專利名稱：新的2-(α-正戊酮基)苯甲酸鹽及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的2-(α-正戊酮基)苯甲酸鹽及其制法，以及以該化合物為活性成分的藥物組合物，還涉及該類化合物及組合物在預(yù)防和治療心腦缺血性疾病及改善心腦循環(huán)障礙、抗血栓等方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
急性缺血性腦卒中和冠心病以及心肌梗死，都是由于各種因素誘發(fā)血栓形成所導(dǎo)致的缺血性損傷的疾病，該類疾病給病人帶來極大的痛苦甚至生命危險。目前，該類藥物的研究一直是藥物研究開發(fā)的熱點和前沿。
3-烴基苯酞類化合物，多數(shù)有藥理活性，其中DL-3-正丁基苯酞，中國專利ZL93117148.2公開了抗腦缺血的活性，并且國內(nèi)已經(jīng)作為一類新藥上市，商品名“恩必普”，劑型為軟膠囊。3-正丁烯基苯酞有報道具有抗血小板聚集的作用(Biochimica et，Biophysica Acta，924(1987)，375-382)，但沒有發(fā)現(xiàn)公開其抗腦缺血及抗血栓形成的活性的報道，此外由于其和DL-3-正丁基苯酞一樣是不溶于水的粘稠液體，并不便于制藥工業(yè)制成合適的制劑形式。
中國專利CN1382682A，申請?zhí)?1109795.7，首次公開了以DL-3-正丁基苯酞為先導(dǎo)物制備2-(α-羥基戊基)苯甲酸鹽及其用途，涉及一價金屬離子、二價金屬離子和有機堿基的鹽，具體公開了鉀、鈉、鈣、鎂、鋅、苯胺、芐胺、嗎啉、二乙胺的鹽。其說明書中公開了鉀鹽、鈉鹽、鋰鹽、鈣鹽、芐胺鹽的制備，但沒有公開鋅鹽、苯胺、嗎啉、二乙胺鹽的具體制備方法。其說明書中還公開了鉀鹽對局部腦缺血大鼠腦梗塞面積的影響，對大鼠血小板聚集的影響，以及大鼠離體心臟缺血-再灌注心率失常的保護作用，證明鉀鹽在上述實驗中發(fā)揮了有益作用。其他鹽類化合物則未進行藥效實驗證明其效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人在研制新的心腦血管類藥物時，研究大量2-烴基苯甲酸鹽的過程中，不僅意外地發(fā)現(xiàn)3-正丁烯基苯酞具有抗腦缺血及抗血栓形成的活性，同時還意外地發(fā)現(xiàn)新的2-(α-正戊酮基)苯甲酸鹽，該類化合物與現(xiàn)有技術(shù)的2-(α-羥基戊基)苯甲酸鹽以及其先導(dǎo)化合物3-正丁烯基苯酞相比，出人意料地具有更加優(yōu)異的心腦血管活性，并且有更好的物理和化學性能。
本發(fā)明的目的，就是提供一種新的2-(α-正戊酮基)苯甲酸鹽，具有明顯的抗腦缺血、抑制血栓形成，從而改善心腦循環(huán)、預(yù)防和治療心腦缺血性疾病的一類新的化合物，該化合物具有良好的外觀及物理形態(tài)，對光、熱、濕穩(wěn)定性優(yōu)異。
本發(fā)明的另一目的，是提供一種制備2-(α-正戊酮基)苯甲酸鹽的合成方法。
本發(fā)明的進一步的目的是為臨床提供一種可有效預(yù)防和治療心腦缺血性疾病及改善心腦循環(huán)障礙、抗血栓的一類藥物組合物。
本發(fā)明的另一目的是提供上述化合物和組合物在制備預(yù)防和治療心腦缺血性疾病及改善心腦循環(huán)障礙、抗血栓藥物中的應(yīng)用。
為了完成本發(fā)明的目的，本發(fā)明的發(fā)明人制備并研究了一大批2-烴基苯甲酸鹽，包括中國專利CN1382682A已公開的鹽，經(jīng)過理化性質(zhì)、藥效、毒性研究，意外地發(fā)現(xiàn)具有下式結(jié)構(gòu)的化合物，具有各方面優(yōu)異的性能，現(xiàn)有技術(shù)中未見對該類化合物的報道。
其中，n＝1，2M為一價金屬離子如鋰，鈉，鉀，或是二價金屬離子如鎂、鈣、鋅，或有機堿基，如芐胺、叔丁胺、甲基芐胺、N，N’-二芐基乙二胺。一價金屬離子優(yōu)選鈉，鉀，二價金屬離子優(yōu)選鈣，有機堿基優(yōu)選N，N’-二芐基乙二胺。
本發(fā)明化合物可按如下方法制備M為有機堿基的制備方法由3-正丁烯基苯酞(按現(xiàn)有公知技術(shù)所述方法制備，例如蘭州大學學報自科版.1990，26(1).118-119，(±)-芹菜甲素的合成，李紹白 張廾明)堿性條件下水解，再酸化得到2-(α-正戊酮基)苯甲酸，溶于低極性溶劑后與有機堿的溶液反應(yīng)，攪拌數(shù)小時，成鹽析出，抽濾，干燥，即得到白色固體狀的本發(fā)明化合物中有機堿的鹽。上述所用低極性溶劑包括苯類(如甲苯)、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯，優(yōu)選乙醚。
M為一價金屬離子的制備方法2-(α-正戊酮基)苯甲酸溶于極性溶劑后金屬離子的堿反應(yīng)成鹽，然后攪拌下加入低極性溶劑，攪拌數(shù)小時，析出，抽濾，干燥，即得到白色固體狀的本發(fā)明化合物中一價金屬離子的的鹽。上述所用極性溶劑包括C1-C4低級醇類優(yōu)選甲醇，低極性溶劑包括苯類(如甲苯)、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯，優(yōu)選乙醚。
M為二價金屬離子的制備方法用已制備好的2-(α-正戊酮基)苯甲酸鹽的溶液，與二價金屬離子鹽的溶液混合，進行鹽交換反應(yīng)，制得二價金屬離子的2-(α-正戊酮基)苯甲酸鹽。適合的溶劑包括常見的極性溶劑，如水和醇類，優(yōu)選水和C1-C4低級醇類如甲醇、乙醇。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物尤其是優(yōu)選的化合物具有如下優(yōu)異的性能1、具有良好的物理形態(tài)，便于制藥工業(yè)加工成合適的制劑形式。
2、只需簡單的后處理即可達到藥用純度。
3、穩(wěn)定性實驗表明本發(fā)明的化合物非常穩(wěn)定，與已公開的2-(α-羥基戊基)苯甲酸鹽相比，本發(fā)明的化合物更加穩(wěn)定。
4、動物急性毒性試驗表明本發(fā)明的化合物與已公開的2-(α-羥基戊基)苯甲酸鹽相比，毒性更小。
5、在動物藥效模型試驗中，與已公開的2-(α-羥基戊基)苯甲酸鹽及3-正丁烯基苯酞相比，本發(fā)明的化合物在相同劑量下對腦動脈阻塞引起的腦組織損傷顯示出更加優(yōu)異的保護作用，表現(xiàn)在可使大腦中動脈血栓模型大鼠的神經(jīng)癥狀明顯改善，梗塞面積明顯減少，并能明顯抑制大鼠動-靜脈旁路血栓形成，說明本發(fā)明化合物可有效抑制血栓形成，對心腦缺血性疾病具有較好的預(yù)防和治療作用。
6、在對大腦中動脈血栓模型大鼠神經(jīng)癥狀及腦梗塞范圍的影響試驗中，與已公開的2-(α-羥基戊基)苯甲酸鹽及3-正丁烯基苯酞相比，本發(fā)明的化合物具有更小的顯著性療效劑量，即在較低劑量下，即可表現(xiàn)出顯著性的效果。
本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物為活性成分，以及含有一種或多種藥學上可以接受的載體。
上文所述藥學上可接受的載體是指藥學領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體(也稱為輔料)，其中固體制劑常用的輔料包括填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯醇吡咯烷酮；濕潤劑如乙醇、水；崩解劑如淀粉及其衍生物如羧甲基淀粉鈉(CMS-Na)、低取代羥丙基纖維素(LS-HPC)、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉(CCMC-Na)等以及泡騰崩解劑；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂黏土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣和鎂、聚乙二醇；另外還可在組合物中加入其它輔助劑如香味劑、甜味劑等。液體制劑的輔料包括注射用水，以及pH調(diào)節(jié)劑如氫氧化鈉，還有其他輔料如等滲調(diào)節(jié)劑等，本領(lǐng)域技術(shù)人員，可按照藥學領(lǐng)域的液體制劑常規(guī)制備方法合理選擇常用的輔料種類和用量，使最終產(chǎn)品符合常規(guī)靜脈注射劑或靜脈注射用凍干劑的要求。
本發(fā)明的化合物和藥物組合物可用于制備預(yù)防和治療心腦缺血性疾病，抗血栓、改善心腦循環(huán)障礙等的藥物。
本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員，按照藥學領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型，包括片劑、膠囊、顆粒劑，本發(fā)明化合物中水溶性的鹽還可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員，按照藥學領(lǐng)域的靜脈注射劑常規(guī)生產(chǎn)方法制成靜脈注射劑、靜脈注射凍干劑等。
具體實施例方式
下面的實施例可幫助本領(lǐng)域的技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例12-(α-正戊酮基)苯甲酸的制備 在反應(yīng)瓶中加入3-正丁烯基苯酞100g(0.53mol)、甲醇300ml，NaOH 40g和水50ml，回流8小時后，減壓除去甲醇后再補加200ml水，冷卻。攪拌下滴加濃度為4N的鹽酸，調(diào)PH＝2～3。用乙醚萃取，萃取液用水洗，干燥，過濾，減壓將乙醚抽干，得淡黃色膠狀固體100g，收率為91％。
實施例22-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉的制備 在反應(yīng)瓶中加入NaOH 3.4g(0.085mol)、甲醇50ml，2-(α-正戊酮基)苯甲酸21g(0.1mol)，室溫攪拌2小時，分批加入1000ml乙醚，析出大量白色固體，攪拌2小時后過濾抽干，將固體用乙醚洗滌，抽濾，濾餅真空干燥，得白色粉末狀結(jié)晶2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉16g，收率82.6％(以NaOH計)，m.p.219.0～220.0℃。
(2)按照(1)的操作，只將甲醇換成等體積乙醇，得白色粉末狀固體15g，收率77.4％，m.p.219.0～220.5℃。
(3)按照(1)的操作，將乙醚換成等體積的甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯，收率均有所下降。
紅外吸收光譜KBr，3060cm-1，(γAr-H)，1689cm-1，(γC＝O)，核磁共振氫譜(300MHz，CD3Cl)δ(ppm)6.999-7.806(m，4H，Ar-H)，2.485-2.689(t，2H，-CH2-)，1.455-1.530(m，2H，-CH2-)，1.223-1.295(m，2H，-CH2-)0.805-0.885(t，3H，-CH3)ESI-MSNegative M/Z 205 元素分析C12H13NaO3FW228.22

實施例32-(α-正戊酮基)苯甲酸鉀的制備

在反應(yīng)瓶中加入KOH4.5g(0.08mol)、甲醇50ml、2-(α-正戊酮基)苯甲酸21g(0.10mol)，室溫攪拌2小時。減壓蒸去溶劑，加入1.0L無水乙醚，攪拌析出大量白色固體。攪拌2小時后抽干，用乙醚洗滌，抽干，真空干燥，得白色固體16g，收率81.8％(以KOH計)，m.p.113.5～115.0℃。
紅外吸收光譜KBr，3062cm-1，(γAr-H).1685cm-1，(γC＝O)核磁共振氫譜(400MHz，CD3Cl)δ(ppm)6.9550-7.7305(m，4H，Ar-H)，2.6099-2.6476(t，2H，-CH2-)，1.4531-1.5288(m，2H，-CH2-)，1.2116-1.23043(m，2H，-CH2-)0.8141-0.8508(t，3H，-CH3)ESI-MSNegative M/Z 205

元素分析C12H13KO3FW244.33

實施例42-(α-正戊酮基)苯甲酸鈣鹽的制備

在燒杯中加入44g(0.193mol)2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉鹽和95ml水，室溫攪拌下全溶。將10.7g CaCl2(0.096mol)溶于25ml水中，分批加入到攪拌著的鈉鹽水溶液中，立即析出白色固體，室溫攪拌2小時抽干。濾餅用60ml水洗滌，用乙醚洗，干燥，得37g白色固體。收率85.5％，m.p.108.0～110.5℃。
紅外吸收光譜KBr，3062cm-1，(γAr-H).1687cm-1，(γC＝O)核磁共振氫譜(400MHz，CD3Cl)δ(ppm)7.0392-7.8998(m，8H，Ar-H)，2.6507-2.6885(t，4H，-CH2-)，1.4591-1.5346(m，4H，-CH2-)，1.1921-1.2846(m，4H，-CH2-)0.7960-0.8325(t，6H，-CH3)ESI-MSNegative M/Z 205

元素分析C24H26CaO6FW450.54

實施例52-(α-正戊酮基)苯甲酸N，N’-二芐基乙二胺鹽的制備

在反應(yīng)瓶中加入N，N’-二芐基乙二胺21.4g(0.089mol)和乙醚1000ml，室溫攪拌下全溶后，分批加入2-(α-正戊酮基)苯甲酸的乙醚溶液1000ml(36.6g，0.178mol)，逐漸變渾濁，加完后析出大量白色固體。室溫攪拌2小時后抽濾，用乙醚洗滌，抽干，干燥得39g白色固體，收率66.9％，m.p.94.5～96.5℃。
紅外吸收光譜KBr，3030、3060cm-1，(γAr-H).1685cm-1，(γC＝O)核磁共振氫譜(400MHz，CD3Cl)δ(ppm)7.2526-7.7949(m，18H)，3.8531(S，4H，兩個Ar-CH2)，2.8133(s，4H，N-CH2CH2-N)，2.4140-2.49811m，4H，兩個-CH2-)，1.3312-1.4052(m，4H，兩個-CH2-)，1.0866-1.3004(m，4H，兩個-CH2-)，0.7994-0.8356(m，6H，兩個-CH3)ESI-MSNegative M/Z 205

Positive M/Z 241

元素分析C40H50N2O6FW654.85

實施例62-(α-正戊酮基)苯甲酸叔丁胺鹽的制備

將叔丁胺17.8g(0.243mol)溶于1000ml乙醚中，加入2-(α-正戊酮基)苯甲酸乙醚溶液1000ml(50g，0.243mol)，室溫攪拌15分鐘后析出大量固體，繼續(xù)攪拌2小時。抽濾，濾餅用乙醚洗兩次，干燥，得50g白色固體，收率73.5％，m.p.122.5～124.0℃。
紅外吸收光譜KBr，3060cm-1，(γAr-H).1683cm-1，(γC＝O)
ESI-MSNegative M/Z 205

元素分析C16H25NO3FW279.38

實施例72-(α-正戊酮基)苯甲酸芐胺鹽的制備

將2-(α-正戊酮基)苯甲酸25g(0.121mol)溶于700ml乙醚中，加入芐胺12.8g(0.120mol)，室溫攪拌10分鐘后析出白色固體，繼續(xù)攪拌2小時。抽濾，濾餅用乙醚洗，抽干，干燥得35g白色固體，收率93％，m.p.72.5～74.0℃。
ESI-MSNegative M/Z 205

元素分析C19H23NO3FW313.40

實施例82-(α-正戊酮基)苯甲酸(S)-α-甲基芐胺鹽的制備

在反應(yīng)瓶中2-(α-正戊酮基)苯甲酸25g(0.121mol)溶于700ml乙醚，加入(S)-α-甲基芐胺14.6g(0.120mol)，室溫攪拌10分鐘后析出白色固體，繼續(xù)攪拌2小時后抽濾，濾餅用乙醚洗滌，抽干，干燥得30g白色固體，收率76.4％，m.p.82.0～84.0℃。
ESI-MSNegative M/Z 205

元素分析C20H25NO3FW327.41

實施例92-(α-正戊酮基)苯甲酸鋅鹽的制備

在燒杯中加入44g(0.193mol)2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉鹽和95ml水，攪拌下全溶。將13.2g ZnCl2(0.096mol)溶于125ml水中，冷卻至室溫，分批加入到攪拌著的鈉鹽水溶液中，立即析出白色粘稠固體，室溫攪拌2小時抽濾，抽濾困難，濾餅白色粘稠固體，真空干燥后為白色膠狀固體。
實施例102-(α-正戊酮基)苯甲酸鎂鹽的制備 在燒杯中加入44g(0.193mol)2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉鹽和95ml水，室溫攪拌下全溶。將11.5g MgSO4(0.096mol)溶于125ml水中，冷卻至室溫，分批加入到攪拌著的鈉鹽水溶液中，析出白色粘稠固體，攪拌2小時抽濾，濾餅為白色粘稠固體，真空干燥后為白色泡沫狀固體。
實施例112-(α-正戊酮基)苯甲酸鋰的制備 在反應(yīng)瓶中加入LiOH 2.0g(0.085mol)、甲醇50ml、2-(α-正戊酮基)苯甲酸21g(0.1mol)，室溫攪拌1小時，分批加入1000ml乙醚，析出大量白色粘稠物，攪拌2小時后過濾抽干，將粘稠物用乙醚洗滌，抽濾，濾餅放到真空干燥器中干燥，得白色泡沫狀固體。
小結(jié)鋰鹽、鎂鹽、鋅鹽均為泡沫狀或膠狀固體，無明顯的熔點，它們都不符合制藥工業(yè)的要求。鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、芐胺鹽、N，N’-二芐基乙二胺鹽、叔丁胺鹽有良好的外觀物理形態(tài)和固定的熔點。
實施例12水溶液穩(wěn)定性將各化合物溶于水中，制成0.2mg/ml的溶液，測定一定時間后分解產(chǎn)物的量，結(jié)果見表一。
表一水溶液穩(wěn)定性比較 *實施例中所用2-(α-羥基戊基)苯甲酸鹽均按照CN1382682A的方法制備，下同。
分解產(chǎn)物的測定采用HPLC方法，按照中國藥典2000版二部附錄VD試驗，C18柱，流動相乙腈∶0.02M磷酸二氫鈉＝40∶60，檢測波長230nm，流速1ml/min。
從結(jié)果可以看出，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉鹽、鉀鹽，在水中24小時后檢測不到分解產(chǎn)物，其水溶液穩(wěn)定性明顯好于2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽。
實施例13濕穩(wěn)定性將2-(α-正戊酮基)苯甲酸的鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、N，N’-二芐基乙二胺鹽和2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽、鈣鹽、N，N’-二芐基乙二胺鹽，按照中國藥典2000版二部附錄XIX C“藥物穩(wěn)定性指導(dǎo)原則”項下“高濕度試驗方法”所述方法試驗，時間為10天。純度的測定采用HPLC方法，按照中國藥典2000版二部附錄VD試驗，C18柱，流動相乙腈∶0.02M磷酸二氫鈉＝40∶60，檢測波長230nm，流速1ml/min。
實驗結(jié)果表明，2-(α-正戊酮基)苯甲酸的鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽在濕度條件下略有吸濕，但是與對應(yīng)的2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽吸濕后分解嚴重相比，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽吸濕后幾乎不分解。兩種酸的N，N’-二芐基乙二胺鹽都吸濕較小而且穩(wěn)定。
實施例14光照穩(wěn)定性按照中國藥典2000版二部附錄XIX C“藥物穩(wěn)定性指導(dǎo)原則”項下“光照穩(wěn)定性試驗方法”所述方法試驗，時間為10天，純度的測定采用HPLC方法，按照中國藥典2000版二部附錄VD試驗，C18柱，流動相乙腈∶0.02M磷酸二氫鈉＝40∶60，檢測波長230nm，流速1ml/min。結(jié)果表明本發(fā)明的2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉、鉀、鈣以及N，N’-二芐基乙二胺鹽均未檢出分解產(chǎn)物，說明對光照穩(wěn)定性很好。
實施例15熱穩(wěn)定性按照中國藥典2000版二部附錄XIX C“藥物穩(wěn)定性指導(dǎo)原則”項下“熱穩(wěn)定性試驗方法”所述方法試驗，溫度為60℃，時間為10天，純度的測定采用HPLC方法，按照中國藥典2000版二部附錄VD試驗，C18柱，流動相乙腈∶0.02M磷酸二氫鈉＝40∶60，檢測波長230nm，流速1ml/min。結(jié)果表明本發(fā)明的2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉、鉀、鈣以及N，N’-二芐基乙二胺鹽均未檢出分解產(chǎn)物，說明對熱穩(wěn)定性很好。
實施例16片劑

制備方法按配比將活性成分、淀粉、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉混勻，用水潤濕，制顆粒，干燥，整粒，加入硬脂酸鎂，混勻后將混合物壓片即得本品片劑。
實施例17膠囊劑

制備方法按配比將活性成分和輔料混勻，濕法制顆粒，干燥，整粒，加入硬脂酸鎂，混勻后將混合物按定量裝入胃溶性硬膠囊中，即得本品膠囊劑。
實施例18顆粒劑

制備方法按配比將活性成分和輔料混勻后濕法制粒，干燥，整粒分級，分劑量包裝，即得本品顆粒劑。
實施例19靜脈注射劑

制備方法將水溶性2-(α-正戊酮基)苯甲酸鹽溶于適量的注射用水中，加適量氫氧化鈉，將pH調(diào)至9.0(范圍可以在7.5～9.5之間)，根據(jù)需要添加適量氯化鈉，在無菌條件下裝入瓶中，滅菌，即得本品靜脈注射液。
實施例20靜脈注射凍干劑

制備方法將水溶性2-(α-正戊酮基)苯甲酸鹽溶于適量的注射用水中，加適量氫氧化鈉，將pH調(diào)至9.0(范圍可以在7.5～9.5之間)，根據(jù)需要添加適量甘露醇，過濾，裝瓶凍干，即得本品靜脈注射凍干劑。使用時用0.9％生理鹽水或5％葡萄糖注射液稀釋后進行靜脈注射或靜脈點滴。
實施例21急性毒性試驗本實施例選用一、動物ICR小鼠，雌雄各半，體重18～20g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。合格證號為SCXK(京)2002-0003。
二、受試藥3-正丁烯基苯酞，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、N，N′-二芐基乙二胺鹽，DL-3-正丁基苯酞，2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽、鈣鹽、N，N′-二芐基乙二胺鹽，由北京天衡藥物研究院提供，用食用色拉油配制成不同濃度。
三、試驗方法取ICR小鼠，按體重和性別隨機分組，每組10只，雌雄各半，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，按組間距1∶0.8設(shè)計各組劑量。經(jīng)口灌胃，給藥容量為0.2ml/10g體重，試驗前禁食不禁水12小時，給藥后常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察7天，記錄動物毒性反應(yīng)和死亡情況，死亡組進行尸檢，肉眼觀察病理變化，用Bliss法計算LD50值及95％可信限。
四、試驗結(jié)果表二急性毒性試驗結(jié)果

從上述結(jié)果可以看出，3-正丁烯基苯酞的急性毒性弱于DL-3-正丁基苯酞，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鉀鹽、鈣鹽和N，N’-二芐基乙二胺鹽的急性毒性均分別弱于對應(yīng)的2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽、鈣鹽和N，N’-二芐基乙二胺鹽。
實施例22對大腦中動脈血栓模型(Middle Cerebral Artery Thrombosis，MCAT)大鼠神經(jīng)癥狀及腦梗塞范圍的影響本實施例選用一、動物SD大鼠，雌雄兼用，體重190～210g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK 11-00-0008。
二、藥物與試劑受試藥3-正丁烯基苯酞，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、N，N′-二芐基乙二胺鹽，DL-3-正丁基苯酞，2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽、鈣鹽、N，N′-二芐基乙二胺鹽，由北京天衡藥物研究院提供，試驗前用食用色拉油混懸，配制成不同濃度。
試劑FeCl3·6H2O(A.R.)，北京化工廠生產(chǎn)，用1mol/L鹽酸配制；紅四氮唑(TTC)，北京化工廠生產(chǎn)。
三、儀器XTT實體顯微鏡北京電光科學儀器廠生產(chǎn)；恒溫水浴振蕩器SHZ-22型江蘇大倉醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；電子分析天平AEG-220型，日本島津產(chǎn)。
四、試驗方法及結(jié)果(一)對MCAT大鼠神經(jīng)癥狀的影響1、分組及給藥將實驗動物隨機分成以下各組，即假手術(shù)組，MCAT模型組，3-正丁烯基苯酞，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、N，N′-二芐基乙二胺鹽，DL-3-正丁基苯酞及2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽、鈣鹽、N，N′-二芐基乙二胺鹽各50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg組。造模前預(yù)防給藥，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥3天，第4天造模，造模后即刻灌胃給予一天劑量。造模后12小時再灌胃給予一天劑量，對照組給予等量溶媒。
2、實施造模手術(shù)大鼠腹腔注射12％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉。參照Tamura等的方法(Tamura A，Graham DI，McCulluoch J et al.Focal Cerebral ischemia in the rat.1.Description oftechnique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.J Cereb BloodFlow Metab，1981，153)并加以改進，將大鼠右側(cè)臥位固定，在眼外眥和外耳道連線中點作一弧形切口，長約1.5cm，夾斷顳肌并切去，暴露顳骨，用牙科鉆在顴骨與顳鱗骨接合處向口側(cè)1mm處作一直徑2.5mm骨窗，清理殘渣，暴露大腦中動脈(位于嗅束及大腦下靜脈之間)。將吸有50％氯化鐵溶液10μl的小片定量濾紙敷在此段大腦中動脈上，約30min待血管顏色變黑后取下濾紙，用生理鹽水沖洗局部組織，逐層縫合，回籠飼養(yǎng)。
3、行為檢測參照Bederson等的方法(Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M et al.Rat middlecerebral artery occlusionevaluation of the mode and development of a neurologicexamination.Stroke，1986，17472)并加以改進，在術(shù)后不同時間點(6h，24h)對動物進行行為評分。(1)提鼠尾離開地面約一尺，觀察前肢屈曲情況。如雙前肢對稱伸向地面，記為0分；如手術(shù)對側(cè)前肢出現(xiàn)肩屈曲、肘屈曲、肩內(nèi)旋或既有腕肘的屈曲又有內(nèi)旋者，記為1分。(2)將動物置于平滑地面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動，檢查阻力。如雙側(cè)阻力對等且有力記為0分；如向手術(shù)對側(cè)推動時阻力下降者，記為1分。(3)將動物兩前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察兩前肢的肌張力。雙側(cè)肌張力對等且有力者為0分；手術(shù)對側(cè)前肢肌張力下降記為1分。(4)提鼠尾離開地面約一尺，動物有不停地向手術(shù)對側(cè)旋轉(zhuǎn)者，記為1分。根據(jù)以上標準評分，滿分為4分，分數(shù)越高，動物的行為障礙越嚴重。
4、結(jié)果分析對行為檢測評分值進行組間比較，t檢驗。結(jié)果見表三、四、五。
表三各化合物(50mg/kg)對MCAT大鼠神經(jīng)癥狀的影響

注與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05。
2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈣鹽與2-(α-羥基戊基)苯甲酸鈣鹽比較，$P＜0.05。
表四各化合物(100mg/kg)對MCAT大鼠神經(jīng)癥狀的影響

注與模型組比較，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。
表五各化合物(200mg/kg)對MCAT大鼠神經(jīng)癥狀的影響

注與模型組比較，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。
2-(α-正戊酮基)苯甲酸鉀鹽與2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽比較，$P＜0.05。
結(jié)果顯示，假手術(shù)組未見行為異常改變，模型組大鼠在術(shù)后6h、24h均出現(xiàn)偏癱樣癥狀，主要表現(xiàn)為手術(shù)對側(cè)前肢內(nèi)收，肩內(nèi)旋，前肢肌張力降低，肩抗力下降。與模型組相比，各受試化合物在50～200mg/kg劑量范圍內(nèi)對大鼠術(shù)后24h神經(jīng)癥狀均有不同程度的改善，其中化合物2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、N，N’-二芐基乙二胺鹽、DL-3-正丁基苯酞和2-(α-羥基戊基)苯甲酸N，N’-二芐基乙二胺鹽50mg/kg組大鼠術(shù)后24h神經(jīng)癥狀均顯著改善(P＜0.01或P＜0.05)；所有受試化合物在100mg/kg和200mg/kg劑量時大鼠術(shù)后24h神經(jīng)癥狀均有顯著改善(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)；在50mg/kg劑量時，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈣鹽對大鼠術(shù)后24h神經(jīng)癥狀的改善作用顯著優(yōu)于2-(α-羥基戊基)苯甲酸鈣鹽(P＜0.05)；在200mg/kg劑量時，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鉀鹽對大鼠術(shù)后24h神經(jīng)癥狀的改善作用顯著優(yōu)于2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽(P＜0.05)。
結(jié)果提示，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鹽系列化合物對缺血性腦損傷引起的肢體張力改變有明顯的改善作用，與已公開的2-(α-羥基戊基)苯甲酸鹽相比，本發(fā)明的化合物具有更小的顯著性療效劑量，即在較低劑量(50mg/kg)下，本發(fā)明的化合物即可表現(xiàn)出顯著性的效果。此外，從24小時抑制作用百分比的數(shù)值來看，相同劑量下，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鉀鹽、鈣鹽及N，N’-二芐基乙二胺鹽對MCAT大鼠神經(jīng)癥狀的改善作用均分別強于對應(yīng)的2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽、鈣鹽和N，N’-二芐基乙二胺鹽。
(二)對MCAT大鼠腦梗塞范圍的影響動物經(jīng)末次行為評分后，斷頭取腦。去掉嗅球、小腦和低位腦干，剩余部份在4℃以下冠狀切成5片。迅速將腦片置于TTC染液中(每5ml染液中含4％TTC1.5ml，1MK2HPO40.1ml)，37℃避光溫孵30分鐘，再取出，置于10％甲醛液中避光保存。經(jīng)染色后非缺血區(qū)為玫瑰紅色，梗塞區(qū)為白色。將白色組織仔細挖下稱重，以梗塞組織重量占總腦重量的百分比作為腦梗塞范圍。結(jié)果進行組間比較，t檢驗，結(jié)果見表六、七、八。
表六各化合物(50mg/kg)對MCAT大鼠腦梗塞范圍的影響

注與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05。
表七各化合物(100mg/kg)對MCAT大鼠腦梗塞范圍的影響

注與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05。
表八各化合物(200mg/kg)對MCAT大鼠腦梗塞范圍的影響

注與模型組比較，***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05。
結(jié)果表明，術(shù)后24h，除假手術(shù)組無梗塞灶外，模型組和給藥組大鼠均有不同程度的梗塞灶。其中，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉、鉀、鈣以及N，N’-二芐基乙二胺鹽50mg/kg組大鼠腦梗塞程度明顯輕于模型組(P＜0.05)；各化合物100mg/kg組大鼠腦梗塞程度均明顯輕于模型組，與模型組相比均有顯著差異(P＜0.01或P＜0.05)；各化合物200mg/kg組大鼠腦梗塞程度均明顯輕于模型組，與模型組相比均有顯著差異(P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001)。
結(jié)果提示，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鹽系列化合物對缺血性腦損傷引起的腦組織梗塞有明顯的改善作用，與已公開的2-(α-羥基戊基)苯甲酸鹽相比，本發(fā)明的化合物具有更小的顯著性療效劑量，即在較低劑量(50mg/kg)下，本發(fā)明的化合物即可表現(xiàn)出顯著性的效果。此外，從作用抑制百分比來看，相同劑量下，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鉀鹽、鈣鹽及N，N’-二芐基乙二胺鹽對MCAT大鼠腦組織梗塞的改善作用均分別強于對應(yīng)的2-(α-羥基戊基)苯甲酸鉀鹽、鈣鹽和N，N’-二芐基乙二胺鹽。
實施例23對大鼠動-靜脈旁路血栓形成的影響本實施例選用一、動物SD大鼠，雌雄兼用，體重240～280g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK 11-00-0008。
二、藥物與試劑受試藥3-正丁烯基苯酞，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、N，N’-二芐基乙二胺鹽，由北京天衡藥物研究院提供，試驗前用食用色拉油混懸，配制成不同濃度。
天保寧浙江康恩貝制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號020108-4，受試劑量24mg/kg。
三、儀器AEG-220型電子分析天平，日本島津儀器公司產(chǎn)品；Df-206型鼓風干燥箱，北京西城醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。
四、試驗方法與結(jié)果試驗方法參考陳奇主編，《中藥藥理研究方法學》，人民衛(wèi)生出版社，1993.9，第1版，5101、分組與給藥將大鼠隨機分組，即血栓模型組，3-正丁烯基苯酞200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg組，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉鹽200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg組，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鉀鹽200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg組，2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈣鹽200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg組，2-(α-正戊酮基)苯甲酸N，N’-二芐基乙二胺鹽200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg組，天保寧24mg/kg組。各給藥組均按0.2ml/100g體重灌胃給藥，一天1次，連續(xù)給藥3天，血栓模型組給予等量溶媒。末次給藥后即進行手術(shù)。
2、造模方法將大鼠腹腔注射10％水合氯醛0.35ml/100g麻醉，仰臥位固定，手術(shù)，分離右頸總動脈和左頸外靜脈。在10cm長的聚乙烯管中段放入一根事先稱重的長8cm的0號手術(shù)線，以生理鹽水溶液充滿，兩端聯(lián)結(jié)長約3cm充滿生理鹽水溶液的插管。該管的一端插入左頸外靜脈后，另一端插入右頸總動脈。血液從右側(cè)頸總動脈流至聚乙烯管內(nèi)，再返流入左頸外靜脈，構(gòu)成環(huán)路血流。10min后中斷血流，迅速取出血栓稱重，該重量減去絲線重、紙重即血栓濕重；放入烘箱中60℃干燥24h，取出血栓稱重，該重量減去絲線重、紙重即血栓干重。各組間采用t-檢驗進行比較。按下列公式計算抑制率 3、試驗結(jié)果結(jié)果見表九、十。
表九3-正丁烯基苯酞及2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉鹽對大鼠動-靜脈環(huán)路血栓的抑制作用(X±SD)

注與血栓模型組相比，**P＜0.01，*P＜0.05。
表十2-(α-正戊酮基)苯甲酸鉀、鈣及N，N’-二芐基乙二胺鹽對大鼠動-靜脈環(huán)路血栓的抑制作用(X±SD)

注與血栓模型組相比，**P＜0.01，*P＜0.05。
結(jié)果顯示，各化合物在50～100mg/kg劑量范圍內(nèi)均有抑制血栓形成作用，可不同程度的減少動靜脈環(huán)路血栓的濕重、干重。其中，3-正丁烯基苯酞100mg/kg對血栓濕重、干重的最大抑制率分別達到34.93％和39.74％；2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈉鹽100mg/kg組對血栓濕重、干重的最大抑制率分別達到45.39％和48.16％；2-(α-正戊酮基)苯甲酸鉀鹽200mg/kg組對血栓濕重、干重的最大抑制率分別達到39.43％和44.83％；2-(α-正戊酮基)苯甲酸鈣鹽200mg/kg組對血栓濕重、干重的最大抑制率分別達到37.04％和40.74％；2-(α-正戊酮基)苯甲酸N，N’-二芐基乙二胺鹽100mg/kg組對血栓濕重、干重的最大抑制率分別達到39.08％和41.72％。
結(jié)果提示，3-正丁烯基苯酞及上述2-(α-正戊酮基)苯甲酸鹽對大腦中動脈血栓模型大鼠神經(jīng)癥狀及腦梗塞范圍的明顯改善作用可能與其對血栓形成的抑制作用有關(guān)。
權(quán)利要求
1.2-(α-正戊酮基)苯甲酸鹽，其結(jié)構(gòu)通式如下 其中，n＝1，2M為一價金屬離子、或是二價金屬離子，或是有機堿基。
2.按照權(quán)利要求1中化合物，其特征是M為一價金屬離子鋰、鈉、鉀，或二價金屬離子鎂、鈣、鋅，或有機堿基芐胺、叔丁胺、甲基芐胺、N，N’-二芐基乙二胺。
3.按照權(quán)利要求1中所述化合物，其特征是M為鈉、鉀、鈣、N，N’-二芐基乙二胺。
4.如權(quán)利要求1的化合物中M為有機堿基的制備方法3-正丁烯基苯酞堿性條件下水解，再酸化得到2-(α-正戊酮基)苯甲酸，溶于低極性溶劑后與有機堿的溶液反應(yīng)，成鹽析出，抽濾，淋洗，抽干，干燥，即得到本發(fā)明化合物中有機堿的鹽。上述所用低極性溶劑包括苯類、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯。
5.如權(quán)利要求1的化合物M為一價金屬離子的制備方法3-正丁烯基苯酞堿性條件下水解，再酸化得到2-(α-正戊酮基)苯甲酸，與溶于強極性溶劑的金屬離子的堿反應(yīng)成鹽，然后攪拌下加入低極性溶劑，攪拌數(shù)小時，析出，抽濾，用溶劑淋洗，抽干，干燥，即得到本發(fā)明化合物中一價金屬離子的鹽。上述所用強極性溶劑包括C1-C4低級醇類，低極性溶劑包括苯類、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯。
6.權(quán)利要求4、5中所述的制備方法，其特征是低極性溶劑為乙醚，強極性溶劑為甲醇。
7.如權(quán)利要求1所述的化合物M為二價金屬離子的制備方法，其特征是用已制備好的2-(α-正戊酮基)苯甲酸鹽的溶液，與二價金屬離子鹽的溶液混合，進行鹽交換反應(yīng)，制得二價金屬離子的2-(α-正戊酮基)苯甲酸鹽。
8.權(quán)利要求1中所述化合物在制備用于治療和預(yù)防心、腦缺血性疾病及改善心腦循環(huán)障礙、抗血栓的藥物中的應(yīng)用。
9.用于治療和預(yù)防心腦缺血性疾病及改善心腦循環(huán)障礙、抗血栓的藥物組合物，其特征是含有治療有效量的權(quán)利要求1的化合物和藥學上可接受的載體。
10.按照權(quán)利要求9中的藥物組合物，其特征是可以制成片劑、膠囊劑、顆粒劑、靜脈注射劑和靜脈注射凍干劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的2－(α－正戊酮基)苯甲酸鹽及其制法，和以該化合物為活性成分的藥物組合物，還涉及該化合物在制備預(yù)防和治療心腦缺血性疾病、抗血栓及改善心腦循環(huán)障礙的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號C07C51/09GK1560018SQ200410007520
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月12日
發(fā)明者劉全志, 楊文斌, 秦華, 趙興凱, 馬喜生 申請人:北京天衡藥物研究院