本發(fā)明涉及用于治療威爾森病和其他病癥的核酸構(gòu)建體和基因治療載體。

背景技術(shù)：

關(guān)于威爾森病的基因治療的技術(shù)現(xiàn)狀由merle等(currentgenetherapy2007；7:217-220)綜述，在本文中總結(jié)并用之后公開的文獻(xiàn)完善。

威爾森病(wd)是銅代謝的常染色體隱性遺傳性，其平均患病率為1：30,000。wd由編碼位于13號(hào)染色體上的p型銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase的atp7b基因的突變引起。atp7b主要在肝細(xì)胞中表達(dá)，并在銅的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用。atp7b蛋白的缺乏或功能降低導(dǎo)致肝細(xì)胞排入膽汁中的銅減少，并導(dǎo)致銅主要在肝臟中積聚，隨后在神經(jīng)系統(tǒng)和其他組織中積聚。失去功能性atp7b蛋白的另一個(gè)后果是無法將銅整合入銅藍(lán)蛋白。

wd臨床上可以呈現(xiàn)為肝病、進(jìn)行性神經(jīng)疾病或精神病。肝wd患者通常在兒童期或青春期后期呈現(xiàn)，表現(xiàn)出急性肝炎、暴發(fā)性肝衰竭或進(jìn)行性慢性肝病的特征。wd的神經(jīng)病學(xué)表現(xiàn)通常晚于肝病，最常見于第二十年或第三十年，包括與錐體外系、小腦和腦相關(guān)的癥狀。

wd藥物治療的目的是除去體內(nèi)的有毒銅沉積，并預(yù)防其再積聚。目前已經(jīng)批準(zhǔn)了用于wd的三種抗銅藥：d-青霉胺、三文胺和鋅鹽。藥物療法在大多數(shù)但不是所有wd患者中有效。肝移植是出現(xiàn)暴發(fā)性肝衰竭或進(jìn)行性肝衰竭的wd患者的一個(gè)治療選擇。已經(jīng)表明它可以糾正wd表型，并提供優(yōu)異的長期生存期。

然而，治療中斷或治療不足可能導(dǎo)致幾個(gè)月內(nèi)死亡。由于wd藥物必須定期服用，因此一些患者，特別是青少年wd患者的治療依從性較差。

在治療過程中，殘留神經(jīng)癥狀相對較常見，甚至可能發(fā)生進(jìn)行性癥狀。因?yàn)槟壳暗乃幬镏委熯x擇并不是對所有wd患者都有效且治療依從性是一個(gè)問題，更全面的解決方案可能涉及基因治療。

理論上，在肝細(xì)胞中表達(dá)野生型atp7b將逆轉(zhuǎn)所有疾病相關(guān)的異常，并拯救肝臟和神經(jīng)癥狀。wd的理想基因治療的最終目標(biāo)是在終身持續(xù)的時(shí)間內(nèi)將足夠量的atp7b特異性遞送至肝細(xì)胞。

所有公開的關(guān)于wd的腺病毒基因轉(zhuǎn)移的研究均使用僅產(chǎn)生瞬時(shí)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的早代腺病毒載體。terada等[terada等j.biol.chem.1998；273:1815-1820；terada等febslett.1999；448:53-56]通過在lec大鼠模型中腺病毒介導(dǎo)的基因遞送證明了成功的基因轉(zhuǎn)移。顯示恢復(fù)了全血銅藍(lán)蛋白合成、血清銅藍(lán)蛋白氧化酶活性和銅排入膽汁中，表明了基因轉(zhuǎn)移的治療效果。這些效果的持續(xù)時(shí)間非常有限，在第三天水平最高，此后下降。ha-hao等[z.gastroenterol.2002；40:209-216]也證明了腺病毒介導(dǎo)的atp7b基因轉(zhuǎn)移后，lec大鼠的糞便中銅含量增加，表明排入膽汁中的銅增加。全血銅藍(lán)蛋白及其鐵氧化酶活性的恢復(fù)也證明了治療效果。然而，再一次，這些實(shí)驗(yàn)中的治療效果的持續(xù)時(shí)間僅僅是瞬時(shí)的，有限的持續(xù)幾天。

目前為止還沒有測試用于該應(yīng)用的無腸腺病毒載體。

迄今為止，其他常用的非整合病毒載體系統(tǒng)腺相關(guān)病毒(aav)也沒有測試用于wd，主要是因?yàn)樵赼av載體內(nèi)(其包裝能力為4.4-4.7kb)atp7b基因(約4.4kb大)留下用于分配其余所需序列(例如啟動(dòng)子、聚a信號(hào)序列等)的空間最小。德國專利申請de100156121a1(公開于2003)提出了一種用于wd基因治療的重組腺相關(guān)病毒載體，其具有縮短的金屬敏感啟動(dòng)子(金屬硫蛋白-i啟動(dòng)子)以產(chǎn)生銅或鋅可誘導(dǎo)的atp7b轉(zhuǎn)基因表達(dá)。然而，該文獻(xiàn)沒有提供，之后也沒有公開關(guān)于該載體的療效和性能的任何信息。

另一方面，已經(jīng)在wd的動(dòng)物模型中測試了幾種攜帶野生型atp7b的慢病毒載體。merle等[scan.j.gastroenterol.2006；41:974-982]報(bào)道了具有慢病毒載體的lec大鼠中的系統(tǒng)性基因治療，所述慢病毒載體在磷酸甘油激酶啟動(dòng)子控制下表達(dá)atp7b。與未處理對照相比，基因轉(zhuǎn)移24周后，經(jīng)處理大鼠中的肝臟銅含量顯著降低且肝組織學(xué)改善，但效果僅僅是部分的。與對照相比，基因轉(zhuǎn)移2周后，血清銅藍(lán)蛋白氧化酶活性增加，但在處理后24周降低至較低水平。最近，roybal等[genetherapy2012；19:1085-1094]報(bào)告了在肝特異性啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下攜帶人atp7b的慢病毒在atp7b^-/-小鼠中的早期妊娠基因轉(zhuǎn)移，其含有載脂蛋白e和α-1抗胰蛋白酶元件。子宮內(nèi)施用該載體提供肝銅水平的降低、正常肝臟組織學(xué)的保留、銅整合入銅藍(lán)蛋白中的恢復(fù)以及膽固醇生物合成的改善。然而，治療的功效在不同小鼠間是非?？勺兊?，隨著時(shí)間而下降，且從未完全糾正不同病理改變的參數(shù)。

發(fā)明簡述

發(fā)明人已經(jīng)工程化并測試了幾種攜帶編碼不同截短形式的酶atp7b的轉(zhuǎn)基因的病毒載體：例如編碼atp7b(d223-366)[atp7b-t1]的載體aav2/8aat-atp7b(d223-366)；和編碼atp7b(d57-486)[atp7b-t2]的載體aav2/8aat-atp7b(d57-486)。當(dāng)向atp7b敲除小鼠(一種威爾森病的公認(rèn)動(dòng)物模型)施用時(shí)，在處理至少24周后，攜帶atp7b-t2的aav載體糾正了威爾森病的主要病理特征，而攜帶atp7b-t1的aav載體僅具有部分效果。在用aav2/8aat-atp7b(d57-486)載體處理的威爾森病小鼠中，cu排出(cu尿含量)和肝cu含量顯著降低，且銅藍(lán)蛋白活性顯著恢復(fù)。另一方面，施用載體導(dǎo)致血清轉(zhuǎn)氨酶水平和肝組織學(xué)正?；?，同時(shí)炎性浸潤、膽管增生和纖維化明顯降低。

此外，已經(jīng)表明對于獲得血清銅藍(lán)蛋白活性的正?；透闻K中cu積聚的降低兩者，每只小鼠1x10¹⁰vgaav2/8-aat-wtatp7b載體的劑量是wt構(gòu)建體的“次優(yōu)劑量”(圖10a和11a)；且已經(jīng)表明所述次優(yōu)劑量的攜帶截短形式的載體提供統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的治療效果(vs未處理)(圖10b和11b)。并且，還表明對于這兩種治療效果而言，在劑量為1x10¹⁰vg/小鼠的全長atp7b和t2構(gòu)建體之間觀察到的活性差異是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的(圖12和圖14)。

這些觀察結(jié)果表明，編碼截短形式的atp7b(d57-486)的核酸構(gòu)建體和攜帶它的載體(尤其是aav載體)均能夠克服與atp7b缺乏或功能障礙相關(guān)的銅積聚的最相關(guān)的病理作用，因而非常適于用于以下的基因治療：由銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2缺乏或功能障礙引起的病癥，例如威爾森病，或與atp7b依賴性溶酶體胞吐作用減少和銅積聚相關(guān)的疾病和/或病癥。此外，出乎意料地，已經(jīng)表明一定劑量的截短形式的atp7b(d57-486)和攜帶它的載體實(shí)現(xiàn)了這些疾病的病理學(xué)表現(xiàn)的一些的正常化，而所述劑量的全長atp7b蛋白和編碼該蛋白的載體證明效果較差。

因此，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及核酸構(gòu)建體(以下也稱為“本發(fā)明的核酸構(gòu)建體”)，其包含：a)真核啟動(dòng)子的核苷酸序列；b)編碼截短的銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2(atp7b)的核苷酸序列，其中n末端重金屬相關(guān)位點(diǎn)hma1、hma2、hma3和hma4完全缺失，且hma5和hma6保持不缺失；和c)聚腺苷酸化信號(hào)序列。

在另一個(gè)反面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的表達(dá)載體(以下也稱為“本發(fā)明的表達(dá)載體”)。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的病毒顆粒(以下也稱為“本發(fā)明的病毒顆?！?。優(yōu)選地，核酸構(gòu)建體組成病毒載體的基因組序列。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的產(chǎn)品(即包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的產(chǎn)品)和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。如本文所用，術(shù)語“本發(fā)明的產(chǎn)品”是指且無區(qū)別地涵蓋任何以下：a)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體；b)本發(fā)明的表達(dá)載體；c)本發(fā)明的宿主細(xì)胞和d)本發(fā)明的病毒顆粒。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及在一個(gè)或多個(gè)容器中包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體、載體、宿主細(xì)胞、病毒顆粒或藥物組合物的試劑盒。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于醫(yī)藥的本發(fā)明的產(chǎn)品(用作藥物或醫(yī)藥組合物)。這種在醫(yī)藥中的用途包括治療由銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2缺乏或功能障礙引起的病癥。換言之，本發(fā)明涉及：本發(fā)明的產(chǎn)品在制備用于治療由銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2缺乏或功能障礙引起的病癥的藥物中的用途；和用于治療受試者或患者中由銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2缺乏或功能障礙引起的病癥的方法，包括向所述受試者或患者施用治療有效量的本發(fā)明的產(chǎn)品。在一個(gè)更具體的方面，本發(fā)明的產(chǎn)品用于治療威爾森病。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含如上所述的本發(fā)明的產(chǎn)品的藥物組合物在如上所述的醫(yī)藥和治療方法中提議的用途。

甚至在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)本發(fā)明的病毒顆粒的方法，包括以下步驟：

a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；和

b)在細(xì)胞培養(yǎng)上清液和/或細(xì)胞內(nèi)收獲病毒顆粒。

在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或本發(fā)明的表達(dá)載體在生產(chǎn)病毒顆粒中的用途。

附圖說明

圖1：以下核酸構(gòu)建體的示意圖：攜帶人atp7b的載體aav2/8aatwtatp7b；攜帶截短形式的atp7b(d223-366)[atp7b-t1]的載體aav2/8aat-atp7b(d223-366)；和攜帶截短的atp7b(d57-486)[atp7b-t2]的載體aav2/8aat-atp7b(d57-486)。構(gòu)建體的元件是：a)α-1-抗胰蛋白酶基因啟動(dòng)子(aat)；b)分別編碼人atp7b、atp7b-t1或atp7b-t2的核苷酸序列；c)聚腺苷酸化信號(hào)(pa)；和載體基因組側(cè)翼的d)aav2的反向末端重復(fù)序列(itr)。

圖2：:野生型雄性小鼠[wt]、atp7b缺乏雄性小鼠[威爾森病小鼠,wd]和用載體aav2/8-aat-wtatp7b[wdaav-atp7b]、aav2/8-aat-atp7b(d223-366)[wdaav-t1]或aav2/8-aat-atp7b(d57-486)[wdaav-t2]處理的wd雄性小鼠的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alt)水平。當(dāng)動(dòng)物6周大時(shí)，以3x10¹⁰vg/小鼠的劑量施用載體。在處理后4、9、14和24周[周]測量alt水平，并表示為iu/l(iu：國際單位)。ns:不顯著；*:p<0.05,**:p<0.01；***:p<0.001[mann-whitney非配對檢驗(yàn)]。

圖3：野生型雄性小鼠[wt]、威爾森病雄性小鼠[wd]和用載體aav2/8-aat-wtatp7b[wdaav-atp7b]、aav2/8-aat-atp7b(d223-366)[wdaav-t1]或aav2/8-aat-atp7b(d57-486)[wdaav-t2]處理的wd雄性小鼠的總尿銅含量。載體劑量：3x10¹⁰vg/小鼠。在處理后4、9、14和24周[周]測量24小時(shí)尿中的銅含量，并表示為納克銅(ngr/24h)。

圖4：野生型雄性小鼠[wt]、威爾森病雄性小鼠[wd]和用載體aav2/8-aat-wtatp7b[wdaav-atp7b]、aav2/8-aat-atp7b(d223-366)[wdaav-t1]或aav2/8-aat-atp7b(d57-486)[wdaav-t2]處理的wd雄性小鼠的血清銅藍(lán)蛋白活性。載體劑量：3x10¹⁰vg/小鼠。在處理后4周測量銅藍(lán)蛋白活性，并表示為570nm波長處的吸光度[abs(570nm)]。ns:不顯著；*:p<0.05,**:p<0.01；***:p<0.001[mann-whitney非配對檢驗(yàn)]。

圖5：野生型雄性小鼠[wt]、威爾森病雄性小鼠[wd]和用載體aav2/8-aat-wtatp7b[wdaav-atp7b]、aav2/8-aat-atp7b(d223-366)[wdaav-t1]或aav2/8-aat-atp7b(d57-486)[wdaav-t2]處理的wd雄性小鼠的肝cu含量。載體劑量：3x10¹⁰vg/小鼠。處理后24小時(shí)處死動(dòng)物，并通過原子吸收光譜法測定銅含量；并表示為μg/g(cuμg/g干燥干組織)。ns:不顯著；*:p<0.05,**:p<0.01；***:p<0.001[mann-whitney非配對檢驗(yàn)]。

圖6：野生型動(dòng)物雄性小鼠[wt]、威爾森病雄性小鼠[wd]和用載體aav2/8-aat-wtatp7b[wdaav-atp7b]、aav2/8-aat-atp7b(d223-366)[wdaav-t1]或aav2/8-aat-atp7b(d57-486)[wdaav-t2]處理的wd雄性小鼠的肝臟組織學(xué)圖像。載體劑量：3x10¹⁰vg/小鼠。處死小鼠后(30周齡)拍攝圖像。a：用蘇木精和曙紅染色的肝切片圖像。b：用檢測銅沉積的timm硫化銀技術(shù)染色的組織學(xué)樣品的圖像。

圖7：肝臟炎癥、膽管增生和纖維化的分析。野生型雄性小鼠[wt]、威爾森病雄性小鼠[wd]和用載體aav2/8-aat-wtatp7b[wdaav-atp7b]、aav2/8-aat-atp7b(d223-366)[wdaav-t1]或aav2/8-aat-atp7b(d57-486)[wdaav-t2]處理的wd雄性小鼠的肝臟圖像。載體劑量：3x10¹⁰vg/小鼠。處死小鼠后(30周齡)進(jìn)行分析。cd45：用檢測肝臟炎性浸潤的抗cd45免疫染色的肝切片圖像。panck：用檢測膽管增生的抗panck免疫染色的肝切片圖像。sr：用檢測纖維化的天狼星紅染色的肝切片圖像。

圖8：野生型雌性小鼠[wt]、wd雌性小鼠[wd]和用載體aav2/8-aat-atp7b(d57-486)[wdaav-t2]處理的wd雌性小鼠的血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alt)水平。向不同組的6周大wd雌性小鼠施用不同劑量的載體(分別為1x10¹⁰、3x10¹⁰、1x10¹¹vg/小鼠)。在處理后4、9、14和24周[周]測量alt水平，并表示為iu/l(iu：國際單位)。ns:不顯著；*:p<0.05,**:p<0.01；***:p<0.001[mann-whitney非配對檢驗(yàn)]。

圖9：野生型雌性小鼠[wt]、wd雌性小鼠[wd]和用載體aav2/8-aat-atp7b(d57-486)[wdaav-t2]處理的wd雌性小鼠的尿cu含量水平。向不同組的6周大wd雌性小鼠施用不同劑量的載體(分別為1x10¹⁰、3x10¹⁰、1x10¹¹vg/小鼠)。在處理后4、9、14和24周[周]測量尿銅含量水平，并表示為24小時(shí)尿中的納克銅(ngr/24h)。ns:不顯著；*:p<0.05,**:p<0.01；***:p<0.001[mann-whitney非配對檢驗(yàn)]。

圖10：測量野生型雌性小鼠[wt]、wd雌性小鼠[wd]和用載體aav2/8-aat-atp7b(d57-486)[wd+aav-t2]或載體aav2/8-aat-wtatp7b[wd+aav-atp7b]處理的wd雌性小鼠的血清中的銅藍(lán)蛋白活性。對于各實(shí)驗(yàn)組，向不同組的6周大wd雌性小鼠施用不同劑量的載體(分別為1x10¹⁰、3x10¹⁰、1x10¹¹vg/小鼠)。在處理后4周測量銅藍(lán)蛋白活性，并表示為570nm波長處的吸光度[abs(570nm)]。ns:不顯著；*:p<0.05,**:p<0.01；***:p<0.001[mann-whitney非配對檢驗(yàn)]。

圖11：測量野生型雌性小鼠[wt]、wd雌性小鼠[wd]和用載體aav2/8-aat-wtatp7b[wdaavatp7b]或載體aav2/8-aat-atp7b(d57-486)[wdaavt2]處理的wd雌性小鼠的肝cu含量。對于各實(shí)驗(yàn)組，向不同組的6周大wd雌性小鼠施用不同劑量的載體(分別為1x10¹⁰、3x10¹⁰、1x10¹¹vg/小鼠)。在處理后24周測量銅濃度；并表示為μg/g干燥組織。ns:不顯著；*:p<0.05,**:p<0.01；***:p<0.001[mann-whitney非配對檢驗(yàn)]。

圖12：野生型雄性小鼠[wt，n＝15]、wd雄性小鼠[wd，n＝25]和用載體aav2/8-aat-wtatp7b[wdaavatp7b，n＝7]或載體aav2/8-aat-atp7b(d57-486)[wdaavt2，n＝7]處理的wd雄性小鼠的肝cu含量。對于各實(shí)驗(yàn)組，當(dāng)動(dòng)物6周大時(shí)，向wd小鼠施用次優(yōu)劑量的載體(1x10¹⁰vg/小鼠)。在處理后24周測量銅濃度，并表示為μg/g干燥組織。ns:不顯著；*:p<0.05,**:p<0.01；***:p<0.001[mann-whitney非配對檢驗(yàn)]。

圖13：野生型雄性小鼠[wt，n＝15]、wd雄性小鼠[wd，n＝25]和用載體aav2/8-aat-atp7b(d57-486)[wdaavt2，n＝13]或載體aav2/8-aat-coatp7b(d57-486)[wdaavcot2，n＝4]處理的wd雄性小鼠的肝cu含量。對于各實(shí)驗(yàn)組，向6周齡wd雄性小鼠施用次優(yōu)劑量的載體(1x10¹⁰vg/小鼠)。在處理后24周測量銅濃度，并表示為μg/g干燥組織。ns:不顯著；*:p<0.05,**:p<0.01；***:p<0.001[mann-whitney非配對檢驗(yàn)]。

圖14：野生型雄性小鼠[wt，n＝15]、wd雄性小鼠[wd，n＝25]和用載體aav2/8-aat-wtatp7b[wdaavatp7b；n＝10]、aav2/8-aat-coatp7b[wdaavcoatp7b；n＝8]、aav2/8-aat-atp7b(d57-486)[wdaavt2；n＝13]和aav2/8-aat-coatp7b(d57-486)[wdaavcot2；n＝4]處理的wd雄性小鼠的血清中的銅藍(lán)蛋白活性。對于各實(shí)驗(yàn)組，向6周齡wd雄性小鼠施用次優(yōu)劑量的載體(1x10¹⁰vg/小鼠)。在處理后4周測量銅藍(lán)蛋白的氧化酶活性，并表示為570nm波長處的吸光度[abs(570nm)]。。ns:不顯著；*:p<0.05,**:p<0.01；***:p<0.001[mann-whitney非配對檢驗(yàn)]。

發(fā)明詳述

除非另有說明，在本申請中使用的所有術(shù)語應(yīng)當(dāng)理解為本領(lǐng)域中已知的其通常含義。本申請中所用的一些術(shù)語的其他更具體的定義如下所述，且意欲適用于說明書全文和權(quán)利要求，除非明確規(guī)定的定義提供更廣泛的定義。

術(shù)語“核酸序列”和“核苷酸序列”可以交替使用，是指由單體核苷酸組成或包含單體核苷酸的任何分子。核酸可以是寡核苷酸或多核苷酸。核苷酸序列可以是dna或rna。核苷酸序列可以是化學(xué)修飾的或人工的。核苷酸序列包括肽核酸(pna)、嗎啉代鎖核酸(lna)以及乙二醇核酸(gna)和蘇糖核酸(tna)。這些序列中的每一個(gè)與天然存在的dna或rna的區(qū)別在于分子骨架的變化。也可以使用硫代磷酸核苷酸。其他脫氧核苷酸類似物包括甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、n3'p5'-氨基磷酸酯和寡核糖核苷酸硫代磷酸酯以及可以用于本發(fā)明的核苷酸的它們的2'-o-烯丙基類似物和2'-o-甲基核糖核苷酸甲基磷酸酯。

如本文所用，術(shù)語“核酸構(gòu)建體”是指由使用重組dna技術(shù)產(chǎn)生的人造核酸分子。核酸構(gòu)建體是單鏈或雙鏈核酸分子，其已經(jīng)被修飾為包含以一種方式組合和并列的核酸序列區(qū)段，并且在自然界中不存在。核酸構(gòu)建體一般是“載體”，即用于將外源產(chǎn)生的dna遞送至宿主細(xì)胞的核酸分子。

如本文所用，術(shù)語“表達(dá)載體”或“載體”是指能夠在與重組核苷酸序列相容的宿主細(xì)胞或宿主生物中影響基因(轉(zhuǎn)基因)表達(dá)的重組核苷酸序列。與轉(zhuǎn)基因一起，表達(dá)載體通常包括至少合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列和任選的3’轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。也可以存在影響表達(dá)所需的或有助于影響表達(dá)的其他因子，例如能夠響應(yīng)精確誘導(dǎo)信號(hào)(內(nèi)源或嵌合轉(zhuǎn)錄因子)或?qū)δ承┘?xì)胞、器官或組織具有特異性的表達(dá)增強(qiáng)元件。

如本文所用，術(shù)語“受試者”或“患者”是指哺乳動(dòng)物?？梢允芤嬗诠_的治療方法的哺乳動(dòng)物物種包括但不限于：人、非人靈長類如類人猿、黑猩猩、猴子和猩猩、馴養(yǎng)動(dòng)物包括狗和貓、以及家畜如馬、牛、豬、綿羊和山羊，或其他哺乳動(dòng)物物種，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、倉鼠等。

如本文所用，術(shù)語“包裝細(xì)胞”是指可以用輔助載體或病毒或dna構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，并且反式提供病毒載體的完整復(fù)制和包裝所需的所有缺失功能的細(xì)胞或細(xì)胞系。通常，包裝細(xì)胞以組成型或可誘導(dǎo)的方式表達(dá)一種或多種所述缺失的病毒功能。

本發(fā)明的核酸構(gòu)建體

真核啟動(dòng)子的核苷酸序列

如本文所用，術(shù)語“真核啟動(dòng)子”是指在真核細(xì)胞中啟動(dòng)特定基因、或一個(gè)或多個(gè)編碼序列的轉(zhuǎn)錄的dna序列區(qū)域。啟動(dòng)子可以與其他調(diào)控區(qū)域或元件協(xié)同作用以指導(dǎo)基因或編碼序列的轉(zhuǎn)錄水平。這些調(diào)控元件包括但不限于：轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、抑制子和激活子蛋白結(jié)合位點(diǎn)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的直接或間接作用于調(diào)控從啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的量的任何其他核苷酸序列，包括例如衰減子、增強(qiáng)子和沉默子。啟動(dòng)子位于與其可操作連接的基因或編碼序列的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近，并且位于dna序列的相同鏈和上游(向著有義鏈的5區(qū)’)。啟動(dòng)子的長度可以為約100-1000個(gè)堿基對。對于特定基因，啟動(dòng)子中的位置相對于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)命名(即，上游位置是從-1開始計(jì)數(shù)的負(fù)數(shù)，例如-100是指上游100個(gè)堿基對的位置)。

術(shù)語“核心啟動(dòng)子”或“最小啟動(dòng)子”是指正確啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄所需的最少部分的啟動(dòng)子序列。它包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(tss)和直接上游的元件；rna聚合酶(rna聚合酶ii)的結(jié)合位點(diǎn)；和一般轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。通常，啟動(dòng)子還包含近端啟動(dòng)子序列(核心啟動(dòng)子上游)，其包含其他主要調(diào)控元件(例如增強(qiáng)子、沉默子、邊界元件/絕緣子)；和遠(yuǎn)端啟動(dòng)子序列(核心啟動(dòng)子下游)，其可以包含額外的調(diào)控元件，通常對于基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響較弱。

根據(jù)本發(fā)明，真核啟動(dòng)子序列與編碼截短的銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2的核苷酸序列可操作連接。如本文所用，術(shù)語“可操作連接”是指以功能性關(guān)系連接多核苷酸(或多肽)元件。當(dāng)核酸與另一個(gè)核酸序列置于功能性關(guān)系時(shí)，它是“可操作連接”的。例如，如果啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與所述編碼序列可操作連接?？刹僮鬟B接意味著連接的dna序列通常是連續(xù)的；當(dāng)需要連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)時(shí)，它們是連續(xù)的且在閱讀框中。

根據(jù)本發(fā)明，核酸構(gòu)建體的真核啟動(dòng)子序列包含至少核心啟動(dòng)子和任選的相同基因或不同基因的其他調(diào)控區(qū)或元件(即雜合或嵌合啟動(dòng)子)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，真核啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

如本文所用，術(shù)語“組成型”啟動(dòng)子是在大多數(shù)真核組織中，在大多數(shù)生理和發(fā)育條件下具有活性的啟動(dòng)子。

“組織特異性啟動(dòng)子”是僅在特定類型的組織或細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子。換言之，在本發(fā)明的上下文中，組織特異性啟動(dòng)子是在一種或幾種特定組織(例如兩種、三種或四種)比在其他組織中更有活性的啟動(dòng)子(即，啟動(dòng)子能夠在其具有特異性的組織中比在其他組織中驅(qū)動(dòng)與其可操作連接的編碼序列的更高表達(dá))。通常，“組織特異性”啟動(dòng)子下游的基因在該啟動(dòng)子具有特異性的組織中的活性程度比在任何其他組織中高得多。這種情況下，啟動(dòng)子在除了其具有特異性的組織之外的任何其他組織中的活性非常小或基本上沒有。

“誘導(dǎo)型”啟動(dòng)子是例如通過應(yīng)用化學(xué)誘導(dǎo)劑生理或發(fā)育調(diào)控的啟動(dòng)子。

很多啟動(dòng)子是本領(lǐng)域已知的[sambrookandrussell(molecularcloning:alaboratorymanual；thirdedition；2001coldspringharborlaboratorypress)；andgreenandsambrook(molecularcloning:alaboratorymanual,cuartaedición,2012coldspringharborlaboratorypress)]。

合適的組織特異性啟動(dòng)子可發(fā)現(xiàn)于組織特異性啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫,tiprod(nucleicacidsresearch2006；j4:d104-d107)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，真核啟動(dòng)子是肝特異性啟動(dòng)子。在本發(fā)明上下文中，“肝特異性啟動(dòng)子”是在肝臟中比在機(jī)體的任何其他組織中更有活性的啟動(dòng)子。通常，肝特異性啟動(dòng)子在肝臟中的活性比在其他組織中大得多。例如，這種啟動(dòng)子可以是至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍更有活性(例如與其在其他細(xì)胞或組織中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的能力相比，測定其在給定組織中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的能力)。因此，肝特異性啟動(dòng)子允許與其連接的基因在肝臟中的活性表達(dá)，并防止其在其他細(xì)胞或組織中表達(dá)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，真核啟動(dòng)子是α1-抗胰蛋白酶基因啟動(dòng)子(aat)的核苷酸序列或包含與白蛋白基因增強(qiáng)子元件(ealb)組合的α1-抗胰蛋白酶基因啟動(dòng)子序列(aat或pa1at)的嵌合啟動(dòng)子序列ealbpa1at。兩個(gè)啟動(dòng)子序列均具有肝特異性啟動(dòng)子的性能。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，真核啟動(dòng)子序列是seqidno：1(aat)的堿基156-460；或seqidno：5(ealbpa1at)限定的序列。

截短的銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2(atp7b)

銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2(atp7b)是在將銅輸出細(xì)胞中發(fā)揮功能的p型陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)atpase。

編碼人酶的基因位于13號(hào)染色體(染色體位置13q14.3；基因名稱atp7b)。關(guān)于人atp7b多肽的信息(氨基酸序列、結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域和其他特征)例如可從uniprot通過登錄號(hào)p35670獲得(http://www.uniprot.org/uniprot/p35670；entryversion168(03sep2014),sequenceversion4(16jun2009))。關(guān)于編碼該酶的atp7b基因的信息可從entrez通過登錄號(hào)基因id：540獲得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/540；2014年9月19日更新)。已經(jīng)描述了atp7b選擇性剪切產(chǎn)生的4種亞型；選擇亞型1(鑒定號(hào)p35670-1,1465個(gè)氨基酸長)作為標(biāo)準(zhǔn)序列。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體包含編碼截短形式的人atp7b，優(yōu)選其氨基酸序列是標(biāo)準(zhǔn)序列(seqidno:2)的人atp7b(本文也稱為wtatp7b)的核苷酸序列。

atp7b中存在p型atpase蛋白家族特征性的幾個(gè)保守基序。這些基序是atp催化所必需的，包括核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(n-結(jié)構(gòu)域)、磷酸化結(jié)構(gòu)域(p-結(jié)構(gòu)域)和執(zhí)行結(jié)構(gòu)域(a-結(jié)構(gòu)域)。在這些基序中存在高度保守的特征殘基；n-結(jié)構(gòu)域中的sehpl、p-結(jié)構(gòu)域中的dktg和a-結(jié)構(gòu)域中的tge。人atp7b的氨基末端尾包括“6個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)”(mbs)，也無區(qū)別地命名為“重金屬相關(guān)(hma)”位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)域，其中每一個(gè)包含核心序列mxcxxc。這些hma以每hma一個(gè)cu(i)原子的化學(xué)計(jì)量結(jié)合cu(i)。atp7b的這些氨基末端hma是其幾個(gè)功能方面所需的，包括銅的易位、銅整合入銅綠蛋白、atpase活性、定位和運(yùn)輸以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。從氨基末端開始，hma位點(diǎn)鑒定為結(jié)構(gòu)域hma1(標(biāo)準(zhǔn)序列中的氨基酸59-125)、hma2(氨基酸144-210)、hma3(258-327)、hma4(360-426)、hma5(489-555)和hma6(565-631)。

根據(jù)本發(fā)明，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，核酸構(gòu)建體包含編碼截短atp7b的核苷酸序列，其中n末端重金屬相關(guān)位點(diǎn)hma1、hma2、hma3和hma4全部或部分缺失。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，編碼截短atp7b的核苷酸序列保留atp7b的n末端信號(hào)序列的56個(gè)氨基酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，截短atp7b中的缺失包含標(biāo)準(zhǔn)序列的氨基酸57-486。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，核苷酸序列編碼其氨基酸序列為seqidno：7的截短atp7b。

由于密碼子冗余，可以產(chǎn)生編碼具有相同氨基酸序列的atp7b多肽的許多核苷酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，編碼截短銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2的核苷酸序列是seqidno：6的編碼序列cds，堿基473-3580。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，編碼截短銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2的核苷酸序列是seqidno：8，其是用于人細(xì)胞的優(yōu)化密碼子使用偏差的序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，編碼截短銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2的核苷酸序列是其中編碼截短銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2的至少827個(gè)、至少879個(gè)、至少931個(gè)或至少983個(gè)密碼子與編碼序列seqidno：8的密碼子相同的序列。

聚腺苷酸化信號(hào)序列

如本文所用，術(shù)語“聚腺苷酸化信號(hào)”或“聚(a)信號(hào)”是指基因的3'非翻譯區(qū)(3'utr)內(nèi)的特定識(shí)別序列，其轉(zhuǎn)錄為前體mrna分子并引導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的終止。聚(a)信號(hào)是新形成的前體mrna在其3'末端的內(nèi)切核酸切割的信號(hào)，以及向其3'末端添加僅由腺嘌呤堿基組成的rna延伸的信號(hào)(聚腺苷酸化過程；聚(a)尾)。聚(a)尾對于mrna的細(xì)胞核輸出、翻譯和穩(wěn)定性非常重要。在本發(fā)明的上下文中，聚腺苷酸化信號(hào)是能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中引導(dǎo)哺乳動(dòng)物基因和/或病毒基因的聚腺苷酸化的識(shí)別序列。

聚(a)信號(hào)通常由以下組成：a)共識(shí)序列aauaaa，其被證明是前體信使rna(前體mrna)的3'末端切割和聚腺苷酸化以及促進(jìn)下游轉(zhuǎn)錄終止所需，和b)在aauaaa上游和下游的控制使用aauaaa作為聚(a)信號(hào)的效率的其他元件。在哺乳動(dòng)物基因中，這些基序具有相當(dāng)大的變化。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體的聚腺苷酸化信號(hào)序列是哺乳動(dòng)物基因或病毒基因的聚腺苷酸化信號(hào)序列。合適的聚腺苷酸化信號(hào)包括sv40早期聚腺苷酸化信號(hào)、sv40晚期聚腺苷酸化信號(hào)、hsv胸苷激酶聚腺苷酸化信號(hào)、魚精蛋白基因聚腺苷酸化信號(hào)、腺病毒5eib腺苷酸化信號(hào)、生長激素聚腺苷酸化信號(hào)、pbgd聚腺苷酸化信號(hào)、電子設(shè)計(jì)的聚腺苷酸化信號(hào)(合成的)等等。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，核酸構(gòu)建體的聚腺苷酸化信號(hào)序列是合成的聚(a)信號(hào)，其也能夠指導(dǎo)并影響前體mrna的內(nèi)切核酸切割和聚腺苷酸化，所述前體mrna來自編碼截短atp7b的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，核酸構(gòu)建體的聚腺苷酸化信號(hào)序列是由seqidno：1的堿基4877-4932限定的合成聚(a)信號(hào)序列。

其他核苷酸元件

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體構(gòu)成用于基因治療的表達(dá)載體(本發(fā)明的表達(dá)載體)，更具體地用于基因治療的病毒載體的重組基因組。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包含病毒的5'itr和3'itr。

如本文所用，術(shù)語“反向末端重復(fù)序列(itr)”是指位于病毒5'末端的核苷酸序列(5'itr)和位于病毒3'末端的核苷酸序列(3'itr)，其包含回文序列并且能夠折疊形成在啟動(dòng)dna復(fù)制中作為引物發(fā)揮功能的t型發(fā)夾結(jié)構(gòu)。它們在病毒基因組整合入宿主基因組中、在拯救宿主基因組中以及在將病毒核酸裝入成熟病毒粒子中也是需要的。itr需要順式用于載體基因組復(fù)制和將其包裝入病毒顆粒。

在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包含病毒的5'itr、ψ包裝信號(hào)和3'itr?！唉装b信號(hào)”是病毒基因組的順式作用核苷酸序列，其在一些病毒中(例如腺病毒、慢病毒…)對于在復(fù)制期間將病毒基因組包裝入病毒衣殼的過程而言是必須的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，核酸構(gòu)建體包含選自以下的病毒的5'itr和3'itr：細(xì)小病毒(特別是腺相關(guān)病毒)、腺病毒，甲病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(特別是γ逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒)、皰疹病毒和sv40；在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，病毒是腺相關(guān)病毒(aav)、腺病毒(ad)或慢病毒。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，核酸構(gòu)建體包含aav的5'itr和3'itr。

aav基因組由包含4681個(gè)堿基的線性單鏈dna分子組成(bernsandbohenzky,(1987)advancesinvirusresearch(academicpress,inc.)32:243-307)?；蚪M在兩端包含反向末端重復(fù)序列(itr)，其作為dna復(fù)制起點(diǎn)和病毒的包裝信號(hào)順式發(fā)揮功能。itr的長度約為145bp?；蚪M的內(nèi)部非重復(fù)部分包括兩個(gè)大的開放閱讀框，分別稱為aavrep和cap基因。這些基因編碼參與復(fù)制和包裝病毒粒子的病毒蛋白。具體地，至少四個(gè)病毒蛋白從aavrep基因合成，根據(jù)其表觀分子量命名為rep78、rep68、rep52和rep40。aavcap基因編碼至少三個(gè)蛋白，vp1、vp2和vp3。關(guān)于aav基因組的詳細(xì)描述，參見例如muzyczka,n.(1992)currenttopicsinmicrobiol.andimmunol.158:97-129。

重組aav病毒粒子的構(gòu)建通常是本領(lǐng)域已知的，且描述于例如us5,173,414和us5,139,941；wo92/01070、wo93/03769、(lebkowski等(1988)molec.cell.biol.8:3988-3996；vincent等(1990)vaccines90(coldspringharborlaboratorypress)；carter,b.j.(1992)currentopinioninbiotechnology3:533-539；muzyczka,n.(1992)currenttopicsinmicrobiol.andimmunol.158:97-129；和kotin,r.m.(1994)humangenetherapy5:793-801。

可以使用任何aav血清型，包括aav1、aav2、aav3(包括3a和3b型)、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、鳥aav、牛aav、犬a(chǎn)av、馬aav、羊aav和目前已知的或之后發(fā)現(xiàn)的任何其他aav血清型的itr來進(jìn)行本發(fā)明。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，核酸構(gòu)建體包含選自以下的aav血清型的5'itr和3'itr：aav1、aav2和aav4。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包含由seqidno：1的堿基1-141和堿基4968-5107限定的itr序列，其是aav2的itr序列。

itr是aav基因組復(fù)制和將其包裝到病毒顆粒中所需的唯一順式aav病毒元件。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，核酸構(gòu)建體包含任何分類亞組(a-f)內(nèi)的任何血清型腺病毒的5'itr、ψ包裝信號(hào)和3'itr。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，這些5'itr、ψ信號(hào)和3'itr序列來自亞組c腺病毒，更優(yōu)選來自血清型2(ad2)或血清型5(ad5)的腺病毒。

另一個(gè)方面，在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明可以使用合成的5'itr和/或3'itr來進(jìn)行，且也可以使用來自不同血清型的病毒的5'itr和3'itr來進(jìn)行。

病毒載體復(fù)制所需的所有其他病毒基因可以如下所述在病毒產(chǎn)生細(xì)胞(包裝細(xì)胞)內(nèi)反式提供。因此，在根據(jù)本發(fā)明的病毒載體基因組的核酸構(gòu)建體中包括它們是任選的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，表達(dá)載體是aav載體。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體構(gòu)成選自以下組合的aav載體：

a)包含aav2的5'itr和3'itr核苷酸序列、aat啟動(dòng)子序列和編碼截短人atp7b(d57-486)的核苷酸序列的載體；

b)包含aav2的5'itr和3'itr核苷酸序列、aat啟動(dòng)子序列和編碼截短人atp7b(d57-486)的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列seqidno：8的載體；

c)包含aav2的5'itr和3'itr核苷酸序列、ealbpa1at雜合啟動(dòng)子序列和編碼截短人atp7b(d57-486)的核苷酸序列的載體；和

d)包含aav2的5'itr和3'itr核苷酸序列、ealbpa1at雜合啟動(dòng)子序列和編碼截短人atp7b(d57-486)的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列seqidno：8的載體。

這些aat載體實(shí)施方案中的每一個(gè)還包括聚腺苷酸化信號(hào)序列，例如合成的聚(a)信號(hào)序列seqidno：1或任何其他合適的聚(a)信號(hào)；與或不與其他任選的核苷酸元件一起。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，表達(dá)載體是腺病毒載體。根據(jù)本發(fā)明的該腺病毒載體尤其可以是第一代、第二代或第三代腺病毒[參見adenovirus.methodsandprotocols.chillónm.andboscha.(eds)；thirdedition；2014springer]，或已知的或之后描述的任何其他腺病毒載體系統(tǒng)。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，本發(fā)明的病毒載體是“第三代腺病毒”，其也可以稱為“無腸腺病毒”、“輔助依賴性腺病毒(hd-ad)”或“高能力腺病毒(hc-ad)”。第三代腺病毒的所有病毒編碼區(qū)被去除(無腸)；它依賴輔助腺病毒來復(fù)制(輔助依賴性)；并且它能夠攜帶并將外源遺傳物質(zhì)的長達(dá)36kbp的插入物遞送入宿主細(xì)胞(高能力)。無腸腺病毒保留反向末端重復(fù)序列itr(5'和3')和包裝信號(hào)(ψ)。

本文所述的本發(fā)明的核酸構(gòu)建體和表達(dá)載體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法來制備和獲得：sambrook和russell(molecularcloning:alaboratorymanual；thirdedition；2001coldspringharborlaboratorypress)；以及green和sambrook(molecularcloning:alaboratorymanual；fourthedition；2012coldspringharborlaboratorypress)。

用于基因治療的本發(fā)明的病毒顆粒

術(shù)語“病毒顆?！焙汀安《玖Ｗ印痹诒疚闹薪惶媸褂?，涉及包裝在衣殼內(nèi)的包含病毒基因組的感染性和通常復(fù)制缺陷型病毒顆粒(即，表達(dá)病毒載體的核酸構(gòu)建體)，視情況可以是衣殼周圍的脂質(zhì)包膜。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，本發(fā)明的病毒粒子是通過將根據(jù)本發(fā)明的aav載體的核酸構(gòu)建體包裝入蛋白質(zhì)殼獲得的“重組aav病毒粒子”或“raav病毒粒子”。

腺相關(guān)病毒的病毒衣殼蛋白質(zhì)(衣殼蛋白vp1、vp2和vp3)從單個(gè)病毒基因(cap基因)產(chǎn)生。各種aav血清型的衣殼蛋白序列之間的差異導(dǎo)致用于進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞表面受體不同。與不同的細(xì)胞內(nèi)加工通路一起，這導(dǎo)致各aav血清型的不同組織向性。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組aav病毒粒子可以通過以下來制備：將衍生自特定aav血清型的aav載體/基因組的核酸構(gòu)建體裝入通過與相同的特定血清型aav對應(yīng)的天然cap蛋白形成的病毒顆粒。然而，已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種技術(shù)來修飾并改進(jìn)天然存在的aav病毒顆粒的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)(bünningh等jgenemed2008；10:717–733)。因此，在根據(jù)本發(fā)明的另一種aav病毒顆粒中，可以將側(cè)翼是給定aav血清型的itr的病毒載體的核苷酸構(gòu)建體包裝入例如：a)由源自相同或不同aav血清型的衣殼蛋白構(gòu)成的病毒顆粒[例如aav2itr和aav5衣殼蛋白；aav2itr和aav8衣殼蛋白；等等]；b)由來自不同aav血清型或突變體的衣殼蛋白的混合物構(gòu)成的鑲嵌病毒顆粒[例如aav2itr和aav1和aav5衣殼蛋白]；c)由通過不同aav血清型或變體之間的結(jié)構(gòu)域交換而截短的衣殼蛋白構(gòu)成的嵌合病毒顆粒[例如aav2itr和具有aav3結(jié)構(gòu)域的aav5衣殼蛋白]；或d)工程化以顯示選擇性結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶向病毒顆粒，其能夠與靶細(xì)胞特異性受體進(jìn)行嚴(yán)格的相互作用[例如aav4itr和通過插入肽配體而遺傳性截短的aav2衣殼蛋白；或通過將肽配體偶聯(lián)至衣殼表面而非遺傳性修飾的aav2衣殼蛋白]。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，根據(jù)本發(fā)明的aav病毒粒子可以包含來自任何aav血清型的衣殼蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，病毒顆粒包含aav的衣殼蛋白。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，aav病毒顆粒包含來自選自以下的血清型的衣殼蛋白：aav1、aav5、aav7、aav8和aav9，其更適用于遞送至肝細(xì)胞(nathwani等blood2007；109:1414–1421；kitajimaetal.atherosclerosis2006；186:65-73)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，病毒顆粒包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，其中核酸構(gòu)建體的5'itr和3'itr是aav2血清型，且衣殼蛋白是aav8血清型。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，aav病毒顆粒包含來自anc80的衣殼蛋白，所述anc80是病毒aav血清型1、2、8和9的預(yù)測祖先，并且表現(xiàn)為靶向肝、肌肉和視網(wǎng)膜的高效基因治療載體(zinn等cellreports2015；12:1–13)。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，病毒顆粒包含anc80l65vp3衣殼蛋白(genbank登錄號(hào):kt235804)。

病毒-聚糖相互作用是侵襲宿主細(xì)胞的決定因素。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，aav病毒顆粒包括含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的衣殼蛋白，其中所述取代將新的聚糖結(jié)合位點(diǎn)引入aav衣殼蛋白。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，氨基酸取代在aav2的氨基酸266、氨基酸463-475和氨基酸499-502，或在aav1、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10或任何其他aav血清型，也包括anc80和anc80l65中的對應(yīng)氨基酸位置。

引入的新聚糖結(jié)合位點(diǎn)可以是己糖結(jié)合位點(diǎn)[例如半乳糖(gal)、甘露糖(man)、葡萄糖(glu)或巖藻糖(fuc)結(jié)合位點(diǎn)]；唾液酸(sia)結(jié)合位點(diǎn)[例如sia殘基，如n-乙酰神經(jīng)氨酸(neusac)或n-糖基神經(jīng)氨酸(neusgc)]；或二糖結(jié)合位點(diǎn)，其中二糖是與半乳糖連接的唾液酸，例如以sia(α2,3)gal或sia(α2,6)gal的形式。國際專利申請wo2014144229和shen等(j.biol.chem.2013；288(40):28814–28823)提供了將來自一種aav血清型的新結(jié)合位點(diǎn)引入另一種avv血清型的衣殼蛋白的詳細(xì)指導(dǎo)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，將來自aav9的gal結(jié)合位點(diǎn)引入aav2vp3骨架，產(chǎn)生能夠使用hs和gal受體用于細(xì)胞進(jìn)入的雙重聚糖-結(jié)合aav菌株。優(yōu)選地，所述雙重聚糖-結(jié)合aav菌株aav2g9。shen等通過將直接參與并緊鄰aav9vp3衣殼蛋白亞基上的gal識(shí)別位點(diǎn)的氨基酸殘基取代至aav2vp3亞基編碼區(qū)的對應(yīng)殘基(aav2vp3編號(hào)q464v、a467p、d469n、i470m、r471a、d472v、s474g、y500f和s501a)上產(chǎn)生aav2g9。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，本發(fā)明的病毒粒子是腺病毒的病毒粒子，例如ad5病毒粒子。在aav病毒粒子的情況下，也可以工程化ad病毒粒子的衣殼蛋白以改變其向性和細(xì)胞內(nèi)靶向性能，也可以使用其他的腺病毒血清型。

生產(chǎn)病毒顆粒

可以考慮為待產(chǎn)生的核酸構(gòu)建體和載體的病毒顆粒的實(shí)際實(shí)施方案所選擇的結(jié)構(gòu)特征，選擇常規(guī)方法和實(shí)驗(yàn)方案來生產(chǎn)攜帶本發(fā)明的表達(dá)病毒載體的核酸構(gòu)建體的病毒顆粒。

簡言之，可以在特異性病毒產(chǎn)生細(xì)胞(包裝細(xì)胞)中產(chǎn)生病毒顆粒，所述病毒產(chǎn)生細(xì)胞在輔助載體或病毒或其他dna構(gòu)建體存在下用待包裝的載體的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。

因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體在生產(chǎn)病毒顆粒中的用途。

在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)本發(fā)明的病毒顆粒的方法，包括以下步驟：

a)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；和

b)從細(xì)胞培養(yǎng)上清液和/或細(xì)胞內(nèi)收獲病毒顆粒。

優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是包裝細(xì)胞，如下文所述。合適的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。組成這種培養(yǎng)基的成分可以根據(jù)待培養(yǎng)的細(xì)胞類型而變。除了營養(yǎng)組分，滲透壓和ph也被認(rèn)為是培養(yǎng)基的重要參數(shù)。細(xì)胞生長培養(yǎng)基包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多成分，包括氨基酸、微生物、有機(jī)鹽和無機(jī)鹽、碳水化合物來源、脂質(zhì)、微量元素(cuso4、feso4、fe(no3)3、znso4...)，各成分以支持體外細(xì)胞培養(yǎng)(即細(xì)胞的存活和生長)的量存在。成分也可以包括不同的輔助物質(zhì)，例如緩沖物質(zhì)(如碳酸氫鈉、hepes、tris...)、氧化穩(wěn)定劑、用于抵抗機(jī)械應(yīng)力的穩(wěn)定劑、蛋白酶抑制劑、動(dòng)物生長因子、植物水解物、抗凝結(jié)劑、消泡劑。細(xì)胞生長培養(yǎng)基的特征和組成根據(jù)具體的細(xì)胞要求而變?？缮藤彽募?xì)胞生長培養(yǎng)基的實(shí)例有：mem(最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、bme(eagle基本培養(yǎng)基)、dmem(dulbecco改進(jìn)的eagle培養(yǎng)基)、iscovedmem(iscove改進(jìn)的dulbecco培養(yǎng)基)、gmem、rpmi1640、leibovitzl-15、cho、mccoy’s、medium199、hek293、ham(ham培養(yǎng)基)f10及其衍生物、hamf12、dmem/f12等。

本發(fā)明的宿主細(xì)胞

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

如本文所用，術(shù)語“宿主細(xì)胞”是指任何易受目標(biāo)病毒感染并且適合體外培養(yǎng)的細(xì)胞系。

本發(fā)明的宿主細(xì)胞可以用于離體基因治療目的。在這種實(shí)施方案中，用本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，隨后將其移植入患者或受試者。移植的細(xì)胞可以是自體、同種異體或異源來源。對于臨床使用，一般在良好操作規(guī)范(gmp)條件下進(jìn)行細(xì)胞分離。在移植前，通常檢查細(xì)胞質(zhì)量及不存在微生物或其他污染，且可以例如用照射和/或免疫抑制治療進(jìn)行肝臟預(yù)調(diào)節(jié)。除此外，宿主細(xì)胞可以與生長因子(例如肝細(xì)胞生長因子，hgf)一起移植以刺激細(xì)胞增殖和/或分化。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞用于肝臟的離體基因治療。優(yōu)選地，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其包括人、非人靈長類如類人猿、黑猩猩、猴子和猩猩、馴養(yǎng)動(dòng)物包括狗和貓、以及家畜如馬、牛、豬、綿羊和山羊，或其他哺乳動(dòng)物物種，包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、倉鼠等。本領(lǐng)域技術(shù)人員將根據(jù)待移植的患者或受試者選擇更合適的細(xì)胞。

所述宿主細(xì)胞可以是具有自我更新和多能性質(zhì)的細(xì)胞，例如干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。干細(xì)胞優(yōu)選間充質(zhì)干細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)能夠分為至少一種成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或肌細(xì)胞，且可以從任何類型的組織分離。通常，從骨髓、脂肪組織、臍帶或外周血分離msc。用于獲得它們的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(也稱為ips細(xì)胞或ipsc)是一種能夠從成人細(xì)胞直接產(chǎn)生的多能干細(xì)胞。yamanaka等通過將oct3/4、sox2、klf4和c-myc基因轉(zhuǎn)入小鼠和人成纖維細(xì)胞，并迫使細(xì)胞表達(dá)該基因誘導(dǎo)了ips細(xì)胞(wo2007/069666)。thomson等隨后用nanog和lin28替代klf4和c-myc產(chǎn)生了人ips細(xì)胞(wo2008/118820)。

所述宿主細(xì)胞也可以是肝細(xì)胞。肝細(xì)胞移植程序，包括細(xì)胞分離和隨后移植入人或小鼠受體描述于例如filippi和dhawan,annnyacadsci.2014,131550-55；yoshida等,gastroenterology1996,111:1654-1660；irani等moleculartherapy2001,3:3,302-309；和vogel等jinheritmetabdis2014,37:165-176。將病毒載體離體轉(zhuǎn)導(dǎo)入肝細(xì)胞中的方法描述于例如merle等,scandinavianjournalofgastroenterology2006,41:8,974-982。

在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是包裝細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是粘附或懸浮細(xì)胞。包裝細(xì)胞和輔助載體或dna構(gòu)建體一起順式提供病毒載體完整復(fù)制和包裝所需的所有缺失功能。

優(yōu)選地，所述包裝細(xì)胞是真核細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括猴、人、狗和嚙齒動(dòng)物細(xì)胞。人細(xì)胞的實(shí)例有per.c6細(xì)胞(wo01/38362)、mrc-5(atccccl-171)、wi-38(atccccl-75)、hek-293細(xì)胞(atcccrl-1573)、hela細(xì)胞(atccccl2)和胎兒恒河猴肺細(xì)胞(atcccl-160)。非人靈長類細(xì)胞的實(shí)例有vero細(xì)胞(atccccl81)、cos-1細(xì)胞(atcccrl-1650)或cos-7細(xì)胞(atcccrl-1651)。狗細(xì)胞的實(shí)例是mdck細(xì)胞(atccccl-34)。嚙齒動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例是倉鼠細(xì)胞，例如bhk21-f、hkcc細(xì)胞或cho細(xì)胞。

作為哺乳動(dòng)物來源的替代，用于本發(fā)明的細(xì)胞可以來自禽類來源，例如雞、鴨，鵝、鵪鶉或雉雞。禽類細(xì)胞系的實(shí)例包括禽類胚胎干細(xì)胞(wo01/85938和wo03/076601)、永生鴨視網(wǎng)膜細(xì)胞(wo2005/042728)和禽類胚胎干細(xì)胞的衍生細(xì)胞，包括雞細(xì)胞(wo2006/108846)或鴨細(xì)胞，如eb66細(xì)胞系(wo2008/129058&wo2008/142124)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞，例如sf9細(xì)胞(atcccrl-1711)、sf21細(xì)胞(iplb-sf21)、mg1細(xì)胞(bti-tn-mg1)或highfive^tm細(xì)胞(bti-tn-5b1-4)。

因此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，宿主細(xì)胞包含：

a)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體(即重組aav基因組)，通常是質(zhì)粒；

b)編碼aavrep和/或cap基因且不攜帶itr序列的核酸構(gòu)建體，通常是質(zhì)粒；和/或

c)包含病毒輔助基因的核酸構(gòu)建體，通常是質(zhì)?；虿《尽?/p>

aav復(fù)制所需的病毒基因在本文中稱為病毒輔助基因。通常，所述aav復(fù)制所需的基因是腺病毒輔助基因，例如e1a、e1b、e2a、e4或varna。優(yōu)選地，腺病毒輔助基因是ad5或ad2血清型。

可用常規(guī)方法來生產(chǎn)aav載體的病毒顆粒，其在于使用以下的瞬時(shí)細(xì)胞共轉(zhuǎn)染：攜帶本發(fā)明的重組aav載體/基因組的核酸構(gòu)建體(例如質(zhì)粒)；編碼rep和cap基因但不攜帶itr序列的核酸構(gòu)建體(例如aav輔助質(zhì)粒)；和提供aav復(fù)制所需的腺病毒功能的第三個(gè)核酸構(gòu)建體(例如質(zhì)粒)。

因此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，所述宿主細(xì)胞的特征在于包含：

a)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體(即重組aav基因組)；

b)編碼aavrep和/或cap基因且不攜帶itr序列的核酸構(gòu)建體；和

c)包含腺病毒輔助基因的核酸構(gòu)建體。

或者，可以將rep、cap和腺病毒輔助基因組合在單個(gè)質(zhì)粒上(blouinv等jgenemed.2004；6(suppl):s223-s228；grimmd.等hum.genether.2003；7:839-850)。因此，在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，所述宿主細(xì)胞的特征在于包含：

i)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體(即重組aav基因組)；和

ii)編碼aavrep和/或cap基因且不攜帶itr序列，并且進(jìn)一步包含腺病毒輔助基因的質(zhì)粒。

在進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，所述宿主細(xì)胞包含：

a)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體(即重組aav基因組)；

b)編碼aavrep和/或cap基因且不攜帶itr序列的質(zhì)粒；和

c)包含腺病毒輔助基因e2a、e4和varna的質(zhì)粒，

其中共轉(zhuǎn)染在細(xì)胞，優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如hek-293細(xì)胞，atcccrl-1573)中進(jìn)行，所述細(xì)胞組成型表達(dá)并反式補(bǔ)充腺病毒e1基因。

大規(guī)模生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的aav載體也可以通過例如用重組桿狀病毒的組合感染昆蟲細(xì)胞來進(jìn)行(urabe等hum.genether.2002；13:1935-1943)。用分別表達(dá)aavrep、aavcap和待包裝的aav載體的三個(gè)桿狀病毒共轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞。重組桿狀病毒載體將提供病毒復(fù)制和/或包裝所需的病毒輔助基因功能。

通過使用編碼aav血清型的reporf(開放閱讀框)和不同血清型aav的caporf的輔助質(zhì)粒，將給定aav血清型的itr側(cè)翼的載體包裝到由不同血清型的衣殼結(jié)構(gòu)蛋白組裝的病毒粒子中是可行的。也可以用該相同方法包裝鑲嵌、嵌合或靶向載體。

另一方面，根據(jù)本發(fā)明的hc-ad載體的生產(chǎn)可以通過組成型表達(dá)和反式補(bǔ)充腺病毒e1基因以及cre重組酶的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如293cre細(xì)胞)來進(jìn)行。這些細(xì)胞用hc-ad載體基因組轉(zhuǎn)染，并用其中包裝信號(hào)側(cè)翼是loxp序列的第一代腺病毒輔助病毒(缺失e1)感染[parksrj等proc.natl.acad.sci.usa1996；13565-13570；對于293crecells,參見palmerandengel.mol.ther.2003；8:846-852]。已經(jīng)描述了可以用于包裝hc-ad載體的數(shù)種基于cre/loxp的輔助病毒細(xì)胞，例如adadlc8cluc或優(yōu)化的自我滅活的adtetcre輔助病毒(ep2295591；gonzalez-aparicio等genetherapy2011；18:1025-1033)。

用于構(gòu)建和生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的用于基因治療的病毒載體的進(jìn)一步指導(dǎo)可以在以下中發(fā)現(xiàn)：

viralvectorsforgenetherapy,methodsandprotocols.series:methodsinmolecularbiology,vol.737.mertenandal-rubeai(eds.)；2011humanapress(springer).

genetherapy.m.giacca.2010springer-verlag.

heilbronnr.andwegers.viralvectorsforgenetransfer:currentstatusofgenetherapeutics.in:drugdelivery,handbookofexperimentalpharmacology197；m.(ed.).2010springer-verlag；pp.143-170.

adeno-associatedvirus:methodsandprotocols.r.o.snyderandp.moulllier(eds).2011humanapress(springer).

bünningh.等.recentdevelopmentsinadeno-associatedvirustechnology.j.genemed.2008；10:717-733.

adenovirus:methodsandprotocols.m.chillónanda.bosch(eds.)；thirdedition.2014humanapress(springer)。

治療用途

在進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及在發(fā)明簡述中定義的本發(fā)明的產(chǎn)品用作藥物的用途。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在發(fā)明簡述中定義的本發(fā)明的產(chǎn)品用于治療由銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2缺乏或功能障礙引起的病癥，以及其中銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2表達(dá)和活性上調(diào)可以產(chǎn)生治療益處或改善的任何其他病癥或疾病，尤其是與atp7b依賴性溶酶體胞吐作用減少和溶酶體中銅積聚相關(guān)的疾病或病癥，例如膽汁淤積性疾病，阿爾茨海默病和/或癌癥的用途(polishchuck等devcell.2014,29(6),686-700；guptaandlutsenko,futuremed.chem.2009,1,1125-1142)。

待治療的受試者可以是哺乳動(dòng)物，尤其是人患者。

在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，由銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2缺乏或功能障礙引起的病癥是威爾森病(wd，onlinemendelianinheritanceinmancatalogaccessionnumberomin277900；http://www.omim.org/entry/277900)。

在一個(gè)相關(guān)的方面，本發(fā)明涉及在發(fā)明簡述中定義的本發(fā)明的產(chǎn)品在制備用于治療由銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2缺乏或功能障礙引起的病癥，以及其中銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2表達(dá)和活性上調(diào)可以產(chǎn)生治療益處或改善的任何其他病癥和疾病，優(yōu)選用于治療威爾森病的藥物中的用途。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及治療患者中由銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2缺乏或功能障礙引起的病癥，以及其中銅轉(zhuǎn)運(yùn)atpase2表達(dá)和活性上調(diào)可以產(chǎn)生治療益處或改善的任何其他病癥和疾病，優(yōu)選用于治療威爾森病，包括向所述患者施用治療有效量的本發(fā)明的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞、病毒顆?；蛩幬锝M合物。

用本發(fā)明的產(chǎn)品治療可以緩和、改善或減輕wd的一種或多種癥狀的嚴(yán)重程度。例如，治療可以增加和/或恢復(fù)全血銅藍(lán)蛋白合成、銅藍(lán)蛋白氧化酶活性和/或膽汁中的銅排出(從而減少血清、肝、腦和尿中的銅積聚)；從而可以緩和、改善或減輕腹痛、疲勞、黃疸、不受控制運(yùn)動(dòng)的頻率、肌肉僵硬、語言問題、吞咽或身體協(xié)調(diào)。

本發(fā)明的產(chǎn)品通常將包括于藥物組合物或藥物中，任選與藥物載體、稀釋劑和/或佐劑組合。這種組合物或醫(yī)藥產(chǎn)品包括足以提供所需療效的有效量的本發(fā)明的產(chǎn)品和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

因此，在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞或病毒顆粒和藥學(xué)上可接受的載體。

任何合適的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑可用于制備根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物(參見例如，remington:thescienceandpracticeofpharmacy,alfonsor.gennaro(editor)mackpublishingcompany,april1997)。藥物組合物通常在制備和儲(chǔ)存條件是無菌且穩(wěn)定的。藥物組合物可以配制為溶液(例如鹽水、葡聚糖溶液或緩沖溶液，或其他藥學(xué)上可接受的無菌流體)、微乳劑、脂質(zhì)體或其他適合于容納高產(chǎn)品濃度的有序結(jié)構(gòu)(例如微?；蚣{米顆粒)。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物。可以通過使用包衣例如卵磷脂，在分散體的情況下通過維持所需的粒徑和通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在很多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化鈉。可以通過在組合物中包括延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鹽和明膠來實(shí)現(xiàn)可注射組合物的延長吸收。本發(fā)明的產(chǎn)品可以受控釋放的制劑施用，例如在包括緩釋聚合物或保護(hù)產(chǎn)品不快速釋放的其他載體的組合物中，包括植入物和微包封的遞送系統(tǒng)。例如可以使用生物可降解和生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸/聚乙醇酸共聚物(plg)。優(yōu)選地，所述藥物組合物配制為溶液，更優(yōu)選為任選緩沖的鹽水溶液。

也可以在本發(fā)明的藥物組合物中加入補(bǔ)充的活性化合物。共施用額外治療的指導(dǎo)可以例如發(fā)現(xiàn)于加拿大藥劑師協(xié)會(huì)的藥劑專業(yè)概要(cps)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，本發(fā)明的藥物組合物是腸胃外藥物組合物，包括適用于靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)施用的組合物。這些藥物組合物僅僅是示例性的，并不限制適用于其他腸胃外和非腸胃外施用途徑的藥物組合物。

在本發(fā)明上下文中，“有效量”是指治療有效量。

如本文所用，“治療有效量”是指以一定劑量和一段時(shí)間，實(shí)現(xiàn)期望的治療結(jié)果，例如銅易位活動(dòng)的升高，從而增加膽汁中的銅并減少血清、肝、腦和尿中的銅所需的量。本發(fā)明的產(chǎn)品或包含它的藥物組合物的治療有效量可以根據(jù)以下因素變化：個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重，以及產(chǎn)品或藥物組合物在個(gè)體中引起期望反應(yīng)的能力。可以調(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳治療反應(yīng)。治療有效量也通常是產(chǎn)品或藥物組合物的治療有益效果超過任何有毒或有害作用的量。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，通過腸胃外途徑向受試者或患者施用攜帶本發(fā)明的產(chǎn)品的藥物組合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，藥物組合物通過靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)施用。

在一個(gè)實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，包含本發(fā)明的產(chǎn)品的藥物組合物通過間質(zhì)途徑施用，即通過注射至或注射入組織的間隙。組織靶標(biāo)可以是特異性的，例如肝組織，或也可以是幾個(gè)組織的組合，例如肌肉和肝組織。示例性的組織靶標(biāo)可以包括肝、骨骼肌、心肌、脂肪沉積物、腎、肺、血管內(nèi)皮、上皮細(xì)胞和/或造血細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，任選與如上文或如下文所述的各種實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)特征組合，它通過肝內(nèi)注射施用，即注射入肝組織的間質(zhì)空間。

向受試者或患者施用的本發(fā)明的產(chǎn)品的量可以根據(jù)個(gè)體受試者或患者的具體情況變化，包括個(gè)體的年齡、性別和體重；疾病的性質(zhì)和階段，疾病的侵襲性；施用途徑；和/或?yàn)槭茉囌呋蚧颊唛_的伴隨藥物?？梢哉{(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳治療反應(yīng)。

對于任何特定的受試者，可以根據(jù)個(gè)體需要和施用或監(jiān)督組合物施用的人的專業(yè)判斷來調(diào)節(jié)特定的劑量方案。本文所述的劑量范圍僅僅是示例性的，不限制醫(yī)生可以選擇的劑量范圍。

在一個(gè)實(shí)施方案中，為治療威爾森病，可以向受試者或患者以5x10¹¹-1x10¹⁴vg/kg(vg:病毒基因組；kg:受試者或患者的體重)的量或劑量施用根據(jù)本發(fā)明的aav載體。在一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，aav載體以1x10¹²-1x10¹³vg/kg的量施用。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，為治療威爾森病，可以向受試者或患者以1x10⁹-1x10¹¹vg/kgiu/kg(iu:載體的感染單位)的量或劑量施用根據(jù)本發(fā)明的hc-ad載體。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明進(jìn)一步涉及在一個(gè)或多個(gè)容器中包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體、載體、病毒顆?；蛩幬锝M合物的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒可以包括如何向患者施用試劑盒中包含的本發(fā)明的核酸構(gòu)建體、載體、宿主細(xì)胞或病毒顆粒的說明書或包裝材料。試劑盒的容器可以是任何合適的材料，例如玻璃、塑料、金屬等，和可以是任何尺寸、形狀或構(gòu)象。在某些實(shí)施方案中，試劑盒可以包括一個(gè)或多個(gè)安瓿或注射器，其包含合適的液體或溶液形式的本發(fā)明的核酸構(gòu)建體、載體、宿主細(xì)胞、病毒顆?；蛩幬锝M合物。

貫穿說明書和權(quán)利要求，詞語“包含”及其變體不意欲排除其他技術(shù)特征、添加劑、成分或步驟。此外，詞語“包含”涵蓋“由…組成”的情況。本發(fā)明的其他目的、優(yōu)勢和特征對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言在閱讀本說明書時(shí)將變得明顯，或可以通過實(shí)施本發(fā)明來學(xué)習(xí)。以下實(shí)施例以說明性的方式提供，它們并與意欲限制本發(fā)明。此外，本發(fā)明覆蓋本文所述的具體和優(yōu)選實(shí)施方案的所有可能組合。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1.構(gòu)建重組表達(dá)載體

為進(jìn)行威爾森病(wd)的基因治療，設(shè)計(jì)并產(chǎn)生五個(gè)不同的攜帶且表達(dá)人atp7b、或人atp7b的截短形式的aav載體：aav2/8aat-wtatp7b、aav2/8-aat-coatp7b、aav2/8-aat-atp7b(d223-366)、aav2/8aat-atp7b(d57-486)和aav2/8aat-coatp7b(d57-486)。

1.1載體aav2/8aat-wtatp7b[本文也稱為aav-wtatp7b]

該載體的基因組序列鑒定為seqidno：1。

首先，根據(jù)要求(genscript)通過將核酸構(gòu)建體克隆到puc57質(zhì)粒中組裝質(zhì)粒puc-atp7b。核酸構(gòu)建體包含編碼人atp7b(轉(zhuǎn)基因)和轉(zhuǎn)基因下游的合成聚腺苷酸化信號(hào)序列(levittn.等genes&development1989；3(7):1019-1025)。

然后，將α1抗胰蛋白酶基因(aat)的最小啟動(dòng)子引入質(zhì)粒puc-atp7b，在atp7b基因的上游。最小啟動(dòng)子由相對于aat啟動(dòng)子的cap位點(diǎn)而言核苷酸-261至核苷酸+44的序列組成，且包含肝功能所需的組織特異性元件(tse)和完整啟動(dòng)子活性所需的遠(yuǎn)端區(qū)(dri)。使用penhalbaat-熒光素酶質(zhì)粒(由m.g.kramer提供)作為模板并用以下引物通過pcr擴(kuò)增獲得aat啟動(dòng)子：

引物aat-正向

5’ctggtctagaacgcgtcgccaccccctccaccttgg3’(seqidno：10)；和

引物aat-反向

5’atcatgatgcggccgcttcactgtcccaggtcagtg3’(seqidno：11)。

aat正向引物具有xbai和mlui的限制性位點(diǎn)；3’aat反向引物具有noti的限制性位點(diǎn)。

因此，為獲得質(zhì)粒puc-aat-atp7b，用xbai和noti消化質(zhì)粒puc-atp7b，并將其與之前用相同酶消化的aat啟動(dòng)子連接。

然后通過用限制性酶pmli和mlui消化將表達(dá)盒亞克隆入aav轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(agilenttechnologies),從而產(chǎn)生質(zhì)粒paav2-aat-wtatp7b。

一旦構(gòu)建質(zhì)粒，通過將質(zhì)粒paav2-aat-atp7b和質(zhì)粒pdp8(從plasmidfactory,bielefeld,germany獲得；質(zhì)粒pdp8表達(dá)aav8衣殼蛋白、aav2rep蛋白和aav產(chǎn)生和包裝所需的腺病毒分子)雙重轉(zhuǎn)染入293個(gè)細(xì)胞來制備aav載體。

最后通過碘克沙醇梯度純化載體，并通過定量pcr滴定。

1.2載體aav2/8-aat-coatp7b[本文也稱為aav-coatp7b]

該載體的基因組序列鑒定為seqidno：3。

為獲得表達(dá)密碼子優(yōu)化版本的atp7b基因(coatp7b)的aav載體，首先根據(jù)要求(genscript)通過將核酸構(gòu)建體克隆到puc57質(zhì)粒中組裝質(zhì)粒puc-coatp7b。然后，通過用限制性酶noti和kpni消化從puc-coatp7b切出coatp7b，并將其亞克隆入之前用相同酶noti和kpni消化的paav2-aat-wtatp7b質(zhì)粒，獲得質(zhì)粒paav2-aat-coatp7b。

一旦構(gòu)建質(zhì)粒，如之前對于載體aav2/8-aat-wtatp7b所述一樣，產(chǎn)生載體基因組并包裝病毒顆粒：與質(zhì)粒pdp8一起雙重轉(zhuǎn)染之前獲得的質(zhì)粒paav2-aat-coatp7b，純化(碘克沙醇梯度)并滴定。

1.3載體aav2/8aat-atp7b(d223-366)[本文也稱為aav-t1]

該載體攜帶的轉(zhuǎn)基因是編碼atp7b(d223-366)的核酸序列(seqidno：12)，其是其中氨基酸223-366缺失的人atp7b的截短形式。缺失序列包括hma3結(jié)構(gòu)域和hma4結(jié)構(gòu)域的7個(gè)氨基酸。

為獲得載體，用限制性酶mfei和naei消化質(zhì)粒puc57-wtatp7b以獲得質(zhì)粒puc57-atp7b-t1。如此，編碼區(qū)的大小減少432個(gè)核苷酸，蛋白的大小減少144個(gè)氨基酸。

一旦構(gòu)建質(zhì)粒，如之前對于載體aav2/8-aat-wtatp7b所述一樣，產(chǎn)生載體基因組并包裝病毒顆粒：與aat啟動(dòng)子連接，亞克隆入質(zhì)粒paav-mcs，與質(zhì)粒pdp8一起雙重轉(zhuǎn)染之前獲得的質(zhì)粒paav2-aat-t1，病毒純化(碘克沙醇梯度)并滴定。

1.4載體aav2/8-aat-atp7b(d57-486)[本文也稱為aav-t2]

該載體的基因組序列鑒定為seqidno：6。

該載體攜帶的轉(zhuǎn)基因是編碼atp7b(d57-486)的核酸序列(也稱為atp7b-t2)，所述atp7b(d57-486)是其中氨基酸57-486缺失的人atp7b的截短形式。如此，開始的4個(gè)hma結(jié)構(gòu)域被消除，同時(shí)保留了包含氨基末端區(qū)域的56個(gè)氨基酸的信號(hào)序列，編碼區(qū)的大小減少1.29kb，蛋白的大小減少430個(gè)氨基酸。

用puc57-wtatp7b作為模板并用以下兩組引物通過pcr擴(kuò)增獲得atp7b(d57-486)的核苷酸序列：

擴(kuò)增氨基末端序列的第一組引物：

引物f1：

5’ctagatgcggccgccaccatgcctg3’(seqidno：14)，

和

引物r1:

5’ctgagaagaagggcccaggcc3’(seqidno：15)；和

擴(kuò)增羧基末端區(qū)的第二組引物:

引物f2:

5’ggcccttcttctcagccgcagaagtgcttcttacag3’(seqidno：16),和

引物r2:

5’accaaaatcgataaaaccgattacaatcc3’(seqidno：17)。

引物r1和f2的5’末端序列是互補(bǔ)的。用等摩爾量的兩個(gè)pcr的純化片段作為模板和引物f1和r2，進(jìn)行pcr來獲得編碼atp7b(d57-486)的核苷酸序列。然后將pcr產(chǎn)物用noti和clai消化，并克隆入之前用兩種酶消化的puc57-aat-wtatp7b質(zhì)粒，從而獲得質(zhì)粒puc57-atp7b-t2。

一旦構(gòu)建質(zhì)粒puc57-atp7b-t2，如之前對于載體aav2/8-aat-wtatp7b所述一樣，產(chǎn)生載體基因組并包裝病毒顆粒：與aat啟動(dòng)子連接，亞克隆入質(zhì)粒paav-mcs，與質(zhì)粒pdp8一起雙重轉(zhuǎn)染之前獲得的質(zhì)粒paav2-aat-t2，病毒純化(碘克沙醇梯度)并滴定。

1.5載體aav2/8aat-coatp7b(d57-486)[本文也稱為aav-aat-cot2]

該載體攜帶的轉(zhuǎn)基因是也編碼atp7b(d57-486)的密碼子優(yōu)化的核酸序列[seqidno：8；coatp7b(d57-486)或coatp7b-t2]。

用puc57-coatp7b作為模板并用以下兩組引物通過pcr擴(kuò)增獲得coatp7b(d57-486)的核苷酸序列：

擴(kuò)增氨基末端序列的第一組引物：

引物f3：

5’acgcgtgcggccgccaccatgccag3’(seqidno：18),

和

引物r3:

5’ctgggagctaggtcccagtcc3’(seqidno：19)；和

擴(kuò)增羧基末端區(qū)的第二組引物:

引物f4:

5’ggacctagctcccagcctcagaagtgttttctgcag3’(seqidno：20)，和

引物r4:

5’tgttcctcgcgaatgatcaggttgtcctc3’(seqidno：21)。

引物r3和f4的5’末端序列是互補(bǔ)的。用等摩爾量的兩個(gè)pcr的純化片段作為模板和引物f3和r4，進(jìn)行pcr來獲得編碼atp7b(d57-486)的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列。然后將pcr產(chǎn)物用noti和nrui消化，并克隆入之前用兩種酶消化的puc57-aat-wtatp7b質(zhì)粒，從而獲得質(zhì)粒puc57-coatp7b-t2。

一旦構(gòu)建質(zhì)粒puc57-coatp7b-t2，如之前對于載體aav2/8-aat-wtatp7b所述一樣，產(chǎn)生載體基因組并包裝病毒顆粒：與aat啟動(dòng)子連接，亞克隆入質(zhì)粒paav-mcs，與質(zhì)粒pdp8一起雙重轉(zhuǎn)染之前獲得的質(zhì)粒paav2-aat-cot2，病毒純化(碘克沙醇梯度)并滴定。

實(shí)施例2.威爾森病動(dòng)物模型：atp7bko

在wd的代表性動(dòng)物模型atp7b敲除小鼠(atp7bko、atp7b-/-或wd小鼠)中測試載體aav2/8-aat-atp7b-t1和aav2/8-aat-atp7b-t2的治療性能。該動(dòng)物模型由buiakova等通過以下開發(fā)：通過用方向相反的轉(zhuǎn)錄框中的新霉素盒來替代一部分atp7b外顯子2在小鼠atp7bmrna中引入提前終止密碼子(buikovao.i.等humanmoleculargenetics1999；8(9):1665-1671)。atp7b敲除小鼠顯示atp7b在肝中不表達(dá)、尿中cu排出高、血清中全血銅藍(lán)蛋白水平低、轉(zhuǎn)氨酶水平高、肝中cu濃度高和病理性肝組織學(xué)。這些小鼠顯示除了神經(jīng)系統(tǒng)影響之外的人威爾森病的典型生化特征(lutsenkos.biochemicalsocietytransactions2008；36(pt6):1233-1238)。

實(shí)施例3.測定病毒載體aav2/8-aat-atp7b-t1和aav2/8-aat-atp7b-t2在威爾森病小鼠中的療效

將六周(6w)齡雄性atp7b-/-小鼠分為4組，每組5只小鼠：一組用劑量為3x10¹⁰vg/小鼠(vg:病毒基因組)的載體aav2/8-aat-wtatp7b靜脈內(nèi)處理；第二組用相同劑量的載體aav2/8-aat-atp7b-t1；第三組用相同劑量的載體aav2/8-aat-atp7b-t2；第四組未處理。另一組野生型小鼠保持未處理作為對照組(對照)。施用載體24周后(30w)處死動(dòng)物。

施用載體4周后且之后每五周直到第30周；測定所有組中的血清轉(zhuǎn)氨酶(alt)水平和尿cu含量。處理4周后測量血清銅藍(lán)蛋白活性。

血清轉(zhuǎn)氨酶(alt)水平通過dgkc方法(rochediagnostics,mannheim,germany)用hitachi747臨床分析儀(hitachi,tokyo,japan)測定。

如schosinsky和cols.(clinicalchemistry1974；20(12):1556-1563)所述，血清銅藍(lán)蛋白活性用ο-二茴香胺二鹽酸鹽(4,4'-二氨基-3,3'-二甲氧基-聯(lián)苯)作為底物(sigma-aldrich,sanlouis,mo,unitedstates)進(jìn)行測定。在分光光度計(jì)中測量540nm的吸光度。

尿銅含量通過原子吸收光譜(simaa6000,fromperkin-elmergmbh,bodenseewerk)測定。

處死后，切除肝臟用于組織學(xué)分析。

通過原子吸收光譜(simaa6000,fromperkin-elmergmbh,bodenseewerk)，并通過timm硫化銀染色(danscherg.andzimmerj.histochemistry1978；55(1):27-40)測定干燥肝組織中的肝銅含量。

在用蘇木精和伊紅染色的切片中評(píng)估肝臟結(jié)構(gòu)。

用抗小鼠cd45抗體(biolegend,sandiego,usa；catalognumber103102)的免疫組化來檢測肝臟中的炎癥浸潤。

還用抗小鼠panck抗體(invitrogen/lifetechnologies,18-0132,clonae1/ae3)的免疫組化來檢測膽管細(xì)胞。

為測定纖維化，我們使用常規(guī)天狼猩紅染色作為膠原測定方法。

如圖2所示，轉(zhuǎn)氨酶水平在接受aav2/8-aat-wtatp7b或aav2/8-aat-atp7b-t2的小鼠中正常，但在用aav2/8-aat-atp7b-t1處理的動(dòng)物中不正常。此外，接受aav2/8-aat-wtatp7b、aav2/8-aat-atp7b-t1或aav2/8-aat-atp7b-t2的動(dòng)物的尿中的cu濃度顯著更低；然而aav2/8-aat-atp7b-t1在降低尿中的cu濃度方面效率較低(圖3)。在接受aav2/8-aat-wtatp7b或aav2/8-aat-atp7b-t2的動(dòng)物中，銅藍(lán)蛋白活性在處理四周后恢復(fù)，但在用aav2/8-aat-atp7b-t1處理的動(dòng)物中并沒有(圖4)。該結(jié)果通過蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)。在用aav2/8-aat-wtatp7b或aav2/8-aat-atp7b-t2處理的小鼠中檢測到全血銅藍(lán)蛋白，但在用aav2/8-aat-atp7b-t1處理的動(dòng)物中沒有，其中在未處理wd小鼠中僅檢測到載脂蛋白銅藍(lán)蛋白形式。

另一方面，施用av2/8-aat-wtatp7b、aav2/8-aat-atp7b-t1或aav2/8-aat-atp7b-t2顯著降低肝臟中的cu含量；然而，aav2/8-aat-atp7b-t1在降低肝臟中的cu濃度方面效率較低(圖5)。該結(jié)果在timm染色后所得圖像中得到證實(shí)(圖6b)。關(guān)于肝臟組織學(xué)，未處理動(dòng)物顯示肝結(jié)構(gòu)異常，其具有含有巨大核的巨大肝細(xì)胞。施用載體aav2/8-aat-wtatp7b或aav2/8-aat-atp7b-t2而不是aav2/8-aat-atp7b-t1導(dǎo)致肝臟組織學(xué)正常化(圖6a)。此外，wd動(dòng)物顯示主要由cd45陽性細(xì)胞組成的強(qiáng)肝臟浸潤；用重組病毒載體處理后浸潤消失(圖7)。因此，施用aav載體導(dǎo)致炎癥浸潤明顯降低。此外，在aav2/8-aat-wtatp7b、aav2/8-aat-atp7b-t2和aav2/8-aat-atp7b-t1處理的wd小鼠中，膽道增生和肝纖維化也顯著降低。

實(shí)施例4.病毒載體aav2/8-aat-atp7b(d57-486)在威爾森病雌性小鼠中的療效

將六周(6w)齡雌性atp7b-/-小鼠分為4組，每組5只小鼠：第1-3組動(dòng)物用病毒載體aav2/8-aat-atp7b(d57-486)靜脈內(nèi)處理，各組接受不同劑量(分別為1x10¹⁰、3x10¹⁰和1x10¹¹vg/小鼠)；第四組未處理。另一組野生型小鼠保持未處理作為對照組(wt)。

施用載體4周后且之后每五周直到處理后第24周(當(dāng)小鼠為30周齡時(shí))，通過實(shí)施例3中所述的相同方法，測定所有組中的血清轉(zhuǎn)氨酶(alt)水平和尿cu含量。

如圖8所示，兩個(gè)最高劑量(3x10¹⁰和1x10¹¹vg/小鼠)的aav2/8-aat-atp7b(d57-486)使wd雌性小鼠的轉(zhuǎn)氨酶水平正?；蛔畹蛣┝?x10¹⁰vg/小鼠顯著降低轉(zhuǎn)氨酶水平但不能消除肝臟損傷。然而，用三個(gè)不同劑量處理顯著降低cu尿排出，達(dá)到wt小鼠中發(fā)現(xiàn)的水平(圖9)。

實(shí)施例5.病毒載體aav2/8-aat-wtatp7b和aav2/8-aat-atp7b(d57-486)在威爾森病雌性小鼠中的療效的比較

建立兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組。對于各實(shí)驗(yàn)組，將六周(6w)齡雌性atp7b-/-小鼠分為4組，每組5只小鼠：3組動(dòng)物用待測試的病毒載體靜脈內(nèi)處理，各組接受不同劑量(分別為1x10¹⁰、3x10¹⁰和1x10¹¹vg/小鼠)；第四組未處理。另一組野生型小鼠保持未處理作為對照組(wt)。

在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)組中(實(shí)驗(yàn)組1)，向接受治療的wd小鼠施用載體aav2/8-aat-wtatp7b；在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)組中(實(shí)驗(yàn)組2)，向它們施用載體aav2/8-aat-atp7b(d57-486)。

通過實(shí)施例3所述的相同方法，在處理后4周測定血清銅藍(lán)蛋白活性，在處理后24周測定肝cu含量。

血清銅藍(lán)蛋白活性

血清銅藍(lán)蛋白活性僅通過施用最高劑量的aav2/8-aat-wtatp7b載體得到糾正(圖10a，實(shí)驗(yàn)組1)；在施用兩個(gè)最低劑量后沒有觀察到效果。

相反，aav2/8-aat-atp7b(d57-486)載體在最低劑量1x10¹⁰vg/小鼠顯著增加銅藍(lán)蛋白水平；施用中等劑量的載體使銅藍(lán)蛋白水平正常化，最高劑量增加銅藍(lán)蛋白活性超過正常水平(圖10b，實(shí)驗(yàn)組2)。

肝臟中的cu濃度

此外，施用兩個(gè)最高劑量的aav2/8-aat-wtatp7b降低了肝臟中的cu濃度，但沒有使其正?；?；在最低劑量沒有觀察到效果(圖11a，實(shí)驗(yàn)組1)。相反，以所有測試劑量施用aav2/8-aat-atp7b(d57-486)載體后均降低了cu濃度，且在最高劑量的水平接近正常(圖11b，實(shí)驗(yàn)組2)。

因此，對于獲得血清銅藍(lán)蛋白活性的正?；透闻K中cu積聚的降低，表明wt構(gòu)建體的“次優(yōu)劑量”是劑量為1x10¹⁰vg/小鼠的aav2/8-aat-wtatp7b載體；而攜帶截短形式的載體在所述次優(yōu)劑量出乎意料地提供統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的療效。

實(shí)施例6.病毒載體aav2/8-aat-wtatp7b和aav2/8-aat-atp7b(d57-486)在wd小鼠中的療效的比較

將六周(6w)齡雄性atp7b-/-小鼠分為3組小鼠：2組動(dòng)物分別用次優(yōu)靜脈內(nèi)劑量(1x10¹⁰vg/小鼠)的載體aav2/8-aat-wtatp7b或載體aav2/8-aat-atp7b(d57-486)處理；第3組未處理。另一組野生型小鼠保持未處理作為對照組(wt)。

通過實(shí)施例3所述的相同方法測量肝cu含量。

如圖12所示，盡管次優(yōu)劑量的兩個(gè)載體aav2/8-aat-wtatp7b和aav2/8-aat-atp7b(d57-486)均降低了wd小鼠肝臟中的銅積聚，aav2/8-aat-atp7b(d57-486)提供的肝銅含量降低顯著大于aav2/8-aat-wtatp7b提供的降低。

實(shí)施例7.病毒載體aav2/8-aat-atp7b(d57-486)和aav-aat-coatp7b(d57-486)在wd小鼠中的療效的比較

將六周(6w)齡雄性atp7b-/-小鼠分為3組小鼠：2組動(dòng)物分別用次優(yōu)靜脈內(nèi)劑量(1x10¹⁰vg/小鼠)的載體aav2/8-aat-atp7b(d57-486)和aav-aat-coatp7b(d57-486)處理；第3組未處理。另一組野生型小鼠保持未處理作為對照組(wt)。

通過實(shí)施例3所述的相同方法測量肝cu含量。

如圖13所示，盡管次優(yōu)劑量的兩個(gè)載體aav2/8-aat-atp7b(d57-486)和aav2/8-aat-coatp7b(d57-486)均降低了wd小鼠肝臟中的銅積聚，aav2/8-aat-coatp7b(d57-486)提供的肝銅含量降低顯著大于aav2/8-aat-atp7b(d57-486)提供的降低。

實(shí)施例8.密碼子優(yōu)化的病毒載體aav2/8-aat-coatp7b(d57-486)在wd小鼠中的療效

將六周(6w)齡雄性atp7b-/-小鼠分為5組小鼠：4組動(dòng)物分別用次優(yōu)靜脈內(nèi)劑量(1x10¹⁰vg/小鼠)的載體aav2/8-aat-wtatp7b、aav2/8-aat-coatp7b、aav2/8-aat-atp7b(d57-486)或aav2/8-aat-coatp7b(d57-486)處理；第5組未處理。另一組野生型小鼠保持未處理作為對照組(wt)。

通過實(shí)施例3所述的相同方法測量血清銅藍(lán)蛋白活性。

如圖14所示，當(dāng)以次優(yōu)劑量向wd小鼠施用時(shí)，攜帶截短atp7b-t2的核苷酸序列的兩個(gè)載體恢復(fù)了銅藍(lán)蛋白氧化酶活性，而當(dāng)以相同處理?xiàng)l件施用時(shí)，攜帶編碼完整人atp7b的核苷酸序列的載體沒有提供任何銅藍(lán)蛋白活性的顯著改進(jìn)。