圖22、通過隨時間推移進(jìn)行的生物成像在體內(nèi)測量的從冷凍干燥狀態(tài)復(fù)蘇并應(yīng)用于1天齡皮膚全層傷口上后立即在羅伊氏乳桿菌r2lc中體內(nèi)表達(dá)plab112_luc。在帶有兩個分開的1天齡皮膚全層傷口的3只麻醉小鼠上獲得時間0的基線圖像。然后將25μl用啟動子活化肽sppip(50ng/ml)激活的羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_luc和底物d-熒光素(150μg/ml)加入到傷口中間，并在5分鐘的時候?qū)π∈筮M(jìn)行成像，然后每15分鐘進(jìn)行成像持續(xù)270分鐘。圖23、用冷凍干燥、復(fù)蘇和誘導(dǎo)的羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_lrck1.4處理的健康小鼠隨時間推移的傷口尺寸(a)和傷口暴露(b)。每天從包含比例尺的圖像中測量傷口尺寸。(a)雙因素方差分析，bonferroni比較所有列，分析d0-d2。由于時間和處理而改變。(b)單因素方差分析，bonferroni比較所有列(p<0.05)。用羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_lrck1.4處理后，與當(dāng)細(xì)菌被冷凍干燥并直接復(fù)蘇，誘導(dǎo)并施用于傷口時的羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_luc相比，觀察到傷口尺寸減小，(r2lc_plab112_luc，n＝4，r2lc_plab112_lrck1.4，n＝5)。圖24、健康小鼠隨時間推移的傷口尺寸(a)和傷口暴露(b)。每天從包含比例尺的圖像中測量傷口尺寸。這種變化是隨著時間和處理，并且與ph7.35(p＝0.07)的懸浮液相比，cxcl121α在ph6.35中存在減小的傷口尺寸的趨勢(ph7.35；n＝8，ph6.35；n＝5，ph5.35；n＝4)。單因素方差分析，bonferroni比較所有列。圖25、健康小鼠隨時間推移的傷口尺寸(a)和傷口暴露(b)。每天從包含比例尺的圖像中測量傷口尺寸。觀察到的變化僅僅是由于時間的變化，在兩種不同細(xì)菌懸浮液(r2lc_plab112_luc；n＝4，r2lc_plab112_lrck1；n＝5)之間沒有差異。學(xué)生雙尾非配對t檢驗(yàn)。圖26、傷口誘導(dǎo)后兩天緊鄰傷口的皮膚中的在真皮(a)、表皮(b)和毛囊(c)切片中的cxcl121α水平的測量，其中傷口用羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_lrck1以od0.5、1.0和od1.25處理。單因素方差分析，bonferroni比較所有列。圖27、在對照傷口和使用羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_lrck1以od0.5、1.0和od1.25處理后的傷口，傷口誘導(dǎo)后2天在緊鄰傷口處的皮膚真皮(a)和表皮(b)中的f4/80+巨噬細(xì)胞密度的測量(對照，n＝15；0.5，n＝10，od1.0，n＝4；od1.25，n＝5)。單因素方差分析，bonferroni比較所有列。圖28、健康小鼠的傷口愈合時間。用以plab112轉(zhuǎn)化的乳酸乳球菌(l.l_plab112_lrck1)或?qū)φ杖樗崛榍蚓幚韨?。至傷口表?0％(a)、75％(b)或全部(100％)(c)愈合的時間，兩組n＝5。學(xué)生雙尾非配對t檢驗(yàn)。圖29、健康小鼠隨時間推移的傷口尺寸(a)和傷口暴露(b)。每天從包含比例尺的圖像中測量傷口尺寸，兩組均為n＝5。由于時間和處理而變化，并且與對照乳酸乳球菌相比，l.l_plab112_lrck1在d1至d4時使傷口尺寸減小。學(xué)生雙尾非配對t檢驗(yàn)。圖30、用重組趨化因子處理1小時的健康小鼠中傷口愈合的時間。至傷口表面50％(a)、75％(b)或全部(100％)(c)愈合的時間，(對照；n＝11，mcxcl121α；n＝6，mcxcl17；n＝8，mym1；n＝9)。單因素方差分析，bonferroni比較所有列。圖31、用重組趨化因子處理1小時的健康小鼠隨時間推移的傷口大小(a)和傷口暴露(b)。每天從包含比例尺的圖像測量傷口尺寸(對照；n＝11，mcxcl121α；n＝6，mcxcl17；n＝8，mym1；n＝9)。由于時間和處理而變化。與對照相比，cxcl121α、cxcl17和ym1使傷口尺寸減小。單因素方差分析，bonferroni比較所有列。圖32、不經(jīng)過或經(jīng)過不同處理的健康小鼠的最初24小時期間的傷口閉合。(無處理，n＝15；0.2μgcxcl121α，n＝4；0.6μgcxcl121α，n＝5；1.0μgcxcl121α，n＝4；0.2μgcxcl121α1小時，n＝6；0.2μgcxcl171小時，n＝9，0.2μgym11小時，n＝9；r2lc_plab112_lucod0.5，n＝4；r2lc_plab112_lrck1.4od0.2，n＝4；r2lc_plab112_lrck1.4od0.5，n＝10，r2lc_plab112_lrck1.4od1.0，n＝4；r2lc_plab112_lrck1.4od1.25；n＝5，冷凍干燥的r2lc_plab112_luc，n＝4，冷凍干燥的r2lc_plab112_lrck1.4，n＝5，r2lc_plab112_luc上清液；n＝4，r2lc_plab112_lrck1.4上清液，n＝5，pctr，n＝8；pcxcl12，n＝9)。對此數(shù)據(jù)集沒有進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。圖33、評估dss誘導(dǎo)的每日疾病活動(a)和第1-7天總疾病負(fù)擔(dān)(b)。以羅伊氏乳桿菌plab112_luc和plab112_lrck1.4(dss+載體；n＝5，dss+r2lc_plab112_luc；n＝6，dss+r2lc_plab112_lrck1.4；n＝7)進(jìn)行的處理使dss誘導(dǎo)的結(jié)腸炎疾病活動與用載體處理的對照組具有相似的改善，單因素方差分析，bonferroni比較所有列。圖34、評估dss誘導(dǎo)的每日疾病活動(a)和第1-8天總疾病負(fù)擔(dān)(b)。通過如前所述(參考文獻(xiàn)16)測量相關(guān)的臨床癥狀，評估疾病活動。箭頭表示開始處理。與用plab112_luc進(jìn)行處理相比，通過用羅伊氏乳桿菌plab112_lrck1.4的處理改善了dss誘發(fā)的結(jié)腸炎疾病活動。(dss+r2lc_plab112_luc；n＝6，dss+r2lc_plab112_lrck1.4；n＝6)，學(xué)生的雙尾非配對t檢驗(yàn)。圖35、在時間0和無處理、用r2lcluc或r2lclrck1處理24小時后，健康小鼠中誘導(dǎo)的皮膚全層傷口(5mm直徑)的代表性圖像。用在麻醉小鼠中拍攝包含比例尺的圖像。具體實(shí)施方式材料和方法基因構(gòu)建體設(shè)計(jì)和生產(chǎn)質(zhì)粒骨架plab112(等同于psip411；參考文獻(xiàn)11和15；表i)由larsaxelsson教授(挪威食品研究所)提供。乳酸乳球菌mg1363細(xì)菌用plab112轉(zhuǎn)化并擴(kuò)增24小時。然后純化質(zhì)粒，并在凝膠上驗(yàn)證dna產(chǎn)物。表i：psip411/plab112的主要特征特征位置(seqidno：20)復(fù)制決定簇(復(fù)制子區(qū)域)260-2010ermb(紅霉素抗性標(biāo)記物)2342-2840psppip(誘導(dǎo)型啟動子)3139-3290sppk(組氨酸蛋白激酶)3305-4647sppr(反應(yīng)調(diào)控因子)4653-5396gusa(β-葡萄糖醛酸酶)5853-7658porfx(誘導(dǎo)型啟動子)5689-5835轉(zhuǎn)錄終止子129-155；5428-5460；5602-5624多克隆位點(diǎn)1-35；5851-5856；7662-7673由瑞典農(nóng)業(yè)科學(xué)大學(xué)(slu)的stefanroos使用dna2.0(menlopark，ca，usa)對鼠cxcl12-1α的序列進(jìn)行優(yōu)化以利于在羅伊氏乳桿菌中翻譯。由質(zhì)粒載體pj204中的dna2.0在合成優(yōu)化的序列(seqidno：1)。由瑞典農(nóng)業(yè)科學(xué)大學(xué)(slu)的stefanroos使用genscript(piscataway，nj，usa)對人cxcl12-1α、鼠cxcl17、人cxcl17、鼠ym1和人ym1的序列進(jìn)行優(yōu)化以利于在羅伊氏乳桿菌中翻譯。經(jīng)過優(yōu)化的序列顯示為seqidno：4(人cxcl12-1α)；seqidno：7(鼠cxcl17)；seqidno：10(人cxcl17)；seqidno：13(鼠ym1)；和seqidno：16(人ym1)。設(shè)計(jì)引物用于檢測plab112中的插入片段(hcxcl12opt)，171bp：5’gcagccttaacagtcggcacct3’(seqidno：22)；5’acgtgcaacaatctgcaaagcac3’(seqidno：23)。插入片段的末端也被優(yōu)化用于繼續(xù)分子處理使得插入片段適合新的載體plab112。經(jīng)過優(yōu)化的mcxcl12opt序列在質(zhì)粒pj204中遞送。用pj204轉(zhuǎn)化大腸桿菌pk401。用neb2緩沖液中限制酶xhoi和ncoi切割質(zhì)粒(plab112和pj204)。然后將片段mcxcl12opt在凝膠上純化。然后使用t4dna連接酶將mcxcl12opt插入片段連接到plab112載體中，得到構(gòu)建體mlrck1。通過pcr驗(yàn)證plab112載體中的插入構(gòu)建體。然后通過序列分析(macrogen)驗(yàn)證構(gòu)建體。最后，用mlrck1轉(zhuǎn)化羅伊氏乳桿菌菌株r2lc和dsm20016，收集構(gòu)建體陽性的兩個r2lc克隆(4和7)，并通過序列分析(macrogen)再次驗(yàn)證來自這些菌落的質(zhì)粒mlrck1(現(xiàn)在為mlrck1.4和mlrck1.7)。以類似的方式按照相同的方案和程序生產(chǎn)質(zhì)粒hlrck1、mlrck2、hlrck2、mlrmp1和hlrmp2(見下表ii)。表ii：質(zhì)粒概述質(zhì)粒描述plab112與psip411相同(參考文獻(xiàn)15，seqidno：20)mlrck1帶有經(jīng)過優(yōu)化的mcxcl12-1α插入片段的plab112mlrck1.4來自經(jīng)過轉(zhuǎn)化的羅伊氏乳桿菌r2lc克隆4的mlrck1mlrck1.7來自經(jīng)過轉(zhuǎn)化的羅伊氏乳桿菌r2lc克隆7的mlrck1hlrck1帶有經(jīng)過優(yōu)化的hcxcl12-1α插入片段的plab112mlrck2帶有經(jīng)過優(yōu)化的mcxcl17插入片段的plab112hlrck2帶有經(jīng)過優(yōu)化的hcxcl17插入片段的plab112hlrmp1帶有經(jīng)過優(yōu)化的人ym1插入片段的plab112mlrmp2帶有經(jīng)過優(yōu)化的小鼠ym1插入片段的plab112plab112_luc帶有熒光素酶插入片段的plab112質(zhì)粒表達(dá)的體外分析過夜培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌r2lcplab112_lcc，再次接種并培養(yǎng)至od0.5時在96孔板上鋪板(200μl/孔)或立即從冷凍干燥制劑中直接重新懸浮。采用非侵入性生物成像(ivisspectrum，perkinelmer)測定發(fā)光強(qiáng)度。獲取時間0的基線圖像。然后立即加入活化肽sppip(50ng/ml)和d-熒光素(150μg/ml)。在5分鐘時對板進(jìn)行成像，然后1400分鐘內(nèi)每30分鐘進(jìn)行成像。利用livingimage3.1軟件(perkinelmer)量化數(shù)據(jù)，并保留成像參數(shù)以進(jìn)行比較分析。發(fā)光強(qiáng)度被認(rèn)為與質(zhì)粒表達(dá)成比例。動物實(shí)驗(yàn)由烏普薩拉地區(qū)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。使用小鼠c57b1/6(taconic)和c57b1/6背景的cx3cr1+/gfp(最初來自jackson實(shí)驗(yàn)室)。動物在實(shí)驗(yàn)過程中可以自由獲取水分和食物。傷口誘導(dǎo)將小鼠麻醉(1-3％異氟醚，200ml/min)，通過剃毛然后將脫毛霜敷用1分鐘(用水洗去)而去除后肢上的毛。使用無菌穿刺活檢針(5mm直徑)誘導(dǎo)全層(表皮、真皮和皮下)傷口。最初5天每日局部敷用外用止痛藥(embla霜)。局部傷口處理每天用25μl鹽水、羅伊氏乳桿菌r2lcplab112_luc或r2lcplab112_lrck1處理傷口。過夜培養(yǎng)細(xì)菌，再次接種并培養(yǎng)至od0.5，在施用活化肽sppip(50ng/ml)前預(yù)活化5分鐘，并局部地添加到傷口表面的中間。對于劑量實(shí)驗(yàn)，每天用25μl鹽水或來自過夜培養(yǎng)物再次接種并生長至od0.5、施用活化肽sppip(50ng/ml)前預(yù)活化5分鐘、并且并以od0.2、0.5、1.0或1.25的濃度局部地添加到傷口表面的中間的羅伊氏乳桿菌r2lcplab112_lrck1處理傷口。對于各種蛋白質(zhì)的比較實(shí)驗(yàn)，每天用10μl鹽水或鼠cxcl12、cxcl17或ym1(60μl鹽水中總共200ng蛋白質(zhì)，以10分鐘間隔給予1小時)處理傷口。對于cxcl12的劑量遞增研究，每天一次在同一個時間點(diǎn)，將10μl鹽水中200ng、600ng或1μgcxcl12添加到傷口。質(zhì)粒表達(dá)的體內(nèi)分析將羅伊氏乳桿菌r2lcplab112_luc過夜培養(yǎng)，再次接種并培養(yǎng)至od0.5。采用用非侵入性生物成像(ivisspectrum，perkinelmer)測定發(fā)光強(qiáng)度。獲取時間0的基線圖像。然后在傷口中間加入25μl的羅伊氏乳桿菌r2lcplab112_luc。在施用活化肽sppip(50ng/ml)和d-熒光素(150μg/ml)前將細(xì)菌預(yù)活化5分鐘。270分鐘內(nèi)每15分鐘對小鼠進(jìn)行成像。利用livingimage3.1軟件(perkinelmer)量化數(shù)據(jù)，并保留成像參數(shù)以進(jìn)行比較分析。發(fā)光強(qiáng)度被認(rèn)為與質(zhì)粒表達(dá)成比例。傷口尺寸和外觀監(jiān)測通過獲取常規(guī)照片，中每日監(jiān)測麻醉小鼠(1-3％異氟烷，200ml/min)的傷口尺寸和外觀。在采集圖像中包括比例尺，并利用imagej(nih的免費(fèi)軟件)分析傷口尺寸。當(dāng)尺寸<0.5mm2時，傷口被認(rèn)為是愈合的。皮膚血流監(jiān)測采用非侵入性激光散斑對比分析測量麻醉(1-3％異氟烷，200ml/min)小鼠帶有愈合中傷口的整個后肢中的血流量，并分析數(shù)據(jù)pimsoft3(perimed)。在兩分鐘內(nèi)以10幅圖像/秒對肢體(讀框1.4×1.4cm)成像，平均為20次。數(shù)據(jù)按灌注單位(pfu)表示。減少灌注麻醉小鼠(1-3％異氟醚，200ml/min)，并通過結(jié)扎和切除腹壁淺動脈分支上方的股動脈誘導(dǎo)后肢缺血。誘導(dǎo)高血糖癥將單次劑量的即溶于無菌鹽水中的一水合四氧嘧啶(8mg/ml，1μl/g體重)注入尾靜脈。在整個實(shí)驗(yàn)中每天監(jiān)測血糖和體重。高血糖定義為血糖>16.7mmol/l。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以平均值±sem表示。采用雙因素方差分析與bonferroni比較所有列的事后檢驗(yàn)以分析愈合過程隨時間的變化。采用單因素方差分析與bonferroni比較所有列的事后檢驗(yàn)以分析n>2的組的一個時間點(diǎn)的愈合過程，并且當(dāng)n＝2采用學(xué)生非配對雙尾t檢驗(yàn)來分析一個時間點(diǎn)的愈合過程。p<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)施例1：用質(zhì)粒lrck1轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的生長過夜培養(yǎng)含有mlrck1的乳酸乳球菌，再次接種并生長至od0.3或0.5時，當(dāng)加入10或50ng/ml活化肽sppip(seqidno：19)時，顯示無生長障礙。在這些生長實(shí)驗(yàn)期間，測量ph，并且在生長階段中降低最多，然后當(dāng)生長為中間培養(yǎng)基(mes-medium)時穩(wěn)定在ph6.7左右(圖1)。(皮膚ph＝5.5，傷口ph＝7.15-8.9，其中堿性ph與較低的愈合率相關(guān)(參考文獻(xiàn)14))實(shí)施例2：質(zhì)粒plab112_luc的表達(dá)從過夜培養(yǎng)物再次接種并生長2小時的羅伊氏乳桿菌r2lc中的質(zhì)粒plab112_luc的體外表達(dá)保持高達(dá)超過600分鐘(10小時)。未經(jīng)活化肽sppip活化的質(zhì)粒沒有泄漏/表達(dá)(圖2)。當(dāng)將從過夜培養(yǎng)物再次接種并生長2小時羅伊氏乳桿菌r2lc(具有plab112_luc)置于麻醉小鼠的1天齡皮膚全層傷口中時，細(xì)菌僅限于傷口部位，質(zhì)粒表達(dá)在第一小時高，但是超過4小時檢測到信號(圖3)。實(shí)施例3：健康小鼠中改善的傷口愈合在愈合過程中每天監(jiān)測傷口。與傷口未施加任何物質(zhì)的對照小鼠以及每天施加對照羅伊氏乳桿菌r2lc(plab112_luc)的小鼠相比，每天單次施加羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_mlrck1.4的健康小鼠減少了至傷口表面75％閉合和至傷口表面100％閉合的時間(圖4)。傷口誘導(dǎo)后最初幾天，羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_mlrck1.4對傷口愈合的影響最為突出。當(dāng)與傷口沒有施用任何物質(zhì)的對照小鼠進(jìn)行比較時，通過每天施用(傷口誘導(dǎo)后一天和兩天)羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_mlrck1.4進(jìn)一步減小傷口的尺寸。與傷口沒有施加任何物質(zhì)的對照小鼠相比，該組中作為曲線下的面積測定的總傷口暴露量也減少(圖5)。圖35顯示了在健康小鼠中誘導(dǎo)的全層皮膚傷口在時間0以及不進(jìn)行處理、用r2lcluc或r2lclrck1處理后24小時的代表性圖像。實(shí)施例4：在具有組織灌注受損的健康小鼠中改善的傷口愈合通過結(jié)扎傷口所在肢體的股動脈，在傷口誘導(dǎo)的那一天，皮膚灌注減少了50％(圖6和表iii)。與傷口未施加任何物質(zhì)的對照小鼠以及每天施加對照羅伊氏乳桿菌r2lc(plab112_luc)的小鼠相比，在局部缺血的小鼠中，每天單次施用羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_mlrck1.4導(dǎo)致至傷口表面50％和75％閉合的時間減少(圖7)。另外在皮膚灌注減少的小鼠中，傷口誘導(dǎo)后的最初幾天，羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_mlrck1.4對傷口愈合的影響最為突出。與傷口沒有施加任何物質(zhì)的對照小鼠相比，在傷口誘導(dǎo)后一天和兩天通過每天施用羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_mlrck1.4減小傷口的尺寸。與傷口沒有施加任何物質(zhì)的對照小鼠相比，該組的總傷口暴露量也降低(圖8)。表iii：通過激光斑點(diǎn)對比分析測量麻醉小鼠的基礎(chǔ)皮膚灌注。數(shù)據(jù)表示為按灌注單位(pfu)計(jì)的平均值±sem，n＝4。健康的缺血的減少量(％)對照62.5±4.334.0±1.846r2lc_plab112_luc57.3±2.731.3±1.146r2lc_plab112_lrck1.465.0±7.230.8±0.452實(shí)施例5：在高血糖小鼠中的改善的傷口愈合使用四氧嘧啶使小鼠成為糖尿病患者，之后其在傷口愈合過程中保持高血糖(＞16.7mmol/l)，并且體重不降低(圖9)。與傷口未施加任何物質(zhì)的對照小鼠以及每天施加對照羅伊氏乳桿菌r2lc(plab112_luc)的小鼠相比，每天單次施加羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_mlrck1.4的糖尿病小鼠中減少了至75％傷口表面閉合的時間(圖10)。與每天施用含有l(wèi)uc的羅伊氏乳桿菌r2lc以及傷口沒有施加任何物質(zhì)的對照小鼠相比，每天施加羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_mlrck1.4的糖尿病小鼠中具有減少傷口暴露的趨勢(p＝0.08)(圖11)。實(shí)施例6：用編碼cxcl12的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的傷口邊緣的真皮中的cxcl12皮膚過表達(dá)在具有cmv啟動子(seqidno：24)(v260-20，invitrogen，waltham，ma，usa)的pvax1骨架上構(gòu)建質(zhì)粒，并如前所述(參考文獻(xiàn)18)引入被稱為pctr(seqidno：25)的插入片段-copgfp-t2a-luc2-或被稱為pcxcl12(seqidno：26)的-cxcl12-p2a-copgfp-t2a-luc2-。將cxcl12的分泌序列用鼠igg分泌序列替代。因此，pctr質(zhì)粒編碼gfp(綠色熒光蛋白)和熒光素酶，但沒有趨化因子。將質(zhì)粒(40μg在總體積為100μl鹽水中)注射到傷口邊緣四個位置的真皮中。基于麻醉前10分鐘腹膜內(nèi)注射d-螢光素(150mg/kg，#122796，perkinelmer，waltham，ma，usa)后的熒光素酶活性隨時間而進(jìn)行測量轉(zhuǎn)基因表達(dá)，利用生物成像裝置(ivisspectrum,perkinelmer)進(jìn)行圖像采集。利用livingimage3.1軟件(perkinelmer)量化數(shù)據(jù)，并保留成像參數(shù)以進(jìn)行比較分析。還保留了選擇感興趣區(qū)域減去對側(cè)參考區(qū)域的設(shè)置。發(fā)光強(qiáng)度被認(rèn)為與質(zhì)粒表達(dá)成比例。采用非侵入性生物成像測量來自傷口邊緣真皮的質(zhì)粒表達(dá)，并與由與cxcl12表達(dá)相當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒編碼的熒光素酶產(chǎn)生的光相關(guān)聯(lián)。表達(dá)在第2天達(dá)到峰值，然后隨著傷口閉合和真皮重建而下降(圖13)。與pctr相比，cxcl12的過度表達(dá)并沒有導(dǎo)致加速完全傷口愈合，而是導(dǎo)致傷口表面75％閉合的時間縮短(圖14)。在傷口誘導(dǎo)和真皮轉(zhuǎn)染后第4-6天，與pctr相比，通過pcxcl12真皮表達(dá)使傷口表面減小(圖15)。這些結(jié)果表明，利用該系統(tǒng)將cxcl12遞送到傷口，開始的24小時沒有明顯的效果，而在稍后的時間點(diǎn)效果更小。實(shí)施例7：使用luc和lrck1進(jìn)行局部處理的羅伊氏乳桿菌劑量效應(yīng)將乳桿菌從過夜培養(yǎng)物中再次接種并生長至od0.5，然后在mrs中稀釋或濃縮至od0.2、0.5、1.0和1.25。將四種不同濃度稀釋10倍至10-9，將10μl每個樣品鋪板在含有紅霉素的mrs瓊脂上，并在37℃、5％二氧化碳過夜的厭氧培養(yǎng)室中過夜培養(yǎng)。對板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，濃度以每ml菌落形成單位(cfu/ml)表示。對于劑量實(shí)驗(yàn)，用25μl生理鹽水或羅伊氏乳酸桿菌r2lcplab112_lrck1.4每天處理傷口持續(xù)兩天，該羅伊氏乳酸桿菌r2lcplab112_lrck1.4來自過夜培養(yǎng)物的再次接種并培養(yǎng)至od0.5，在施用活化肽sppip(50ng/ml)前預(yù)活化5分鐘，然后并以od0.2、0.5、1.0或1.25的濃度局部地添加到傷口表面的中間。在25μl的od0.5中有5×107個細(xì)菌(2×109cfu/ml)，意味著1000倍的劑量跨度。通過光密度測量細(xì)菌濃度，并且每毫升的菌落形成單位顯示在圖16中。在施用至傷口之前培養(yǎng)并活化的最低劑量(od0.2等于2×107細(xì)菌)的r2lc__plab112_lrck1.4導(dǎo)致在24小時后最小的傷口尺寸，所有四種不同濃度導(dǎo)致傷口誘導(dǎo)后24和48小時顯著加速的傷口閉合(圖17a)，因此導(dǎo)致與沒有接受處理的傷口相比，前48小時傷口暴露減少(圖17b)。這些結(jié)果表明，與未接受處理的傷口相比，開始的48小時施用的劑量是最低劑量103倍(od1.25等于1×1010細(xì)菌)，這產(chǎn)生了最大效果也顯著加速了傷口愈合，并且與產(chǎn)生最大傷口閉合的劑量達(dá)到相同的程度。對于給予最高劑量的傷口，沒有觀察到引起炎癥或其它負(fù)面副作用的跡象。數(shù)據(jù)顯示即使低劑量的羅伊氏乳桿菌r2lc_lrck1也能加速傷口愈合。實(shí)施例8：作為局部處理的mcxcl121α蛋白質(zhì)的劑量遞增為了研究施用至傷口表面的mcxcl121α的劑量的影響，將0.2μg、0.6μg或1μg的mcxcl121α(rndsystems)溶解在10μl鹽水中每日遞送至傷口，共兩日。施用是每天一次。與無處理相比，每天一次在單獨(dú)的時間點(diǎn)遞送mcxcl121α在最初兩天不會加速傷口愈合(圖18a，b)。這些數(shù)據(jù)表明，cxcl121α的連續(xù)遞送導(dǎo)致加速的傷口愈合，因?yàn)樵谧畛?8小時，每天在一小時內(nèi)以10分鐘間隔給予總共0.2μgmcxcl121α使愈合加速(圖18和19)。實(shí)施例9：人皮膚活組織檢查中的再上皮化測定在烏普薩拉大學(xué)醫(yī)院進(jìn)行常規(guī)乳房縮小術(shù)的健康白人婦女同意捐贈而獲得無菌正常人體皮膚。用補(bǔ)充有2％小牛血清(hyclone，hyclonelaboratories，loganusa)的生理dmem覆蓋樣品，并在無菌條件下運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。如前所述(參考文獻(xiàn)17)，除去皮下組織，并利用6mm皮膚活檢穿孔機(jī)(integramiltex，york，pa，usa)和無菌剪刀切下剩余的真皮和表皮。在每個6毫米直徑的圓形皮膚的中心，利用3mm皮膚活檢穿孔機(jī)和無菌剪刀去除表皮。然后將樣品逐個置于無菌的24孔板中，使表皮面向上。所有培養(yǎng)基(dmem)補(bǔ)充有bsa，2或10％和抗生素(紅霉素sigmaaldrich，buchs，swizerland，10μg/ml)。為了維持真皮側(cè)的營養(yǎng)物質(zhì)，即皮膚真皮側(cè)最高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)，向每個孔中加入0.5ml培養(yǎng)基且每天更換培養(yǎng)基。隨著更換培養(yǎng)基的同時，將10μlmrs中的106個羅伊氏乳桿菌r2lc_luc或羅伊氏乳桿菌r2lc_lrck1置于浮動圓形皮膚中表皮傷口的中間。接種細(xì)菌并使其生長在mrs中2-4小時，以使其處于指數(shù)期。將樣品在37℃、5％二氧化碳和95％濕度下孵育14天。將樣品從中間切開，將一半在4％、ph7.38甲醛中過夜固定，并通過乙醇-二甲苯系列脫水，最后將其包埋在石蠟中。對從樣品中心部分開始的橫截面(10μm)進(jìn)行安裝、脫蠟、再水化，并用蘇木精和曙紅染色。利用具有徠卡dfc420c相機(jī)和planfluot40×0.7na物鏡的leicaleitsdmrb拍攝圖像。利用imagej(nih)在圖像中測量再上皮化或表皮套長度。向培養(yǎng)物中的圓形皮膚加入乳桿菌，在24小時后測量時，降低了培養(yǎng)基的ph(圖20a)。當(dāng)培養(yǎng)基中存在10％fcs時，圓形皮膚中誘導(dǎo)的傷口邊緣的表皮增殖以覆蓋暴露的真皮，并且當(dāng)被培養(yǎng)在含有2％fcs的培養(yǎng)基中14天后培養(yǎng)物中圓形皮膚的幾乎沒有增殖(圖20b)。在用r2lcplab112luc或r2lcplab112_lrck1處理的圓形皮膚中檢測不到肉眼可見的有害影響，并且在用r2lcplab112_lrck1處理14天的圓形皮膚盤中的傷口上測量到增加的再上皮化(圖20b)。實(shí)施例10：冷凍干燥和復(fù)蘇后細(xì)菌的功能測試了不同的方案和35種不同的冷凍干燥配方，并且測定了直到兩個月的活力。另外，以與大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)相同的設(shè)置，并且根據(jù)良好的制造實(shí)踐，還生產(chǎn)了一大批冷凍干燥的羅伊氏乳桿菌。在-20至40℃的溫度范圍內(nèi)儲存長達(dá)兩個月后，對該批次的冷凍干燥樣品的活性進(jìn)行了分析。通過加入等量體積的水或含有sppip(50ng/ml)的mrs培養(yǎng)基來復(fù)蘇冷凍干燥的細(xì)菌，然后通過將其鋪板于96孔板中或?qū)⑵渲苯邮┘佑谌缟纤龅?日齡的傷口上以立即分析體內(nèi)和體外的表達(dá)。采用最有前景的配方，活性從冷凍干燥后即刻至兩個月時對儲存在+4℃的樣品進(jìn)行測量是穩(wěn)定?；钚栽谀壳白鳛樯攀逞a(bǔ)充劑銷售的冷凍干燥的細(xì)菌的可接受的范圍之內(nèi)。在冷凍干燥的羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_luc復(fù)蘇后直接測量質(zhì)粒表達(dá)顯示出立即誘導(dǎo)表達(dá)，其在450分鐘后達(dá)到峰值，然后下降(圖21)。24小時后(1440分鐘)沒有表達(dá)，沒有活細(xì)菌。當(dāng)冷凍干燥的羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_luc被復(fù)蘇時，用50ng/ml(sppip)誘導(dǎo)并立即置于小鼠的皮膚傷口上(5×107/25μl)，表達(dá)直接增加并在約1小時內(nèi)都高(圖22)，以在溶液中添加新鮮的生長階段的細(xì)菌時所見的相似模式(圖3)。測試對傷口愈合的影響，其中冷凍干燥細(xì)菌(5×107/25μl)再次復(fù)蘇、誘導(dǎo)并立即置于小鼠的皮膚傷口上。每天監(jiān)測傷口持續(xù)兩天，用羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_lrck1處理的傷口與使用該方案的羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_luc(圖23)處理的傷口相比，顯示出加速的愈合。這些數(shù)據(jù)顯示，羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112不必被預(yù)先培養(yǎng)成指數(shù)生長期以便產(chǎn)生和遞送足夠的cxcl12以加速體內(nèi)傷口愈合。實(shí)施例11：趨化因子信號傳導(dǎo)的ph依賴性作用趨化因子可以作為單體、與自身或與其它趨化因子相互作用的二聚體或多聚體出現(xiàn)(參考文獻(xiàn)22)。不同的組合和構(gòu)象誘導(dǎo)不同的受體信號傳導(dǎo)和因此不同的細(xì)胞反應(yīng)(參考文獻(xiàn)34)。這是一個新的未開發(fā)的領(lǐng)域，可能性的組合取決于局部組織微環(huán)境。局部ph也會影響局部巨噬細(xì)胞功能(參考文獻(xiàn)23)。為了研究趨化因子效力的ph依賴性影響，將ph為7.35、6.35或5.35的10μl鹽水中的0.2μgcxcl121α每天施加于傷口施加兩天。改變含有趨化因子的緩沖液中的ph對于經(jīng)過處理的傷口的愈合模式具有影響，并且與cxcl12懸浮在ph為7.35的鹽水中相比，當(dāng)cxcl12懸浮于ph為6.35的鹽水中時，在傷口誘導(dǎo)后一天存在較小傷口尺寸的趨勢(p＝0.07)(圖24)。這些數(shù)據(jù)表明，在誘導(dǎo)加速的傷口愈合的方面，6.35的ph增強(qiáng)了施加于傷口表面的重組cxcl12的作用。實(shí)施例12：細(xì)菌在趨化因子遞送到的傷口表面位點(diǎn)的效果重要性為了用新鮮上清液進(jìn)行傷口治療，將羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_luc和r2lc_plab112_lrck1在37℃下接種至10mlmrs中，生長至od0.5，離心(>2000rpm，5分鐘)，重懸于1mlmrs中，活化(sppip，50ng/ml)并生長4小時。然后將樣品離心(>2000rpm，5分鐘)，并保留上清液。然后將25μl的該上清液每日一次施用于傷口持續(xù)兩天。在將來自誘導(dǎo)的羅伊氏乳桿菌的新鮮上清液在傷口誘導(dǎo)之后每天添加至傷口中添加兩天的模型中證實(shí)了通過羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_lrck1直接向傷口表面細(xì)菌遞送cxcl121α的重要性。用來自羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_luc或r2lc_plab112_lrck1的新鮮上清液處理的傷口尺寸或總傷口暴露(p＝0.2595)沒有差異(圖25)。實(shí)施例13：乳酸桿菌(lactobacillus)遞送的cxcl12增加傷口周圍皮膚中cxcl12的水平為了定量分析，在實(shí)驗(yàn)的最后一天除去傷口周圍的皮膚(距離傷口0-100μm)，并在液氮中快速冷凍并切片(10μm)。固定于冰冷的甲醇中(10分鐘)并在0.5％triton-x中透化(15分鐘)后，將組織與靶向cxcl121α的抗體(多克隆抗體，abcam)孵育，用巨噬細(xì)胞抗原f4/80(克隆bm8，ebioscience)沖洗，并與匹配的偶聯(lián)到alexafluor488和nordiclights557(invitrogen)上的二抗進(jìn)行孵育。在利用在線掃描共聚焦顯微鏡(zeisslsm5live，帶有0.5光學(xué)變焦的壓電電機(jī)控制的wplanapo40×/1.0，zeiss，oberkochen，germany)之前，對組織進(jìn)行最后洗滌并安裝(fluoromount，#0100-10，southernbiotech，birmingham，al，usa)。利用imagej(nih)和imaris軟件8.2(bitplane，zurich，switzerland)在圖像中定量蛋白質(zhì)水平和巨噬細(xì)胞。在采集期間保持顯微鏡設(shè)置以進(jìn)行比較。cxcl121α測量值以平均熒光強(qiáng)度(mfi)表示。與未接受處理的傷口旁邊的皮膚相比，用不同劑量的羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_lrck1每日一次處理傷口兩天，導(dǎo)致傷口旁邊皮膚中的cxcl121α的皮膚組織水平增加(圖26)。這在真皮和表皮和在毛囊中都是一樣的。實(shí)施例14：遞送的乳酸桿菌cxcl12增加傷口周圍皮膚的巨噬細(xì)胞當(dāng)將od0.2和od0.5的羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_lrck1施加于傷口時，與沒有接受處理的傷口旁邊的真皮相比，用不同劑量的羅伊氏乳桿菌r2tc_plab112_lrck1每日一次處理傷口兩天，導(dǎo)致傷口誘導(dǎo)后兩天傷口附近真皮中f4/80+巨噬細(xì)胞的密度增加(圖27a)。當(dāng)將od1.25的羅伊氏乳桿菌r2lc_plab112_lrck1施加于傷口表面時，與沒有接受處理的傷口旁邊的表皮相比，在傷口誘導(dǎo)后2天的傷口旁邊的表皮中的f4/80+巨噬細(xì)胞增加(圖27b)。實(shí)施例15：使用乳酸乳球菌對傷口愈合加速的影響的驗(yàn)證為了表明由細(xì)菌產(chǎn)生的特定趨化因子的局部和連續(xù)遞送對于與細(xì)菌菌株無關(guān)的機(jī)制是重要的，另外一種菌株被用于產(chǎn)生并將趨化因子直接遞送到傷口表面，乳酸乳球菌用plab112(mlrck1)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。按照與采用羅伊氏乳桿菌處理的相同方案，將細(xì)菌每天一次施用于健康小鼠的全層傷口。有明顯的趨勢，mcxcl121α遞送加速了傷口閉合(圖28)，并減少了該模型中的傷口尺寸和暴露(圖29)。實(shí)施例16：通過用作為重組蛋白遞送的mcxcl121α、mcxcl17和mym1處理對傷口閉合的隨時間的適度作用為了說明乳酸細(xì)菌的輸送方式和連續(xù)蛋白質(zhì)生產(chǎn)對于機(jī)制是重要的，將鼠重組mcxcl121α、mcxcl17、mym1(總共200ng在60μl中，全部rnd系統(tǒng))或作為對照的鹽水(10μl)每天遞送至傷口每次10分鐘持續(xù)一小時。對mcxcl121α，將30ng遞送至腹膜腔在3小時內(nèi)誘導(dǎo)了免疫細(xì)胞募集的顯著增加，這就是將200ng遞送至25μm2的面積視為高劑量的原因。當(dāng)趨化因子在一個單獨(dú)時間點(diǎn)作為重組蛋白質(zhì)給藥時，傷口中的高蛋白酶活性可能降解趨化因子，因此由細(xì)菌重新產(chǎn)生的蛋白質(zhì)是增加傷口閉合所需要的。此外，乳酸細(xì)菌也可能為傷口愈合提供有益的局部環(huán)境(圖1b、4、5、24、30和31)。實(shí)施例17：不同處理對健康小鼠傷口閉合的影響的比較對所有進(jìn)行的不同處理分析健康小鼠中最初24小時的傷口閉合(圖32)。很明顯，在一個時間點(diǎn)施用于傷口的羅伊氏乳桿菌r2lc_luc或低單劑量cxcl121α的處理可以影響最初24小時期間的愈合。雖然在一個小時內(nèi)每隔10分鐘將cxcl121α、cxcl17和ym1遞送至傷口表面在最初24小時內(nèi)有加速傷口閉合的趨勢，但是當(dāng)通過羅伊氏乳桿菌r2lc_lrck1在一個小時內(nèi)將cxcl121α連續(xù)遞送至傷口表面時，這種作用更為明顯。通過真皮過表達(dá)遞送cxcl12，而對24小時傷口閉合有不利影響。實(shí)施例18：通過含有plab112_mlrck1.4的羅伊氏乳桿菌在粘膜表面加速傷口愈合為了測試cxcl12局部連續(xù)遞送到受傷的表面是否通過皮膚上皮和腸上皮的總體機(jī)制起作用，采用dss誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的兩個實(shí)驗(yàn)方案。已知dss(葡聚糖硫酸鈉)在結(jié)腸粘膜表面誘導(dǎo)創(chuàng)傷(參考文獻(xiàn)16)。對于第一個方案，在14天內(nèi)每天一次灌胃羅伊氏乳桿菌(1mlod0.5，旋轉(zhuǎn)并重懸于0.1ml)來處理小鼠，同時飲用水中第7-14天給予dss。由于這種采用該方案的羅伊氏乳桿菌菌株定居在結(jié)腸中，所以目的是評估當(dāng)引起結(jié)腸炎時，與羅伊氏乳桿菌plab112_luc相比，在結(jié)腸中是否存在羅伊氏乳桿菌plab112_mlrck1是有益的。第二個方案旨在治療明顯的結(jié)腸炎，小鼠在1-8日飲用水中給予dss，而在第5-8天，每天通過灌胃接受羅伊氏乳桿菌三次。基于臨床參數(shù)(包括體重減輕、糞便一致性和血容量)評估結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度，并且使用疾病活動指數(shù)(dai)表示，dai是cooper及其同事詳細(xì)描述的評分方法(參考文獻(xiàn)16)。通過用羅伊氏乳桿菌plab112_luc和plab112_lrck1.4進(jìn)行預(yù)處理，dss誘導(dǎo)的結(jié)腸炎疾病活動有類似的改善(圖33)，其表明影響僅是由于羅伊氏乳桿菌。相比之下，當(dāng)將羅伊氏乳桿菌plab112_lrck1.4施用于結(jié)腸炎的小鼠時，疾病進(jìn)程得到改善，該現(xiàn)象在用plab112_luc處理時未觀察到，表明所遞送的趨化因子的作用。參考文獻(xiàn)1.demidova-ricetn,hamblinmrandhermanim.acuteandimpairedwoundhealing:pathophysiologyandcurrentmethodsfordrugdelivery,part1:normalandchronicwounds:biology,causes,andapproachestocare.advancesinskin&woundcare.2012；25:304-14.2.demidova-ricetn,hamblinmrandhermanim.acuteandimpairedwoundhealing:pathophysiologyandcurrentmethodsfordrugdelivery,part2:roleofgrowthfactorsinnormalandpathologicalwoundhealing:therapeuticpotentialandmethodsofdelivery.advancesinskin&woundcare.2012；25:349-70.3.salcedor,wassermank,youngha,grimmmc,howardomz,anvermr,kleinmanhk,murphywjandoppenheimjj.vascularendothelialgrowthfactorandbasicfibroblastgrowthfactorinduceexpressionofcxcr4onhumanendothelialcells:invivoneovascularizationinducedbystromal-derivedfactor-1α.theamericanjournalofpathology.1999；154:1125-1135.4.hattermannk,sebenss,helmo,schmittad,mentleinr,mehdornhmandheld-feindtj.chemokineexpressionprofileoffreshlyisolatedhumanglioblastoma-associatedmacrophages/microglia.oncologyreports.2014；32:270-6.5.badilloat,chungs,zhangl,zoltickpandliechtykw.lentiviralgenetransferofsdf-1alphatowoundsimprovesdiabeticwoundhealing.thejournalofsurgicalresearch.2007；143:35-42.6.leewy,wangcj,linty,hsiaoclandluocw.cxcl17,anorphanchemokine,actsasanovelangiogenicandanti-inflammatoryfactor.americanjournalofphysiologyendocrinologyandmetabolism.2013；304:e32-40.7.burkhardtam,taikp,flores-guiterrezjp,vilches-cisnerosn,kamdark,barbosa-quintanao,valle-riosr,hevezipa,j,selmanm,ouelletteajandzlotnika.cxcl17isamucosalchemokineelevatedinidiopathicpulmonaryfibrosisthatexhibitsbroadantimicrobialactivity.thejournalofimmunology.2012；188:6399-6406.8.goreni,pfeilschifterjandfranks.uptakeofneutrophil-derivedym1proteindistinguisheswoundmacrophagesintheabsenceofinterleukin-4signalinginmurinewoundhealing.amjpathol.2014.9.poutahidist,kearneysm,levkovicht,qip,varianbj,lakritzjr,ibrahimym,chatzigiagkosa,almejanderdmanse.microbialsymbiontsacceleratewoundhealingviatheneuropeptidehormoneoxytocin.plosone.2013；8:e78898.10.ramosan,cabralme,nosedad,boscha,yantornoomandvaldezjc.antipathogenicpropertiesoflactobacillusplantarumonpseudomonasaeruginosa:thepotentialuseofitssupernatantsinthetreatmentofinfectedchronicwounds.woundrepairandregeneration:officialpublicationofthewoundhealingsociety[and]theeuropeantissuerepairsociety.2012；20:552-62.11.e,mathieseng,naterstadk,eijsinkvghandaxelssonl.high-level,induciblegeneexpressioninlactobacillussakeiandlactobacillusplantarumusingversatileexpressionvectors.microbiology.2005；151:2439-2449.12.eijsinkvg,axelssonl,diepdb,havarsteinls,holohandnesif.productionofclassiibacteriocinsbylacticacidbacteria；anexampleofbiologicalwarfareandcommunication.antonievanleeuwenhoek.2002；81:639-54.13.gaoz,tsengc-h,peizandblasermj.molecularanalysisofhumanforearmsuperficialskinbacterialbiota.proceedingsofthenationalacademyofsciences.2007；104:2927-2932.14.gething.thesignificanceofsurfacephinchronicwounds.woundsuk.2007；3:52-56.15.e,s,naterstadk,mathieseng,eijsinkvg,andaxelssonl.constructionofvectorsforinduciblegeneexpressioninlactobacillussakeiandlplantarum.femsmicrobiollett.2003；229(1):119-126.15.e,s,naterstadk,mathieseng,eijsinkvg,andaxelssonl.constructionofvectorsforinduciblegeneexpressioninlactobacillussakeiandlplantarum.femsmicrobiollett.2003；229(1):119-126.16.cooperh.s.,murthys.n.,shahr.s.,sedergrand.j.clinicopathologicstudyofdextransulfatesodiumexperimentalmurinecolitis.lab.invest.1993；69(2):238–249.17.nymane,hussf,nymant,junkerj,kratzg.hyaluronicacid,animportantfactorinthewoundhealingpropertiesofamnioticfluid:invitrostudiesofre-epithelialisationinhumanskinwounds.jplastsurghandsurg.2013apr；47(2):89-92.18.e,christofferssong,waldént,carlssonp,essandm,korsg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