發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明總體上涉及編碼具有植酸酶的酶活性的多肽或蛋白的新的和改進(jìn)的核酸序列和在宿主細(xì)胞中有效地表達(dá)這樣的酶的方法。

在第一個方面，本發(fā)明涉及一種分離的核酸分子，其i)包含編碼具有植酸酶活性的蛋白的根據(jù)seqidno:1的核苷酸序列或ii)具有與編碼具有植酸酶活性的蛋白的根據(jù)seqidno:1的核苷酸序列至少78%的序列同一性。

本發(fā)明也涉及包含上述分離的核酸分子的表達(dá)構(gòu)建體或載體。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)具有植酸酶的酶活性的蛋白的方法，其包括以下步驟：

a)將載體引入宿主細(xì)胞，所述載體包含：

i)在宿主細(xì)胞中有功能的調(diào)節(jié)表達(dá)的元件；和

ii)可操作地與其連接的如本文定義的核酸分子；

b)在適合于表達(dá)蛋白的條件下，培養(yǎng)在步驟a)中獲得的宿主細(xì)胞，和任選地

c)從細(xì)胞培養(yǎng)物回收在步驟b)中產(chǎn)生的蛋白。

本發(fā)明還涉及通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的蛋白及其在制備用于動物飼料的添加劑中的用途。

發(fā)明背景

本發(fā)明總體上涉及編碼具有植酸酶的酶活性的多肽或蛋白的新的核酸分子，并且涉及在宿主細(xì)胞中有效地生產(chǎn)這樣一種具有植酸酶活性的蛋白的方法。本發(fā)明還涉及通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的多肽或蛋白及其作為活性成分在制作用于動物飼料和/或用于釋放來自土壤的有機(jī)物質(zhì)的磷酸鹽的添加劑中的用途。

元素磷或純磷(p)在自然界中是很少見的，其通常作為分子的部分被發(fā)現(xiàn)，所述分子的部分包括連接于基于動物和植物組織的碳的有機(jī)基團(tuán)的磷酸根基團(tuán)(po43-)。

然而，對于植物和動物，磷(p)是重要的營養(yǎng)素。p是重要的植物宏量營養(yǎng)素，構(gòu)成約0.2%的植物的干重。它是關(guān)鍵分子例如核酸、磷脂，和atp的成分，因此，沒有這種營養(yǎng)素的可靠的供給，植物不能生長。無機(jī)磷是可以被植物吸收和攝取的磷的唯一來源。由于在土壤中只有低可用性的無機(jī)磷，迫使農(nóng)民使宏量營養(yǎng)素p變?yōu)榭衫玫摹?/p>

動物同樣需要磷作為營養(yǎng)素，其一般可以例如在食物中的無機(jī)磷形式或者通過組成食物的有機(jī)磷各種成分的降解來提供。

植酸(phyticacid)或植酸鹽(phytate)是磷在植物例如谷物、豆類、油籽中的主要存儲形式，其值范圍是從1至5%重量。“植酸”，也稱為肌醇六磷酸(ip6)，或其鹽“植酸鹽”，是飽和環(huán)狀酸。而且，植酸通常螯合某些重要的少量礦物質(zhì)例如鋅和鐵，因此使得這些礦物質(zhì)不能被吸收，并且在較小程度上，也螯合巨量礦物質(zhì)例如鈣和鎂。植酸鈣鎂特別指植酸的鈣或鎂鹽形式。植酸的分解代謝物被稱為低級肌醇多磷酸鹽。實(shí)例有肌醇五-(ip5)、四-(ip4)，和三磷酸鹽(ip3)。谷物和豆科植物中含有的超過三分之二的磷以植酸鹽的形式存在。

植酸鹽是人或非反芻類動物(單胃動物)不能消化的，因此如果直接攝入的話，它不是一種肌醇或者磷酸鹽的適當(dāng)?shù)膩碓础Ｌ貏e地，對非-反芻類動物而言，以植酸鹽的形式存在的磷和肌醇不能成為可生物利用的，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈脑谥菜猁}分子中的肌醇除去磷酸根所需要的消化性酶植酸酶。以植酸鹽的形式存在的磷組成由單胃動物攝入的植物來源的約20和40%之間的磷。

由于植酸鹽不能被非-反芻類動物吸收，未吸收的植酸鹽通常通過胃腸道，提高了糞肥中的磷量。過量的磷排泄可導(dǎo)致環(huán)境和生態(tài)問題，例如富營養(yǎng)化。磷污染土壤給農(nóng)業(yè)(特別是在使用單胃動物的密集型農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中)帶來了一個嚴(yán)重的問題。

而且，雖然小腸中的腸道菌叢的一些微生物能夠水解植酸，磷只能少量被吸收。另一方面，過量的植酸鹽具有抗?fàn)I養(yǎng)-因子的作用，因?yàn)橹菜猁}能夠螯合必需的金屬離子例如鈣、銅或鋅，這些離子對動物營養(yǎng)是必需的，從而降低其營養(yǎng)價(jià)值。

為避免上述缺點(diǎn)，動物食物通常富含無機(jī)磷，其進(jìn)而增加畜牧業(yè)生產(chǎn)的成本。目前達(dá)到減輕這些缺點(diǎn)的一個另外的方法是直接加入植酸酶，其催化植酸鹽的水解以釋放有機(jī)磷，以及對于動物食物可使得有機(jī)磷為可利用的和容易取得的。

使用微生物植酸酶目前被批準(zhǔn)用于動物飼料，其目的是增加來自植酸的磷的可用性。例如，由米曲霉(aspergillusoryzae)(dsm14223)產(chǎn)生的6-植酸酶被歐洲共同體規(guī)定(ec)號255/2005授權(quán)用于增肥雞、蛋雞、增肥火雞、肥育豬和母豬。這些植酸酶是極其弱的和不穩(wěn)定的，ph在5.0和7.5之間時(shí)表現(xiàn)出最大的活性，以致活性因在胃中的低ph值(ph2-3)而顯著減低和受到限制。也已知植酸酶受過量的底物(植酸鹽)和產(chǎn)物(無機(jī)磷)，以及高溫的強(qiáng)烈抑制(power和khon,1993)。

合成的植酸酶是能夠水解植酸成無機(jī)正磷酸鹽(伴有低比例的磷酸酯，五磷酸鹽至一磷酸鹽是中間產(chǎn)物)，和游離肌肉肌醇的磷酸單酯酶(nayini和markakis，1986;lasztity和lasztity，1988；harland和morris，1995)。iupac-iub(1976)已經(jīng)認(rèn)可在動物和微生物中分離的3-植酸酶(ec3.1.3.8)(reddy和col.,1982;lasztity和lasztity,1988)。

外源性植酸酶已發(fā)現(xiàn)于微生物例如真菌和酵母(如釀酒酵母(saccharomycescerevisae)和曲霉(aspergillussp))，和細(xì)菌(枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)，假單孢菌屬(pseudomonas))。從曲霉獲得的植酸酶遵循水解植酸鹽分子的某些順序，即從3位釋放出磷酸根基團(tuán)后，繼續(xù)遵循4、5、6和2的順序(venekamp等,1995)。這些酶在不同的ph2.5和h5.5顯示出活性。在ph2.5的活性比在ph5.5時(shí)的有效性低約40%，這是重要的，因?yàn)榱椎奈赵谳^大程度上發(fā)生在具有ph5.5的小腸(power和khon,1993)。

由aspergillusficuumm產(chǎn)生的植酸酶是一種純化的糖蛋白，其酶促活性隨溫度和ph的改變而變化。酶的最適溫度是在60-70℃之間。然而，于68℃10分鐘期間，觀察到活性損失至60%(nasi,1990)。熱-穩(wěn)定的黑曲霉(aspergillusniger)酶是耐受造粒工藝的且其活性被報(bào)告為至少5000ftu/g(nasi,1990)。

wo2011/141613a2描述一種新的、分離的氣味沙雷氏菌(serratiaodorifera)的基因，其編碼具有植酸酶活性的蛋白或多肽；一種在宿主酵母細(xì)胞，例如巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)中獲得所述蛋白或多肽的方法，和該酶作為活性成分在制作用于動物飼料的添加劑中的用途。wo2011/141613報(bào)道了一種植酸酶，其對胃(ph3.5)和腸道(ph7.0)之間的ph差異不敏感且其在廣泛ph范圍內(nèi)維持其活性。在wo2011/1416中描述的植酸酶被報(bào)告具有改進(jìn)的熱-穩(wěn)定性。

然而，這種沙雷氏菌屬植酸酶(serratiaphytase)野生型蛋白的適度表達(dá)水平仍代表涉及大規(guī)模蛋白生產(chǎn)的一個瓶頸。對確定導(dǎo)致植酸酶蛋白在宿主細(xì)胞中的改進(jìn)的和有效的表達(dá)的因素和條件仍有強(qiáng)烈的需求。本領(lǐng)域的現(xiàn)狀仍然缺乏能夠有效地生產(chǎn)每單位體積和隨時(shí)間推移的更多的具有植酸酶活性的蛋白的手段和方法。因此，對改進(jìn)工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的條件，以提供一個成本有效和可靠的方法仍有強(qiáng)烈的需求。

發(fā)明概述

以上目的通過根據(jù)本文描述和要求的本發(fā)明的方法和手段解決。本發(fā)明致力于解決這些需求并提供一種編碼具有植酸酶活性的蛋白或多肽的、新的分離的氣味沙雷氏菌的核酸分子。本發(fā)明還提供有效地在宿主細(xì)胞中表達(dá)和隨后純化根據(jù)本發(fā)明的分離的基因的方法。

在第一個方面，本發(fā)明涉及一種分離的核酸分子，其

i)包含編碼具有植酸酶活性的蛋白的根據(jù)seqidno:1的核苷酸序列或

ii)具有與編碼具有植酸酶活性的蛋白的根據(jù)seqidno:1的核苷酸序列至少83%的序列同一性。

在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的核酸分子具有與編碼具有植酸酶活性的蛋白的根據(jù)seqidno:1的核苷酸序列至少90%的序列同一性。

在再另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子不包含編碼n-末端信號肽的核苷酸序列。

在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的核酸分子還包含關(guān)于宿主細(xì)胞生物體的密碼子-優(yōu)化的突變。

在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞生物體是巴斯德畢赤酵母。

在本發(fā)明的再另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子與對應(yīng)的野生型核苷酸編碼序列的不同之處為存在至少50密碼子優(yōu)化突變。

在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，對應(yīng)的野生型核酸序列的至少50%的密碼子被修飾為最有利于宿主細(xì)胞生物體的密碼子。

在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的核酸分子中的所有密碼子被修飾為最有利于宿主細(xì)胞生物體的密碼子。

在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的核酸分子編碼根據(jù)seqidno:3的具有植酸酶活性的蛋白的氨基酸序列。

在第二個方面，本發(fā)明涉及包含上述的分離的核酸分子的表達(dá)構(gòu)建體，所述分子可操作地連接于調(diào)節(jié)核酸序列的表達(dá)的元件。

在所述表達(dá)構(gòu)建體的優(yōu)選的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)表達(dá)的元件包含在宿主細(xì)胞中有功能的啟動子和任選的終止序列。

根據(jù)一個更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。

在又一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，真菌細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母。

在第三個方面，本發(fā)明涉及包含所述核酸分子或表達(dá)構(gòu)建體的載體。

在第四方面，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)具有植酸酶的酶活性的蛋白的方法，其包括以下步驟：

a)將載體引入宿主細(xì)胞，所述載體包含：

i)在宿主細(xì)胞中有功能的調(diào)節(jié)表達(dá)的元件；和

ii)可操作地與其連接的核酸分子，其編碼具有如在此定義的植酸酶活性的蛋白；

b)在適合于表達(dá)蛋白的條件下培養(yǎng)在步驟a)中獲得的宿主細(xì)胞，和任選地

c)從細(xì)胞培養(yǎng)物回收在步驟b)中產(chǎn)生的蛋白。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)表達(dá)的元件包含在宿主細(xì)胞中有功能的啟動子和任選的終止序列。

在本發(fā)明的再另一個實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。

在更具體的實(shí)施方案中，酵母細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母。

在本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案中，蛋白表達(dá)使用甲醇表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行。

在再另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟d)中回收的蛋白具有至少1000單位/l的植酸酶活性。

在一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述回收步驟包括i)從培養(yǎng)基分離分泌的蛋白和/或i)從宿主細(xì)胞分離蛋白。

在第五個方面，本發(fā)明涉及通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的蛋白。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的或通過在此描述的方法生產(chǎn)的蛋白在制備用于動物飼料的添加劑中的用途。

在再另一個方面，本發(fā)明涉及用于動物飼料的添加劑，其包含在此描述的蛋白或包含通過在此描述的方法生產(chǎn)的蛋白。

附圖簡述

以下附圖是本發(fā)明的實(shí)施方案的舉例說明，并不意味著限制由權(quán)利要求書涵蓋的本發(fā)明的范圍。

圖1：通過變性丙烯酰胺凝膠(sds-page)測定植酸酶appas-r優(yōu)化蛋白的分子量：沒有甲醇誘導(dǎo)的培養(yǎng)基(泳道1)；植酸酶appas-r在具有甲醇的培養(yǎng)基中的表達(dá)(泳道2)；植酸酶優(yōu)化appas-r在具有甲醇的培養(yǎng)基中的表達(dá)(泳道3)；mw標(biāo)記(泳道4)。

圖2：植酸酶appas-r優(yōu)化蛋白依賴溫度(℃)的酶促活性(%)和耐熱性的測定。

圖3：植酸酶appas-r優(yōu)化蛋白依賴ph的酶促活性的測定。

圖4：蛋白酶胃蛋白酶(實(shí)心菱形)和胰蛋白酶(實(shí)心正方形)對優(yōu)化appas-r的酶促活性的影響。

圖5：appas-r優(yōu)化植酸酶活性隨時(shí)間推移的維持。

圖6a：原始?xì)馕渡忱资暇菜崦感蛄?seqidno:2)野生型的核苷酸序列和無編碼n-末端信號肽序列的核苷酸序列的氣味沙雷氏菌核苷酸序列(seqidno:8)。編碼n-末端信號肽序列的核苷酸序列(seqidno:4)以灰色突出顯示。

圖6b：優(yōu)化/改進(jìn)的氣味沙雷氏菌植酸酶(優(yōu)化appas-r/優(yōu)化植酸酶)的核苷酸序列(seqidno:1)。

圖6c：氣味沙雷氏菌appas-r優(yōu)化植酸酶蛋白的氨基酸序列(seqidno:3)。

圖6d：圖6a的翻譯序列(上部序列)和圖6b的翻譯序列(下部序列)之間的氨基酸序列對比。

圖6e：圖6a的基因序列(上部序列)和圖6b的基因序列(下部序列)之間的核苷酸對比。

圖7：野生型植酸酶和改進(jìn)的植酸酶(優(yōu)化植酸酶)的表達(dá)概況。

圖8顯示野生型植酸酶與改進(jìn)的植酸酶(優(yōu)化植酸酶)比較的植酸酶隨時(shí)間推移(h)的生產(chǎn)(單位/l)的圖。

實(shí)施方案的詳細(xì)描述

本發(fā)明總體上涉及編碼具有植酸酶的酶活性的多肽或蛋白的新的和改進(jìn)的核酸序列和在宿主細(xì)胞中有效地表達(dá)這樣的酶的方法。

雖然本發(fā)明將參照具體實(shí)施方案進(jìn)行描述，這種描述不應(yīng)以限制的意義來解釋。

在詳細(xì)描述本發(fā)明的示例性實(shí)施方案之前，給出用于理解本發(fā)明的重要的定義。

如用于本說明書和用于所附權(quán)利要求書中的，單數(shù)形式"一"和"一個"也包括各自的復(fù)數(shù)，除非文中另外清楚地指明。

在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"約"和"大約"表示本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解仍確保所提及特征的技術(shù)效應(yīng)的精確性范圍。該術(shù)語通常表示離開指定數(shù)值的±20%，優(yōu)選±15%，更優(yōu)選±10%，和甚至更優(yōu)選±5%的偏差。

要理解，術(shù)語"包含"是非限制性的。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語"由…組成"應(yīng)被認(rèn)為是術(shù)語"包含"的優(yōu)選的實(shí)施方案。如果下文一組被定義為包含至少一定數(shù)量的實(shí)施方案，這意味著也涵蓋優(yōu)選僅由這些實(shí)施方案組成的一組。

而且，在說明書和在權(quán)利要求書中的術(shù)語"第一"、"第二"、"第三"或"(a)"、"(b)"、"(c)"、"(d)"等，被用來在類似的元件之間進(jìn)行區(qū)分而不必是描述一種順序或時(shí)間順序。要理解，如此使用的術(shù)語在適當(dāng)?shù)那闆r下可互換使用，并且在此描述的本發(fā)明的實(shí)施方案能夠以并非本文描述的或舉例說明的其它順序操作。

在術(shù)語"第一"、"第二"、"第三"或"(a)"、"(b)"、"(c)"、"(d)"、"i"、"ii"等涉及方法或應(yīng)用或測定的步驟的情況下，在各步驟之間沒有時(shí)間或時(shí)間間隔的連貫性，即步驟可以同時(shí)進(jìn)行或在這樣的步驟之間可以有數(shù)秒、數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或甚至數(shù)年的時(shí)間間隔，除非在本文上面或下面提出的說明書中另外指明。

要理解，本發(fā)明不限于在此描述的具體方法、方案、試劑等，因?yàn)檫@些可以變化。還要理解，在此所用的術(shù)語僅僅是為了描述具體的實(shí)施方案的目的，而不是打算限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限定。除非另外定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同意義。

以上目的通過如在此描述的和要求的根據(jù)本發(fā)明的方法和手段得以解決。本發(fā)明致力于解決這些需求并提供用于獲得編碼具有植酸酶活性的蛋白或多肽的氣味沙雷氏菌的分離基因的手段和方法。本發(fā)明還提供有效地在宿主細(xì)胞中表達(dá)和隨后純化根據(jù)本發(fā)明的分離基因的方法。

如在此所用的術(shù)語"基因"，指位于基因組內(nèi)并可包含調(diào)節(jié)的、負(fù)責(zé)控制表達(dá)，即編碼部分的轉(zhuǎn)錄和翻譯的核酸序列的限定區(qū)域?；蛞部砂渌?'和3'非翻譯序列和終止序列。可存在的另外的元件是例如內(nèi)含子。

編碼根據(jù)本發(fā)明的具有植酸酶活性的蛋白的"分離的核酸分子"，指被鑒定和與至少一個通常與多肽-編碼核酸的天然來源有關(guān)的污染核酸分子分離的核酸分子。分離的多肽-編碼核酸分子并非呈現(xiàn)為其在自然界中發(fā)現(xiàn)的形式或表現(xiàn)。

因此分離的核酸分子可與在天然細(xì)胞中存在的其它特定的多肽-編碼核酸分子區(qū)分。然而，分離的多肽-編碼核酸分子包括包含在細(xì)胞中的多肽-編碼核酸分子，其通常表達(dá)多肽，其中例如所述核酸分子在不同于天然細(xì)胞的染色體的位置中。

如在此所用的，術(shù)語"突變"意指多肽或核酸分子中相對于“突變體”衍生自的野生型多肽或核酸分子的任何改變，并可例如，包含單個或多個氨基酸或核苷酸改變，或核苷酸和氨基酸二者的改變，包括點(diǎn)突變、零突變、移碼(frame-shift)突變，并可包括一個或多個核酸或氨基酸的缺失，或插入，或取代，其可以包含天然或非-天然存在的核苷酸或氨基酸或其類似物。

"核酸"或“核酸分子”，如用于本文的，一般指呈現(xiàn)單-、雙-鏈或者三鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。該術(shù)語可涵蓋含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，其具有與參考核酸類似的結(jié)合特性。具體的核酸序列也可以隱匿地包含其保守修飾的變體(如簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列。術(shù)語"核酸"、"核酸序列"或"多核苷酸"也可與基因、cdna，和由基因編碼的mrna互換使用。

在此所用的術(shù)語"本發(fā)明的核酸"或"本發(fā)明的核酸分子"指定一種核苷酸的序列，其可以原樣使用或以在此描述的組合物或方法使用。該術(shù)語指具有植酸酶活性的來自氣味沙雷氏菌的蛋白或多肽的根據(jù)在此提及的seqidno:2的整個編碼序列。而且，該術(shù)語也指定編碼功能蛋白片段的核酸、包含編碼序列或以上蛋白的功能片段的載體以及在此所指的核酸的衍生物，其具有一個或多個，如1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、1-5、1-3、2或1個核苷酸的修飾，即缺失、添加、倒位等，然而其編碼基本上具有如對根據(jù)seqidno:2的氣味沙雷氏菌植酸酶描述的植酸酶活性的多肽。

本發(fā)明的核酸的功能衍生物編碼具有當(dāng)與野生型多肽比較時(shí)至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的植酸酶活性的植酸酶多肽。

而且，如上說明的，術(shù)語"本發(fā)明的核酸"或"本發(fā)明的核酸分子"也指定包含在此描述的核酸的載體。這些載體可以含有允許在此描述的核酸的有效轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)序列。

術(shù)語"多肽"、"肽"和"蛋白"也可包括包含修飾(例如，但不限于，糖基化、脂質(zhì)附接、硫酸化、谷氨酸殘基的γ-羧基化，羥基化和adp-核糖基化)的聚合物。

如在此所用的術(shù)語"分離的多肽”描述在此公開的各種多肽，意指已從其天然環(huán)境的成分鑒定和分離和/或回收的多肽。然而，分離的多肽通常將通過至少一個純化步驟制備。

在第一個方面，本發(fā)明涉及一種分離的核酸分子，其

i)包含編碼具有植酸酶活性的蛋白的根據(jù)seqno:1的核苷酸序列或

ii)具有與編碼具有植酸酶活性的蛋白的根據(jù)seqidno:1的核苷酸序列至少78%的序列同一性。

本發(fā)明提供分離的、合成或重組核酸分子，其包含(a)編碼至少一個具有植酸酶活性的多肽的核酸(多核苷酸)，其中核酸包含具有與seqidno:1的核酸(多核苷酸)序列至少約50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或更多或完全(100%)的序列同一性的序列。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的核酸分子具有與根據(jù)seqidno:1的編碼植酸酶的核苷酸序列至少90%的序列同一性。

seqidno:1指核酸分子的核苷酸序列，其編碼具有植酸酶活性的得自氣味沙雷氏菌的蛋白或多肽。這種改進(jìn)的或優(yōu)化的植酸酶核苷酸序列的核苷酸序列在此被稱為“優(yōu)化appas-r”或“優(yōu)化植酸酶”(seqidno:1)并在圖6b中描述：

seqidno:1

gagcctagatacgttttggaaaaggtggttgaggtctctcgacacggcgttagaccaccaacctcaggtaacagacaggctatgcaagcgggaaccggaagggagtggccacaatggctgactcgtgacggagaactaactggacacggttatgcagccgcaacacttaaaggaagatacgaagccgattattatagacgtcagggcctattggcaaacggttgtccatctgctggggctgtttacgtctgggctagtcctctacaaagaacaagggccaccgcacaggctttgatggacggtgcatttcccggatgcggggtcgccattcatgctgcagccactgaacaagatcccttgtttcaagcagataagatgggtcttgttccactcgatgccgaaagggctagaactgcaataaggcaggcaatgggtggctcagccgagcaagtgaagacacgttttagtgctgacattaggcgtctgcaagctgctgtttgtttgcctcaacaggcttgtcctgcctttgaacaaccttgggaaattactcaagagcatgacggtagattcagcatcaatggtctaggaacattgtccaatatggctgaatctattagacttgcctactctgaaaaccagccaacggctcaagtcgcatttggacacggtgtcaacgcatccgccgtcgctcctttgttaccactgctaaccgccagatatgactttaccaatgatgtgccctatatcgctcaaagaggtggctccgttctgttaaaccaaattgctttggctcttgccgcagataggacttctgccggggcgccacctgctgctcgttggttgttatttgtcgctcatgacaccaatatcgcttatttaagaactctgcttggtttttcttggcaacagggactttacccaagaggtaatattccccctgctggaagtttggttttcgaaagatggcgtgatagacaaacaggtcaaaggttcttacgtctgtacttccaggctcaatcgttggatcaaatcagacagttgtcaccactttctacattatccccacctttaaaaaccgagttctctcgtcctggttgcaggcagttgtcacttggcgttctctgtccctggactgagtccatgcaaagaatgagagctgctatcgacccaactgcgttgcctacagtgcagtacagaccataa

本發(fā)明的一個方面是在氣味沙雷氏菌野生型基因序列中鑒定和提供合適的突變，以提高和改進(jìn)蛋白在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。非-突變的或未修飾的野生型核苷酸序列已描述于wo2011/141613a2(其通過引用結(jié)合到本文中)并在此稱為seqidno:2(見圖6a)：

seqidno:2

atgttgctattgcaaaaggactggtcgcgtctgttatttgccgtcacgctgggtatgatttccagcgtagcccaggctgagccgcgctacgtattggaaaaggtggttgaggtcagccgccacggcgtacgcccgccgacctcaggcaaccggcaggcgatgcaggcgggaaccggccgagagtggccacaatggctgacgcgcgacggcgaactcactggccacggttatgccgccgccacgctgaaaggacgctatgaagccgactattatcgccgtcagggcctattggccaacggctgtccgagcgcgggggcggtgtatgtctgggccagtccgctacagcgcacgcgagccaccgcacaggcgttgatggacggcgcatttcccggctgcggggtcgccattcatgcggccgccaccgaacaggaccccctgtttcaggcagataaaatgggcctggtgccgctcgatgccgaacgggctcgcacggcaataaggcaggcaatgggcggcagcgccgagcaggtgaaaacgcgctttagcgctgacattcggcgtctgcaagcggcggtctgcctgccgcaacaggcttgcccggcctttgaacaaccgtgggaaatcactcaggagcacgacggccgcttcagcatcaacggtctggggacgttgtccaacatggcggaaagcattcgcctggcctacagcgaaaaccagccgacggcgcaggtcgcctttggccacggtgtcaacgcatcggccgtcgcgccgttgctgcccctgctcaccgcccgctatgactttaccaatgacgtgccctatatcgcgcaacgcggtggctcggtgctgttaaaccaaatcgcgctggcgctggccgccgatcgaacctctgccggggcgccaccggcggcgcgctggttgctgtttgtcgcgcatgacaccaatatcgcttatctgcgcaccctgcttggctttagctggcaacaggggctttacccacgcggcaatattcccccggctggcagtctggtattcgaacgctggcgcgatcggcaaacgggccagcgcttcctgcgtctgtacttccaggcgcaatcgctggatcaaatccgccagttgtcaccgctgagcacgctgtcgccaccgttaaaaaccgagttcagccgtcctggctgccggcagttgtcactgggcgtactctgtccctggactgagtcgatgcaacggatgcgcgcggctatcgacccgacggcgctgcctacggtgcagtaccggccataa

根據(jù)seqidno:1的優(yōu)化的氣味沙雷氏菌植酸酶核苷酸序列與根據(jù)seqidno:2的野生型核苷酸序列的不同之處為在核苷酸序列中存在211個點(diǎn)突變或修飾。

根據(jù)seqidno:1的優(yōu)化的氣味沙雷氏菌植酸酶核苷酸序列不包含編碼根據(jù)seqidno:4的野生型序列的n-末端肽信號序列的核苷酸序列。在上述指定的根據(jù)seqidno:2的野生型植酸酶序列中的信號肽序列以灰色突出顯示。

無信號肽序列的野生型編碼序列在此稱為seqidno:8。

序列seqidno:1與seqidno:2的序列比較在圖6e中描述。在該序列比對中的每個錯配對應(yīng)于突變的或修飾的位置，其中關(guān)于原始序列的核苷酸被改變?yōu)榱硪粋€核苷酸。

參考根據(jù)圖6e的序列比對，根據(jù)seqidno:1的優(yōu)化的氣味沙雷氏菌植酸酶核苷酸序列與根據(jù)seqidno:8的野生型核苷酸序列的不同之處為核苷酸序列中的211個點(diǎn)突變或修飾。

根據(jù)seqidno:1的核苷酸序列的表達(dá)導(dǎo)致氣味沙雷氏菌植酸酶的多肽序列，如在圖6c(seqidno:3)所示。seqidno:3，對應(yīng)于成熟植酸酶蛋白的多肽序列。如在圖6c的序列比對中所見到的，seqidno:1和seqidno:2的翻譯多肽序列共享100%同一性，即在seqidno:1描述的211個突變中沒有一個導(dǎo)致編碼的氨基酸之一的交換。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的意圖內(nèi)的術(shù)語“修飾”或“突變”指野生型序列的核苷酸位置的改變，其不導(dǎo)致編碼氨基酸的交換，但導(dǎo)致給定的氨基酸的密碼子的改變，因而，導(dǎo)致密碼子-調(diào)節(jié)或密碼子-優(yōu)化核苷酸的交換。

如將意識到的，密碼子-優(yōu)化一般基于特定的宿主生物體中的密碼子使用，其中給定的核酸序列被表達(dá)，即翻譯為對應(yīng)的蛋白。在此描述的編碼氣味沙雷氏菌植酸酶蛋白的核酸的密碼子-優(yōu)化考慮相對密碼子頻率、優(yōu)化的gc含量和mrna的不穩(wěn)定性。

一般來說，“百分比同一性”(%)指兩個序列(dna、氨基酸或其它)之間的相似性的定量評價(jià)。對于一個給定的序列，近親物種(closelyrelatedspecies)預(yù)計(jì)將比更遠(yuǎn)親的物種(moredistantlyrelatedspecies)有更高的百分比同一性，因此百分比同一性在一定程度上反映了親緣關(guān)系。百分比同一性通過將成對的匹配數(shù)乘以100，再除以比對區(qū)域(包括缺口)的長度來計(jì)算。同一性評分僅對完美的匹配計(jì)數(shù)，并不考慮氨基酸彼此的相似性程度。為了計(jì)算，只有內(nèi)部缺口包括在長度內(nèi)，而不包括在序列末端的缺口。

百分比同一性=(匹配x100)/比對區(qū)域的長度(含缺口)

關(guān)于編碼在此鑒定的、具有植酸酶活性的蛋白的、根據(jù)seqidno:1的核酸序列的"百分比(%)核酸序列同一性"被定義為在比對序列和引入缺口(如果必要，以獲得最大的百分比序列同一性)后，在與根據(jù)seqidno:1的核酸序列中的核苷酸相同的候選序列核苷酸的百分比。為了測定百分比核酸序列同一性的目的，比對可以通過使用公開可用的計(jì)算機(jī)軟件例如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)軟件以各種方式實(shí)現(xiàn)，這些方式均在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。

例如，百分比核酸序列同一性可使用序列比較程序ncbi-blast2(altschul等,nucleicacidsres.25:3389-3402(1997)確定。ncbi-blast2序列比較程序可從http://www.ncbi.nlm.nih.gov下載或另外從國家衛(wèi)生研究所(nationalinstituteofhealth),bethesda,md獲得。ncbi-blast2使用多個搜索參數(shù)，其中所有那些搜索參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值包括，例如，unmask=yes，strand=all，預(yù)期出現(xiàn)=10，最小低復(fù)雜度長度(minimumlowcomplexitylength)=15/5，多-通路e-值=0.01，多-通路常數(shù)=25，最終缺口比對下降(dropoff)=25和評分矩陣=blosum62。

當(dāng)給定的核酸序列，即appas-r優(yōu)化序列(seqidno:1)的長度不等于比較核酸序列的長度時(shí)，百分比同一性計(jì)算如下：

1.優(yōu)化appas-r(seqidno:1)短于比較dna：

優(yōu)化appas-rnnnnnnnnnnnnnn(長度=14nt)

比較dnannnnnnxxxxxxxxxx(長度=16nt)

(序列的長度是示例性的)

%核酸序列同一性=(兩個核酸序列之間的相同匹配核苷酸的數(shù)目，如通過例如ncbi-blast2測定的)x100除以(appas-r優(yōu)化核酸序列的核苷酸總數(shù))=6x100除以14=42.9%

2.優(yōu)化appas-r(seqidno:1)長于比較dna：

優(yōu)化appas-rnnnnnnnnnnnnnn(長度=12nt)

比較dnannnnnnxxxyy(長度=9nt)

(序列的長度是示例性的)

%核酸序列同一性=(兩個核酸序列之間的相同匹配核苷酸的數(shù)目，如通過例如ncbi-blast2測定的)x100除以(appas-r優(yōu)化核酸序列的核苷酸總數(shù))=4x100除以12=33.3%

因此，參考序列(appas-r優(yōu)化核酸序列)的長度決定比對區(qū)的長度。應(yīng)意識到這一原則也適用于多肽序列的比較。

如在此所用的措辭“具有植酸酶活性的蛋白”或“植酸酶”二者均指內(nèi)消旋-肌醇六磷酸磷酸水解酶，其催化磷酸根基團(tuán)從植酸(ip6)或植酸鹽的分解。這種酶促反應(yīng)的結(jié)果是游離磷酸根基團(tuán)和磷酸肌醇的酯(ip5-ip1)。一般來說，植酸酶可分類為兩組：微生物或真菌植酸酶(e.c.3.1.3.8)或3-植酸酶，其開始水解位于c1或c3肌醇環(huán)上的磷基；或植物的植酸酶(e.c.3.1.3.26)或6-植酸酶，其開始水解(優(yōu)選)位于肌醇環(huán)的c6上的磷酸根基團(tuán)。

因此，如在此所用的“植酸酶活性”指從植酸(ip6)或植酸鹽水解磷酸根基團(tuán)的酶促反應(yīng)。在一個實(shí)施方案中，酶促植酸酶活性是如對根據(jù)seqidno:2的氣味沙雷氏菌蛋白描述的植酸酶活性。

本發(fā)明也涵蓋測量植酸酶活性。例如，植酸酶活性可用如在wo2011/141613a2中描述的或在本文實(shí)施例3中描述的測定法測量，其中比活性使用鉬-釩酸法(molybdate-vanadateacidmethod)，通過測量因植酸酶釋放的游離磷酸根或磷濃度來評價(jià)。

這種方法是基于apha標(biāo)準(zhǔn)方法4500-pc。在酸中，正-磷酸根離子與鉬酸銨和釩酸銨反應(yīng)，形成黃色的磷釩鉬酸銨(ammoniumphosphoricvanadomolybdate)，其可于415nm經(jīng)光測量分析。黃色的強(qiáng)度與磷酸根濃度成比例。然而，本發(fā)明也設(shè)計(jì)了用于測量或確定植酸酶活性的其它方法或測定法，這些方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員的普通技巧內(nèi)。一個可供選擇的方法是鉬藍(lán)法。在酸性介質(zhì)中，正-磷酸鹽與鉬酸銨結(jié)合，以形成鉬磷酸。在還原劑的幫助下，這形成磷鉬藍(lán)化合物。染料強(qiáng)度的光度計(jì)測量可以在880nm處進(jìn)行。

在特定的方面，本發(fā)明提供一種缺乏n-末端信號序列和/或啟動甲硫氨酸并由編碼這樣一種如前所述的氨基酸序列的核苷酸序列編碼的核酸序列。

氣味沙雷氏菌野生型基因的n-末端信號肽序列由根據(jù)seqidno:4的核苷酸序列和由根據(jù)seqidno:5的氨基酸序列限定。

seqidno:4：

atgttgctattgcaaaaggactggtcgcgtctgttatttgccgtcacgctgggtatgatttccagcgtagcccaggct

seqidno:5：

mlllqkdwsrllfavtlgmissvaqa

本發(fā)明的發(fā)明人觀察到，如顯示于圖6a(seqidno:2)中的、包含26aa信號肽的全長氣味沙雷氏菌野生型植酸酶基因的表達(dá)導(dǎo)致在表達(dá)后快速消失的不穩(wěn)定蛋白。本發(fā)明的發(fā)明人因此觀察到，26aa信號肽的刪除導(dǎo)致增強(qiáng)的表達(dá)(見實(shí)施例1)。

在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明描述用于在合適的宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的優(yōu)化的appas-r序列。優(yōu)化序列考慮宿主細(xì)胞生物體的密碼子使用偏倚。在一個實(shí)施方案中，對于在編碼如在此描述的具有植酸酶活性的蛋白的給定核酸序列中的每個氨基酸，使用最優(yōu)選的或最頻繁的密碼子?；蛘?，提供部分優(yōu)化的序列可能是足夠的，即其中核酸序列的一部分密碼子適合于最有利的密碼子。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)化在appas-r序列中的一些特定氨基酸的密碼子是足夠的。

本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案涉及核苷酸序列，其中野生型appas-r核酸序列的至少5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%的密碼子被修飾為最有利于宿主細(xì)胞生物體的密碼子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸序列中的至少51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%，或59%的密碼子被修飾為最有利于宿主細(xì)胞生物體的密碼子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，野生型核酸序列的至少61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%，或69%的密碼子被修飾為最有利于宿主細(xì)胞生物體的密碼子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，野生型核酸序列的至少71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%，或79%的密碼子被修飾為最有利于宿主細(xì)胞生物體的密碼子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸序列中的至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%，或89%的密碼子被修飾為最有利于宿主細(xì)胞生物體的密碼子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，野生型核酸序列中的至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，或99%的密碼子被修飾為最有利于宿主細(xì)胞生物體的密碼子。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的核酸分子與對應(yīng)的根據(jù)seqidno:8的野生型植酸酶核苷酸編碼序列的不同之處為存在密碼子-優(yōu)化突變。

根據(jù)本發(fā)明的“密碼子優(yōu)化突變”指沉默突變?yōu)椴粚?dǎo)致氨基酸序列改變的編碼序列。使用包含根據(jù)本發(fā)明的密碼子優(yōu)化突變的新的植酸酶核苷酸序列具有超過現(xiàn)有技術(shù)的植酸酶序列的令人吃驚的技術(shù)優(yōu)勢，即在給定的宿主細(xì)胞生物體中，通過改變氨基酸序列，改進(jìn)表達(dá)而不負(fù)面影響植酸酶活性是可能的，因此，生成的植酸酶蛋白的結(jié)構(gòu)或功能被保持。

本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案涉及核苷酸序列，其中根據(jù)seqidno:8的野生型植酸酶核苷酸編碼序列的至少5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%被修飾為最有利于宿主細(xì)胞生物體的密碼子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)seqidno:8的野生型植酸酶核苷酸編碼序列的51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%，或59%的密碼子被修飾為最有利于宿主細(xì)胞生物體的密碼子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)seqidno:8的野生型植酸酶核苷酸編碼序列的61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%，或69%的密碼子被修飾為最有利于宿主細(xì)胞生物體的密碼子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)seqidno:8的野生型植酸酶核苷酸編碼序列的71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%，或79%的密碼子被修飾為最有利于宿主細(xì)胞生物體的密碼子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)seqidno:8的野生型植酸酶核苷酸編碼序列的81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%，或89%的密碼子被修飾為最有利于宿主細(xì)胞生物體的密碼子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)seqidno:8的野生型植酸酶核苷酸編碼序列的至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，或99%的密碼子被修飾為最有利于宿主細(xì)胞生物體的密碼子。

在一些實(shí)施方案中，分離的核酸序列包含關(guān)于宿主細(xì)胞生物體的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9，或10個密碼子優(yōu)化突變。

在本發(fā)明的更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，分離的核酸序列包含關(guān)于宿主細(xì)胞生物體的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90，或100個密碼子優(yōu)化突變。

在本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的核酸序列包含關(guān)于宿主細(xì)胞生物體的至少110、120、130、140、150、160、170、180、190、200，或210個密碼子優(yōu)化突變。

在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的核酸序列的所有密碼子是關(guān)于宿主細(xì)胞生物體的密碼子-優(yōu)化的。

在一些實(shí)施方案中，99、98、97、96、95、94、93、92、91和90%的所有氨基酸位置使用宿主細(xì)胞的最優(yōu)選的密碼子。

在更具體的實(shí)施方案中，在考慮了在甲基營養(yǎng)型酵母巴斯德畢赤酵母中的密碼子使用偏倚后，核酸序列已被優(yōu)化。在特定的實(shí)施方案中，如下面實(shí)施例5中進(jìn)一步描述的，對原始密碼子逐個進(jìn)行分析并改變?yōu)榘退沟庐叧嘟湍?p.pastoris)中的每個氨基酸的最優(yōu)選的密碼子。巴斯德畢赤酵母中的密碼子使用偏倚先前已描述于bai等(baij.,swartzd.j.,protasevichi.i.,brouillettec.g.,harrellp.m.,hidebrandte.,gasserb.,mattanovichd.,warda.,changg.和urbatschi.l.(2011)提高巴斯德畢赤酵母中的全功能p-糖蛋白生產(chǎn)的基因優(yōu)化策略(ageneoptimizationstrategythatenhancesproductionoffullyfunctionalp-glycoproteininpichiapastoris).plosone6:1-15),sinclair等(sinclairg.和choyf.y.m.(2002)葡糖腦苷脂酶在甲基營養(yǎng)型酵母巴斯德畢赤酵母中的同義密碼子使用偏倚和表達(dá)(synonymouscodonusagebiasandtheexpressionofglucocerebrosidaseinthemethylotrophicyeastpichiapastoris).proteinexpressionandpurification26:96-105)和huang等(huangh,yangp,luoh,tangh,shaon等(2008)來自產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的截短的1,3-1,4-β-d-葡聚糖酶通過優(yōu)化密碼子和發(fā)酵在巴斯德畢赤酵母中的高水平表達(dá)(high-levelexpressionofatruncated1,3-1,4-beta-d-glucanasefromfibrobactersuccinogenesinpichiapastorisbyoptimizationofcodonsandfermentation).applmicrobiolbiotechnol.78:95-103)中。

術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建體"或“表達(dá)盒"在此可互換使用并指能夠指導(dǎo)特定核苷酸序列在適宜的宿主細(xì)胞中表達(dá)的核酸序列，包含可操作地連接于感興趣的核苷酸序列的啟動子，所述核苷酸序列可操作地連接于終止信號。它通常包含為核苷酸序列的正確翻譯所需的序列。編碼區(qū)通常編碼感興趣的蛋白。包含感興趣的核苷酸序列的表達(dá)盒可以是嵌合的，意味著至少一個其組分相對于至少一個它的其它組分是異源的。表達(dá)盒也可以是一個天然存在的，但已經(jīng)以可用于異源表達(dá)的重組形式獲得的表達(dá)盒。然而，表達(dá)盒相對于宿主通常是異源的，即，表達(dá)盒的特定dna序列并不天然存在于宿主細(xì)胞中，且必須已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化事件導(dǎo)入宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞的祖先中。表達(dá)盒的核苷酸序列的表達(dá)可以在組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子的控制下，誘導(dǎo)型啟動子僅當(dāng)宿主細(xì)胞暴露于一些特定的外部刺激時(shí)啟動轉(zhuǎn)錄。在一個實(shí)施方案中，表達(dá)載體包括為了表達(dá)而可操作地連接編碼具有植酸酶活性的多肽的核苷酸序列的報(bào)告基因。

如在此所用的"異源的"意指"不同天然來源的"或代表一種非-天然狀態(tài)。例如，如果宿主細(xì)胞用源自另一個生物體，特別是源自另一個物種的核酸序列轉(zhuǎn)化，則其核酸序列相對于宿主細(xì)胞是異源的，并且相對于攜帶該核酸序列的宿主細(xì)胞的后代也是異源的。類似地，異源的指源自和插入到相同的天然、原始細(xì)胞類型，但其以非-天然狀態(tài)存在的核苷酸序列，如不同的拷貝數(shù)，或在不同的調(diào)節(jié)元件的控制下。

“調(diào)節(jié)元件"一般指參與賦予核苷酸序列的表達(dá)的序列。調(diào)節(jié)元件通常包含可操作地連接于感興趣的核苷酸序列的啟動子和終止信號。它們通常還涵蓋為正確翻譯核苷酸序列所需的序列。適合于原核生物的“調(diào)節(jié)元件"，例如，包括啟動子，任選的操縱子序列，和核糖體結(jié)合位點(diǎn)。已知真核細(xì)胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號，和增強(qiáng)子。

如在此所用的術(shù)語"可操作地連接"意指一個核酸序列被置入與另一個核酸序列的功能關(guān)系中。例如，用于前序列或分泌前導(dǎo)區(qū)的dna被可操作地連接于多肽的dna，如果它被表達(dá)為參與多肽的分泌的前蛋白的話；啟動子或增強(qiáng)子可操作地連接于編碼序列，如果它影響序列的轉(zhuǎn)錄的話；或核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接于編碼序列，如果它被定位以促進(jìn)翻譯的話。一般來說，"可操作地連接"意指被連接的dna序列是連續(xù)的，并且在分泌前導(dǎo)區(qū)的情況下，是連續(xù)的和在閱讀框內(nèi)。增強(qiáng)子不必是連續(xù)的。連接通過在方便的限制位點(diǎn)的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)。如果這樣的位點(diǎn)不存在，則根據(jù)通常的實(shí)踐使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。

用于各種表達(dá)系統(tǒng)中的根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)化植酸酶基因的表達(dá)的合適”表達(dá)載體”或“表達(dá)質(zhì)?！蓖耆诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。用于酵母畢赤酵母(pichias)中表達(dá)的合適的表達(dá)載體，例如包括，但不限于，ppic系列的載體。這些載體使用可用甲醇誘導(dǎo)的aox1啟動子。表達(dá)質(zhì)?？梢院袑⑼庠磀na插入酵母基因組的元件和分泌表達(dá)的蛋白的信號序列。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)化植酸酶蛋白可在任何合適的宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。通常使用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)包括源自細(xì)菌、酵母、桿狀病毒(baculovirus)/昆蟲，和哺乳動物細(xì)胞，和絲狀真菌例如商業(yè)相關(guān)的真菌myceliophthorathermophile的那些表達(dá)系統(tǒng)。合適的細(xì)菌系統(tǒng)包括，但不限于，大腸桿菌(escherichiacoli)、桿狀桿菌屬(corynebacterium)，或螢光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)。真核生物表達(dá)系統(tǒng)包括酵母系統(tǒng)例如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、巴斯德畢赤酵母，或乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)。本發(fā)明也構(gòu)思了使用其它真菌表達(dá)系統(tǒng)例如絲狀真菌像曲霉屬(aspergillus)、木霉屬(trichoderma)和myceliophthorathermophila、c1，最近對不同工業(yè)酶的生產(chǎn)描述的。其它真核生物表達(dá)系統(tǒng)包括桿狀病毒-感染的細(xì)胞，例如，感染的昆蟲細(xì)胞例如sf9、sf21、高五株(highfivestrains)或哺乳動物細(xì)胞例如hela，和hek293，其也允許表達(dá)不能使用酵母或原核細(xì)胞(像大腸桿菌)表達(dá)的糖基化蛋白。它是非常有用的表達(dá)高質(zhì)量蛋白的系統(tǒng)。另外的合適的真核生物表達(dá)系統(tǒng)也包括非-裂解性昆蟲細(xì)胞表達(dá)，作為裂解性桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的替代方案，原生動物蜥蜴利什曼原蟲(leishmaniatarentolae)(非致病株)表達(dá)系統(tǒng)，以及植物系統(tǒng)(如煙草)和哺乳動物系統(tǒng)例如原牛(bosprimigenius)(牛)、小家鼠(musmusculus)(小鼠)、中國倉鼠卵巢細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞，和幼倉鼠腎(babyhamsterkidney)。

在又一個更優(yōu)選的實(shí)施方案中，真菌細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母(見creggjm,cereghinojl,shij,higginsdr(2000年9月)。"巴斯德畢赤酵母中的重組蛋白表達(dá)(recombinantproteinexpressioninpichiapastoris)".mol.biotechnol.16(1):23-52)。用于如本文描述的蛋白表達(dá)的合適巴斯德畢赤酵母株包括gs115、x33，或kh71h(invitrogen,1600faradayavenue,carlsbad,california,92008,usa)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，巴斯德畢赤酵母株是kh71h。

為了表達(dá)本發(fā)明的新的植酸酶核苷酸核酸分子，將基因克隆到包含所述核酸分子的合適表達(dá)載體或如本文在實(shí)施例中描述的表達(dá)構(gòu)建體中。

本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)具有植酸酶酶活性的蛋白的方法，其包括以下步驟：

a)將表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含：

i)在宿主細(xì)胞中有功能的調(diào)節(jié)表達(dá)的元件；和

ii)可操作地與其連接的如本文定義的核酸分子；

b)在適合于表達(dá)蛋白的條件下培養(yǎng)在步驟a)中獲得的宿主細(xì)胞，和任選地

c)從細(xì)胞培養(yǎng)物回收在步驟b)中產(chǎn)生的蛋白。

引入表達(dá)載體的步驟通常稱為“轉(zhuǎn)化”，其被定義為由直接吸收和并入外源性遺傳物質(zhì)(外源性dna)(從其環(huán)境和通過細(xì)胞膜吸收)導(dǎo)致的細(xì)胞的遺傳改變。用表達(dá)載體或表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化給定的宿主細(xì)胞的方法以及最適條件一般取決于宿主細(xì)胞且在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。因此，技術(shù)人員充分意識到誘導(dǎo)在宿主細(xì)胞中的表達(dá)和在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞的特定條件。

術(shù)語"回收"和“純化”在此可互換使用并指從培養(yǎng)物分離出表達(dá)的多肽，以獲得純的或基本上純量的多肽，即從培養(yǎng)物中的宿主細(xì)胞的其它蛋白和/或脂質(zhì)和/或核酸和/或組分分離。在本發(fā)明的意圖內(nèi)，所述回收步驟包括i)從培養(yǎng)基分離分泌的蛋白和/或i)從宿主細(xì)胞分離蛋白。

在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的優(yōu)化植酸酶蛋白在酵母巴斯德畢赤酵母中表達(dá)。在酵母巴斯德畢赤酵母中的重組蛋白生產(chǎn)具有幾個超過其它真核生物和原核生物表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，即：快速生長速率、高細(xì)胞-密度發(fā)酵、在幾乎無蛋白的培養(yǎng)基中的生產(chǎn)力；內(nèi)毒素和噬菌體污染的消除、多樣化的翻譯后修飾，包括多肽折疊、糖基化、甲基化、酰化、蛋白水解調(diào)節(jié)，和靶向亞細(xì)胞隔室；和容易從生長培養(yǎng)基純化。

大多數(shù)巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)基于甲醇-誘導(dǎo)的醇氧化酶(aox1)啟動子(見romanos,m.a.,scorer,c.a.,&clare,j.j.(1992).yeast,8,423-488)。在被甲醇誘導(dǎo)時(shí)，包含醇氧化酶的總可溶性蛋白的部分通?？缮咧?0%。通常使用的巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體包含以下元件：(1)5′-aox1(感興趣基因上游的醇氧化酶啟動子)；(2)sig(分泌信號序列)；(3)mcs(多個克隆位點(diǎn))；(4)tt(轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn))；(5)his4(由羥基組氨酸酶選擇的標(biāo)記)；(6)ampr(用氨芐青霉素選擇)；和(7)colb1(用于大腸桿菌中的質(zhì)粒繁殖的復(fù)制元件)(見li,p.z.,gao,x.-g.,arellano,r.o.,&renugopalakrishnan,v.(2001).proteinexperssionandpurification,22,369-380)。

表達(dá)畢赤酵母的另外的合適的、可商業(yè)獲得的載體系統(tǒng)包括ppiczαa、b和c載體(購自invitrogen的畢赤酵母表達(dá)試劑盒(pichiaexpressionkit)k1710-01或easyselect?畢赤酵母表達(dá)試劑盒號(pichiaexpressionkitno.)k1740-01)，它們均基于用zeocin?的重組蛋白的選擇。

在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的蛋白。在此描述的方法導(dǎo)致根據(jù)seqidno:2的多肽序列的密碼子-優(yōu)化氣味沙雷氏菌植酸酶蛋白的生產(chǎn)。設(shè)計(jì)的和優(yōu)化氣味沙雷氏菌基因的表達(dá)的基因產(chǎn)物對應(yīng)于缺乏頭26個氨基酸的成熟蛋白，即細(xì)胞中的信號肽裂解后，其如可在圖1中的sds凝膠中所見，具有約45-46kd的分子量，這顯示在相同的表達(dá)條件和在相同的樣本載荷下，appas-r優(yōu)化基因的表達(dá)水平顯著高于appas-r基因的表達(dá)水平。

如由實(shí)施例5，和圖7和8證實(shí)的，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，使用密碼子-優(yōu)化序列seqidno:1導(dǎo)致與根據(jù)seqidno:2或seqidno:8d的對應(yīng)野生型(wttype)植酸酶序列的表達(dá)比較的改進(jìn)的表達(dá)。在本上下文中，實(shí)施例5證實(shí)對應(yīng)的wt植酸酶序列的表達(dá)不超過143單位/l(u/l)，而優(yōu)化植酸酶可表達(dá)至多29973單位/l的量。實(shí)施例5證實(shí)對優(yōu)化序列進(jìn)行的突變，其考慮在相應(yīng)的酵母宿主細(xì)胞巴斯德畢赤酵母中的密碼子使用，明顯有助于增加和有效的蛋白表達(dá)，其中表達(dá)的蛋白的量和表達(dá)的速率增加。因此，優(yōu)化氣味沙雷氏菌植酸酶序列的表達(dá)導(dǎo)致顯著改進(jìn)的蛋白表達(dá)。

在特定的優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的核酸序列的表達(dá)在如本文描述的巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行。

在本發(fā)明的更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，蛋白表達(dá)使用如本文在實(shí)施例1或5中舉例描述的甲醇表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行和植酸酶活性如在實(shí)施例3中所述，使用鉬-釩酸法在酸性介質(zhì)(iso300024:2009(e))中，以u/l測量。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法導(dǎo)致改進(jìn)的表達(dá)，其中蛋白具有如用在此描述的方法測定的至少250、500、750，或至少1000u/l的植酸酶活性。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法導(dǎo)致改進(jìn)的表達(dá)，其中蛋白具有如用在此描述的方法測定的至少1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或至少10000u/l的植酸酶活性。在更進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法導(dǎo)致改進(jìn)的表達(dá)，其中蛋白具有如用在此描述的方法測定的至少11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000，或至少20000u/l的植酸酶活性。

此外，在實(shí)施例3中，根據(jù)溫度、ph、蛋白酶的存在以及植酸酶活性隨時(shí)間推移的維持，分析優(yōu)化氣味沙雷氏菌植酸酶序列的植酸酶活性。令人吃驚地，實(shí)施例3中的結(jié)果顯示，通過根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的密碼子-優(yōu)化氣味沙雷氏菌植酸酶蛋白導(dǎo)致具有改進(jìn)的植酸酶活性的特別穩(wěn)定的蛋白。

本發(fā)明還構(gòu)思了根據(jù)本發(fā)明或通過在此描述的方法生產(chǎn)的蛋白在制備用于動物飼料的添加劑中的用途。

通過如在此描述的方法表達(dá)的優(yōu)化植酸酶蛋白具有以下特征：

a)約45-47kda，優(yōu)選約46kda的分子量；

b)在2.0和9之間，優(yōu)選在2.5和8之間，甚至更優(yōu)選在3.0和7之間，和最優(yōu)選從3.3至5.8的最適ph；

c)酶促活性在40-55℃之間，優(yōu)選在50℃；

d)超過500u/mg，優(yōu)選超過600、700、800、900或1000u/mg，更優(yōu)選約1120+/-150u/mg的高比活性；

e)對蛋白酶的高耐受性，優(yōu)選對胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性

f)在9.3的等電點(diǎn)。

在又另一個方面，本發(fā)明涉及用于動物飼料的添加劑，其包含在此描述的蛋白或包含通過在此描述的方法生產(chǎn)的蛋白。添加劑可在固體或液體基礎(chǔ)上充分制備。添加劑還可包含通常用于固體或液體添加劑制備，或通常用于動物飼料制備的其它酶促制劑。用于動物飼料的添加劑可以包含足以從植酸鹽同化和酶促釋放游離磷的有效量的植酸酶。

實(shí)施例

實(shí)施例1：在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)

1.表達(dá)載體的構(gòu)建

為分離成熟蛋白的編碼區(qū)，使用以下寡核苷酸：

serrf:gcgcgcgaattcgagccgcgctacgtattgg(seqidno:6)

serrr:gcgcgcaagcttgtctagacgtggccggtactgcaccg(seqidno:7)

成熟蛋白的編碼區(qū)使用寡核苷酸serrf和serrr擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上可視化，切下期望大小的帶并使用nucleospinextractiikit(macherey-nagel)從凝膠提取dna。

將純化的dna經(jīng)由由寡核苷酸生成的ecori和xbal的限制位點(diǎn)，插入載體ppiczαa(invitrogen,sandiego,calif.)。在serrf中的ecori限制位點(diǎn)和在serrr中的xbai限制位點(diǎn)以粗體突出顯示。具有插入的純化dna的構(gòu)建體被轉(zhuǎn)化至dh5α細(xì)胞，其隨后被平鋪在含有25μg/mlzeocin的lb培養(yǎng)基上。挑選陽性集落并使獲得的載體經(jīng)受測序。大量培養(yǎng)具有正確序列的陽性克隆，目的是獲得用于酵母轉(zhuǎn)化的dna。

2.酵母的轉(zhuǎn)化和蛋白的表達(dá)

巴斯德畢赤酵母kh71h株(invitrogen)在ypd培養(yǎng)基上培養(yǎng)并準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)化。10μg質(zhì)粒ppiczαaappas-r經(jīng)pmel限切酶被線性化并通過用鋰/聚乙烯休克引入酵母細(xì)胞。

將轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞平鋪在含有100μg/mlzeocin的ypdz培養(yǎng)基上，其允許選擇已將基因shble(其產(chǎn)物賦予了對zeocin的抗性)整合到宿主染色體的dna中的菌落。只有轉(zhuǎn)化體(其已整合了基因shble)才能夠在ypdz培養(yǎng)基上生長。2天后，接種轉(zhuǎn)化體并在含有甘油的基本培養(yǎng)基(bmgy)上培養(yǎng)24小時(shí)，隨后通過離心(2.500g,3min)收集酵母并再次懸浮于含有0.5%甲醇的培養(yǎng)基(bmmy)中，以誘導(dǎo)植酸酶基因的表達(dá)。

3.轉(zhuǎn)化體的植酸酶活性的量化

總共61個轉(zhuǎn)化體被分析并使用鉬-釩酸法在酸性介質(zhì)(iso300024:2009(e))中對植酸酶活性定量。

將1.160μl底物溶液(5mm植酸鈉，在250mm乙酸鈉緩沖液中，ph5.5)加入到所述酶的40μl稀釋溶液中。于37℃進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。隨后將800μl終止(stop)溶液(14%硝酸；3,3%四水合七鉬酸銨、0.078%釩酸鹽)加入到該溶液以終止反應(yīng)。作為對照，將終止(stop)溶液加入到酶的稀釋溶液中用于滅活，然后將其加入底物溶液。10分鐘后，于415nm量化黃色強(qiáng)度并對酶溶液和各個對照溶液的活性進(jìn)行定量。一個單位的植酸酶活性被定義為每1分鐘釋出1μmol磷的酶的量。在甲醇誘導(dǎo)后2天，在培養(yǎng)基中，61個轉(zhuǎn)化體中的6個產(chǎn)生在10和55u/ml之間。獲得的基因是編碼具有植酸酶活性的多肽的新的基因。具有植酸酶活性的多肽被稱為appas-r。

實(shí)施例2：在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的appas-r多肽的純化

為純化巴斯德畢赤酵母中產(chǎn)生的植酸酶，培養(yǎng)具有55u/ml的活性的轉(zhuǎn)化體并在最適條件下誘導(dǎo)。在甲醇誘導(dǎo)后4天，使用與前面實(shí)施例相同的方法測量植酸酶活性，產(chǎn)生163u/l的上清液的活性。通過以14.100g離心5分鐘獲得上清液。棄去沉淀的細(xì)胞。

通過用vivaspin20(50.000mwco(sartoriusstudium))離心獲得上清液。隨后在乙酸鈉緩沖液(0.25m,ph5,5)中透析濃縮的溶液。最后，植酸酶用含有與用于透析的相同緩沖液的凝膠過濾(sephacryls-200)純化。

實(shí)施例3：在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的優(yōu)化appas-r的特征

1.分子量的測定

使用變性丙烯酰胺凝膠(sds-page)鑒定優(yōu)化植酸酶appas-r的分子量。圖1顯示sds-page的結(jié)果：

1)第一泳道對應(yīng)于對照(無甲醇誘導(dǎo)的培養(yǎng)基)，

2)第二泳道對應(yīng)于植酸酶appas-r在含有甲醇的培養(yǎng)基中的表達(dá)，

3)第三泳道對應(yīng)于植酸酶優(yōu)化appas-r在含有甲醇的培養(yǎng)基中的表達(dá)和

4)第四泳道對應(yīng)于分子量標(biāo)記物。

將相同體積的樣本加載在1、2和3泳道。

如從圖1中所見到的，優(yōu)化appas-r分子量是約46kda，其對應(yīng)于源自克隆的dna序列的多肽序列的估計(jì)分子量。從在相同的表達(dá)條件和在相同的樣本載荷下的sds-gel也可看出，appas-r優(yōu)化基因的表達(dá)水平顯著高于appas-r基因的表達(dá)水平。

2.依賴于溫度的appas-r優(yōu)化酶促活性的測定

如可在圖2中所見到的，酶活性隨溫度而變化。最適溫度在5.5ph下測定，其是由iso300024:2009(e)要求的ph?；钚栽?5℃和85℃之間的溫度范圍內(nèi)測試。最大活性于50℃測量。如在圖2中所示，于60℃10分鐘后，酶仍保留其40%的活性。

3.依賴于ph的appas-r優(yōu)化酶促活性的測定

ph對植酸酶活性的影響使用以下緩沖液測試：甘氨酸-hci對于ph1.5-3.5；乙酸鈉對于ph3.5-6.0；tris-hci對于ph6.0-8.5；甘氨酸-naoh對于ph8.5-10.0。所有緩沖液均含0.05%igpal。

如可在圖3中所見到的，酶促活性隨ph而變化。在5.0ph時(shí)觀察到最大活性。在4.0ph時(shí)仍維持70%的活性，而在ph5.5時(shí)維持超過80%的活性。

4.蛋白酶對酶促活性的影響

為測定對蛋白酶的耐受性，將純化的優(yōu)化appas-r(1.6mg/ml)與5mg/ml胃蛋白酶或50mg/ml胰蛋白酶于37℃一起孵育。在不同的孵育時(shí)間(5；10；15；30和60分鐘)孵育后，對樣本中的剩余的植酸酶活性進(jìn)行定量。如可在圖4中所見到的，與胃蛋白酶孵育后1小時(shí)，植酸酶appas-r保留超過其初始活性的70%(73%)和在與胰蛋白酶孵育后1小時(shí)為其初始活性的90%以上(95%)。這表明測試的植酸酶對蛋白酶活性是高度耐受的，這對用于動物飼料可能是非常有益的。

5.植酸酶活性隨時(shí)間推移的維持

為測定appas-r植酸酶隨時(shí)間推移的活性，在底物加入后的不同時(shí)間點(diǎn)測定每分鐘的比活性。如可從圖5導(dǎo)出的，appas-r與大多數(shù)植酸酶的不同之處在于其比活性隨時(shí)間的推移而增加。appas-r在底物加入后至少8小時(shí)內(nèi)仍然是有活性的，并且在4?小時(shí)后的活性為其初始比活性的兩倍(圖5)。這種隨時(shí)間推移的增加的和持續(xù)的活性對于任何其它植酸酶從未描述過。這是非常重要的問題，因?yàn)閯游锵ǔ；ㄙM(fèi)超過30分鐘，以致需要酶盡可能長時(shí)間地保持活性。隨時(shí)間推移的增加的和持續(xù)的活性也可能與液體飼料相關(guān)。因而，這允許通過使用減少量的酶，釋放以植酸鹽形式存在于飼料中的大多數(shù)磷。

6.比活性的測定

為測定比活性，濃縮和純化的appas-r植酸酶的濃度使用lowry方法測量，而比活性于37℃和ph4.75用鉬-釩酸法測量。純化appas-r的得到的比活性是1.123±112u/mg。

實(shí)施例4：從土壤釋放有機(jī)物質(zhì)的磷酸鹽

由于植酸酶的長活性，重要的是測定其從土壤的有機(jī)物質(zhì)釋放無機(jī)磷的能力。這種測定的結(jié)果被認(rèn)為對制備用于肥料的添加劑是有用的。對于這種測定，選擇了5個土壤樣本。每個樣本稱重2.5g并再懸浮于乙酸鹽緩沖液中，計(jì)算0.25g樣本/ml的最終濃度并調(diào)節(jié)。樣本于室溫、攪動下，孵育20分鐘。用乙酸鹽緩沖液按1/10稀釋樣本后，將等量的1u的植酸酶appas-r/100g土壤加入到1.2ml的每個樣本中并于25℃孵育24小時(shí)。結(jié)果顯示磷的釋放是53.6±27.8mg磷/100g土壤，因此增加土壤的游離磷酸鹽達(dá)23.4±18.1%。

實(shí)施例5：野生型植酸酶基因和修飾的植酸酶基因(優(yōu)化植酸酶)的比較表達(dá)

本發(fā)明的發(fā)明人觀察到，如在圖6a中所示的、包含26aa信號肽的全長氣味沙雷氏菌野生型基因植酸酶基因(seqidno:2)的表達(dá)導(dǎo)致不穩(wěn)定的蛋白，其在表達(dá)后快速消失。本發(fā)明的發(fā)明人因此觀察到26aa信號肽(seqidno:8)的缺失導(dǎo)致增強(qiáng)的表達(dá)(見實(shí)施例1)。

從含有如在實(shí)施例1中描述的編碼成熟氣味沙雷氏菌野生型植酸酶的核苷酸序列的載體ppiczα的這一觀察開始，進(jìn)一步評估核苷酸序列如何可依據(jù)植酸酶蛋白在宿主細(xì)胞中的改進(jìn)表達(dá)被進(jìn)一步修飾。

為獲得改進(jìn)的appas-r序列，逐個分析原始密碼子并改變?yōu)橛糜诎退沟庐叧嘟湍钢械拿總€氨基酸的最優(yōu)選的密碼子。在巴斯德畢赤酵母中的密碼子使用偏倚先前已描述于bai等(baij.,swartzd.j.,protasevichi.i.,brouillettec.g.,harrellp.m.,hidebrandte.,gasserb.,mattanovichd.,warda.,changg.和urbatschi.l.(2011)提高巴斯德畢赤酵母中的全功能p-糖蛋白生產(chǎn)的基因優(yōu)化策略(ageneoptimizationstrategythatenhancesproductionoffullyfunctionalp-glycoproteininpichiapastoris).plosone6:1-15),sinclair等(sinclairg.和choyf.y.m.(2002)葡糖腦苷脂酶在甲基營養(yǎng)型酵母巴斯德畢赤酵母中的同義密碼子使用偏倚和表達(dá)(synonymouscodonusagebiasandtheexpressionofglucocerebrosidaseinthemethylotrophicyeastpichiapastoris).proteinexpressionandpurification26:96-105)和huang等(huangh,yangp,luoh,tangh,shaon等(2008)來自產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的截短的1,3-1,4-β-d-葡聚糖酶通過優(yōu)化密碼子和發(fā)酵在巴斯德畢赤酵母中的高水平表達(dá)(high-levelexpressionofatruncated1,3-1,4-beta-d-glucanasefromfibrobactersuccinogenesinpichiapastorisbyoptimizationofcodonsandfermentation).applmicrobiolbiotechnol.78:95-103)。

在seqidno:1中，對巴斯德畢赤酵母中的最頻繁的密碼子使用進(jìn)行分析、鑒定和應(yīng)用。在seqidno:1中，無編碼n-末端信號肽序列的序列的wt編碼序列的所有211個密碼子已被優(yōu)化(seqidno:8)。評價(jià)也考慮到，在文獻(xiàn)中描述的密碼子使用頻率，在一定程度上在一些編碼具有催化活性的蛋白例如磷酸酶和激酶的巴斯德畢赤酵母基因中是保守的。

包含如由seqidno:1所示的優(yōu)化密碼子的修飾的植酸酶多核苷酸通過基因合成獲得。修飾的植酸酶多核苷酸通過genscriptcompany(spain)購買并經(jīng)由ecori和xbal的限制位點(diǎn)插入載體ppiczαa(invitrogen,sandiego,calif.)中。

用pmel限切酶消化使生成的含有appas-rop基因的質(zhì)粒線性化并如同實(shí)施例1，通過用鋰/聚乙烯休克轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞。

設(shè)計(jì)的和優(yōu)化氣味沙雷氏菌基因的表達(dá)的基因產(chǎn)物對應(yīng)于缺乏頭26個氨基酸的成熟蛋白，即細(xì)胞中信號肽裂解后，其如可在圖1中的sds凝膠中所見，具有約45-46kd的分子量。

從含有編碼如在實(shí)施例1中描述的成熟氣味沙雷氏菌野生型植酸酶的核苷酸序列的載體ppiczα開始，本發(fā)明的發(fā)明人評價(jià)和測試在該核苷酸序列中的點(diǎn)突變，其可導(dǎo)致植酸酶蛋白在宿主細(xì)胞中的改進(jìn)的表達(dá)。已觀察到如在圖6b中存在的與野生型植酸酶序列(seqidno:2)比較的211個點(diǎn)突變(seqidno:1)，有助于在酵母巴斯德畢赤酵母中的有效的和穩(wěn)定的表達(dá)。圖6c顯示優(yōu)化植酸酶序列(seqidno:1)和野生型植酸酶序列(seqidno:2)的序列比對。錯配表明對原始基因序列進(jìn)行的點(diǎn)突變。點(diǎn)突變采用優(yōu)選用于宿主細(xì)胞酵母巴斯德畢赤酵母中的密碼子。如可從圖6d中所見到的，其顯示seqidno:1和seqidno:2的翻譯成熟蛋白的比對，211個突變是沉默的，即沒有一個突變導(dǎo)致植酸酶多肽中的不同的氨基酸。

為確定對seqidno:1進(jìn)行的突變是否確實(shí)對酵母蛋白表達(dá)有影響，修飾的核苷酸序列在與實(shí)施例1中相同的條件下表達(dá)。為測定表達(dá)特性，樣本在甲醇表達(dá)后的時(shí)間點(diǎn)0、19、31、43、55、67、79和91小時(shí)時(shí)采集。植酸酶活性使用如在實(shí)施例3中描述的鉬-釩酸法，在酸性培養(yǎng)基(iso300024:2009(e))中測量。實(shí)施例3的appas-r被用作比較實(shí)施例。

結(jié)果概述于表1中。這個比較實(shí)施例的數(shù)據(jù)在根據(jù)圖7的圖表中以對數(shù)表示，其顯示以單位/l表示的活性對比時(shí)間(h)。

在圖7中，wt植酸酶appsas-r(比較實(shí)施例)的表達(dá)曲線以藍(lán)色顯示(實(shí)心菱形)，而優(yōu)化序列的表達(dá)曲線以紅色顯示(實(shí)心正方形)。如可從曲線圖所見到的，wt植酸酶基因表達(dá)不是最優(yōu)的。首批可測量的產(chǎn)物出現(xiàn)在誘導(dǎo)40小時(shí)后。91小時(shí)后，飽和曲線顯示了143u/l的最大活性。令人驚奇地，修飾的植酸酶基因序列(優(yōu)化序列)的表達(dá)顯示，在蛋白表達(dá)的第一小時(shí)內(nèi)即刻出現(xiàn)可測量的植酸酶基因產(chǎn)物，其在誘導(dǎo)基因表達(dá)約20-30小時(shí)后達(dá)到飽和。90小時(shí)后，植酸酶生產(chǎn)超過200倍。這種生產(chǎn)的增加是意想不到的。

實(shí)施例5因此證實(shí)對優(yōu)化序列作出的突變，其考慮了在相應(yīng)的酵母宿主細(xì)胞巴斯德畢赤酵母中的密碼子使用，確實(shí)有助于增加的和有效的蛋白表達(dá)。

表1：野生型植酸酶與優(yōu)化植酸酶比較的表達(dá)概況