本發(fā)明屬于植物病理領(lǐng)域，具體涉及同時(shí)檢測(cè)柑橘黃化脈明病毒和衰退病毒的多重RT-PCR方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

柑橘黃化脈明病毒(Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV)引起的柑橘黃脈病是我國(guó)新發(fā)生的一種病害，對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)尤其是檸檬產(chǎn)業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。CYVCV是由7529個(gè)核苷酸組成的正義單鏈RNA(+ssRNA)病毒，屬于柑橘病毒屬(Mandarivirus)的成員。CYVCV除了通過(guò)嫁接、摩擦接種傳播以外，在菜豆(Phaseolus vulgaris)和豇豆(Vignaunguiculata)上還可通過(guò)繡線菊蚜(Aphis spiraecolaPatch)和豆蚜(A.CraccivoraKoch)進(jìn)行傳播。由柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)引起的柑橘衰退病，是世界性的柑橘病毒病害，對(duì)全世界的柑橘產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。CTV是由19226～19296個(gè)核苷酸組成的正義單鏈RNA病毒，屬于長(zhǎng)線形病毒屬(Closterovirus)，是目前已知植物病毒基因組中最大的病毒。CTV除了通過(guò)嫁接傳播以外，在田間還可通過(guò)蚜蟲(chóng)如褐色橘蚜(Toxopteracitricida)、棉蚜(Aphid gossypii)和橘二叉蚜(T.aurantii)等以非循回型半持久方式進(jìn)行傳播。為了快速評(píng)價(jià)田間果樹(shù)和苗木CYVCV和CTV的感病情況，亟需建立同時(shí)快速檢測(cè)多種病毒的多重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)于CYVCV和CTV的檢測(cè)。有關(guān)CYVCV和CTV分別檢測(cè)方法已有許多報(bào)道。采用指示植物鑒定法；電子顯微鏡檢測(cè)法；使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)，RT-PCR分子檢測(cè)法等。多重RT-PCR技術(shù)具有靈敏、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于植物病毒檢測(cè)。CYVCV和CTV具有相似的傳播途徑，由于長(zhǎng)期不規(guī)范的田間操作、苗木生產(chǎn)以及介體昆蟲(chóng)傳播，導(dǎo)致這兩種病毒廣泛傳播和流行，對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的危害，田間常出現(xiàn)這兩種病害混合侵染現(xiàn)象。而目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)CYVCV和CTV同時(shí)多重PCR檢測(cè)方法的報(bào)道，因此建立一套同時(shí)檢測(cè)這兩種病毒的一步法多重RT-PCR檢測(cè)體系，為評(píng)價(jià)這兩種病毒在田間侵染情況以及在苗木脫毒過(guò)程中病毒的脫除情況，提供快速、簡(jiǎn)便、可靠的檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)檢測(cè)大田CYVCV和CTV一步法多重RT-PCR方法，實(shí)現(xiàn)CYVCV和CTV同時(shí)、快速、靈敏檢測(cè)，為提高CYVCV和CTV高效檢測(cè)效率和及時(shí)有效防治贏取時(shí)間。

影響多重RT-PCR反應(yīng)的因素很多，發(fā)明人綜合考慮了引物濃度、Mg²⁺濃度、dNTP濃度、退火溫度以及循環(huán)次數(shù)等變化的影響，首先對(duì)體系中Mg²+和dNTP的用量進(jìn)行調(diào)整，增加Mg²⁺濃度，獲得最適宜的擴(kuò)增效果，提高了PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率，本體系采用Mg²⁺濃度為0.625 mmol/L和dNTP濃度為0.2～0.25 mmol/L。其次，本發(fā)明就影響一步法多重RT-PCR擴(kuò)增的三對(duì)引物濃度進(jìn)行了優(yōu)化調(diào)整，為排除總RNA在提取中雜質(zhì)和操作過(guò)程的影響，加入了高度保守的Ubiquitin序列作為內(nèi)參基因，使此多重RT-PCR檢測(cè)體系結(jié)果更真實(shí)可信。但UBQ引物在柑橘中特異性或其在引物間競(jìng)爭(zhēng)擴(kuò)增能力較弱，短片段的UBQ擴(kuò)增效率比另外兩個(gè)病毒的擴(kuò)增效率低，UBQ的擴(kuò)增片段較短且與引物二聚體接近，有時(shí)會(huì)導(dǎo)致UBQ擴(kuò)增結(jié)果不易辨別，所以要協(xié)調(diào)三對(duì)引物在整個(gè)反應(yīng)體系中的平衡關(guān)系，最后確定CYVCV引物濃度為0.15～0.2μmol/L，CTV引物濃度為0.1～0.13μmol/L，Ubiquitin引物濃度為0.5μmol/L。且多重PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，不需要大型的檢測(cè)儀器，常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作方便，適合兩種病毒在田間侵染情況的同時(shí)快速檢測(cè)。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

同時(shí)檢測(cè)柑橘黃化脈明病毒和衰退病毒的多重RT-PCR方法，提取待檢葉片樣品的總DNA為模板，以SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示序列為引物進(jìn)行多重RT-PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果，多重RT-PCR擴(kuò)增的特定PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，62℃～63℃退火50 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min；10℃終止反應(yīng)。

進(jìn)一步，所述的引物對(duì)為：

SEQ ID NO.1 CYVCV F：TACCGCAGCTATCCATTTCC

SEQ ID NO.2 CYVCV R：GCAGAAATCCCGAACCACTA

SEQ ID NO.3 LD F：TCATTGCAAAGTGACGACGAC

SEQ ID NO.4 LD R：TGCCTGACATTGGTAACTACG

SEQ ID NO.5 UBQ F：GATCTTCGCCTTAACGTTGT

SEQ ID NO.6 UBQ R：GTTGATTTTTGCTGGGAAGC

多重PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系中，Mg²⁺濃度為0.625 mmol/L，dNTPs濃度為0.2～0.25 mmol/L，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物濃度各為0.15～0.2μmol/L，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4引物濃度各為0.1～0.13μmol/L，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6引物濃度為0.5μmol/L。

多重RT-PCR檢測(cè)方法在檢測(cè)植物柑橘黃化脈明病毒和衰退病毒應(yīng)用，其所述的植物種類(lèi)為蕓香科柑橘屬植物。

進(jìn)一步，所述的蕓香科柑橘屬植物為柚、甜橙、檸檬、沙柑、橘橙。

本發(fā)明的有益效果在于：本體系能同時(shí)從4ng/μL的樣品總核酸中檢測(cè)出CYVCV和CTV。與單一RT-PCR相比，操作簡(jiǎn)便、節(jié)約時(shí)間和成本，避免樣品間的交叉污染導(dǎo)致假陽(yáng)性，且能達(dá)到與單一PCR的靈敏度，可以同時(shí)準(zhǔn)確的檢測(cè)柑橘中CYVCV和CTV的侵染。并加入了高度保守的Ubiquitin序列作為內(nèi)參基因，使此多重RT-PCR檢測(cè)體系結(jié)果更真實(shí)可信。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進(jìn)行說(shuō)明：

圖1為不同循環(huán)次數(shù)多重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；

圖2為不同Mg²⁺和dNTPs用量組合多重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；

圖3為不同退火溫度多重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；

圖4為CYVCV和CTV不同引物濃度多重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖5為內(nèi)參基因不同引物濃度多重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；

圖6為2種柑橘病毒的多重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果；

圖7為單一RT-PCR(A、B)和多重RT-PCR(C)靈敏度比較結(jié)果；

圖8為多重RT-PCR對(duì)田間樣品檢測(cè)結(jié)果。

其中，圖1中A為30個(gè)循環(huán)次數(shù)擴(kuò)增結(jié)果；B為35個(gè)循環(huán)次數(shù)擴(kuò)增結(jié)果；M：DL2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：健康甜橙；2：CYVCV+CTV混合甜橙；3：水對(duì)照；

圖2中M:DL2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～7見(jiàn)表2；

圖3中A為不同退火溫度下健康對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果；B為不同退火溫度下感病樣品擴(kuò)增結(jié)果；

M：DL2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-12分別為退火溫度51.0、51.3、52.1、53.4、54.8、56.3、57.7、59.1、60.6、61.9、62.7和63℃；

圖4中A為CTV不同引物濃度多重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果1～3：CTV的引物濃度分別為0.1、0.13、0.15μmol/L；M：DL2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)；B為CYVCV不同引物濃度多重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；1～3：CYVCV的的引物濃度分別為0.1、0.15、0.2μmol/L；M：DL2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)；

圖5中M：DL2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)1，1～3：內(nèi)參基因引物濃度分別為0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L，4：水對(duì)照；

圖6中M：DL2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)1：CYVCV+CTV混合甜橙；2：CYVCV甜橙；3：CTV甜橙；4：健康甜橙；5：水對(duì)照；

圖7中M：DL2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)；H：健康對(duì)照；

圖8中M：DL2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-11：田間樣品；12：陽(yáng)性對(duì)照13：水對(duì)照。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1

1.供試材料

感染CTV和CYVCV 2種病毒的供試材料為西蒙斯甜橙，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所國(guó)家柑橘苗木脫毒中心提供。以此甜橙的葉片為陽(yáng)性材料，以健康甜橙實(shí)生苗葉片為陰性對(duì)照材料。田間樣品于2016年9月在重慶北碚隨機(jī)采取葉片5-10片。

2.總核酸提取

用RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa，日本)根據(jù)操作說(shuō)明書(shū)提取甜橙葉片(直接從毒源或健康實(shí)生苗上收集或保存在-80℃冰箱)總核酸，40μL DEPC水溶解，并用分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度，A280/A260比值范圍為1.8～2.2，以所提取核酸作為一步法多重RT-PCR的模板。

3.一步法單一RT-PCR

CYVCV、CTV和內(nèi)參基因的RT-PCR引物見(jiàn)表1。CYVCV一步法RT-PCR使用One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒(TaKaRa，日本)參照Chen等^[20]的方法進(jìn)行檢測(cè)，CTV一步法RT-PCR經(jīng)摸索可用相同方法進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10μL，含2×1Step Buffer 5μL，上、下游引物(表1)各0.2μL，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 0.3μL，加入RNA模板1μL，最后加滅菌水補(bǔ)足10μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)；72℃5min；12℃終止反應(yīng)。

表1多重和單一RT-PCR引物

實(shí)施例2

一步法多重RT-PCR體系的建立

設(shè)計(jì)特異性引物，用One Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒(TaKaRa，日本)，就影響一步法多重RT-PCR擴(kuò)增的CTV和CYVCV引物濃度進(jìn)行了優(yōu)化調(diào)整，通過(guò)比較3對(duì)引物不同濃度PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果確定最終適宜引物濃度。對(duì)PCR體系中另添加的Mg²⁺和dNTP最終濃度進(jìn)行優(yōu)化后，設(shè)定7種濃度組合(表2)，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳確定最佳組合。根據(jù)3對(duì)引物的Tm值，通過(guò)梯度PCR儀(BiometraTgradient)對(duì)退火溫度設(shè)置梯度溫差為12℃，共12個(gè)退火溫度(T1-T12)：51.0、51.3、52.1、53.4、54.8、56.3、57.7、59.1、60.6、61.9、62.7和63℃，通過(guò)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果確定最適溫度梯度。

1.PCR循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化

以陽(yáng)性甜橙葉片抽提的總核酸為模板，總反應(yīng)體系10ul包括：2×1Step Buffer 5μL，CYVCV引物各0.2μL，CTV引物各0.13μL，內(nèi)參引物各0.3μL，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 0.3μL，總核酸模板1μL，Mg²⁺和dNTPs各0.2μL，滅菌純水加到總體積10μL。PCR反應(yīng)條件為：50℃30min；94℃4min；94℃30s，55℃50s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)或30個(gè)循環(huán)；72℃10min；10℃終止反應(yīng)，觀察多重RT-PCR體系在30和35個(gè)循環(huán)次數(shù)時(shí)目的條帶的擴(kuò)增情況，30個(gè)循環(huán)時(shí)，內(nèi)參基因的條帶不清晰(圖1，A)，35個(gè)循環(huán)時(shí)，擴(kuò)增出的2種病毒和內(nèi)參基因的目的條帶均清晰(圖1，B)，因此初步確定PCR循環(huán)次數(shù)為35。

2.Mg²⁺和dNTPs濃度的優(yōu)化

以陽(yáng)性甜橙葉片抽提的總核酸為模板，總反應(yīng)體系10ul包括：2×1Step Buffer 5μL，CYVCV引物各0.2μL，CTV引物各0.13μL，內(nèi)參引物各0.3μL，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 0.3μL，總核酸模板1μL，Mg²⁺和dNTPs濃度為表2共7組組合，滅菌純水加到總體積10μL。PCR反應(yīng)條件為：50℃30min；94℃4min；94℃30s，55℃50s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)或30個(gè)循環(huán)；72℃10min；10℃終止反應(yīng)。

通過(guò)比較不同Mg²⁺和dNTPs濃度的共7組組合時(shí)的一步法多重RT-PCR反應(yīng)的瓊脂糖電泳結(jié)果(圖2)，如圖CYVCV、CTV和UBQ的特異性片段大小分別為614bp、373bp、194bp，7個(gè)組合都可以擴(kuò)增出目的條帶，根據(jù)目的條帶的亮度，確定10μL體系中另需添加Mg²⁺和dNTPs的最佳組合濃度為0.625mmol/L和0.2mmol/L或0.625mmol/L和0.25mmol/L

表2一步法多重PCR體系中Mg²⁺和dNTPs的用量組合

3.退火溫度的優(yōu)化

以上述最佳的各組分用量和PCR循環(huán)次數(shù)，退火溫度從51～63℃進(jìn)行一步法多重溫度梯度RT-PCR(圖3)。觀察比較健康對(duì)照和感病甜橙樣品的總核酸在不同溫度下的多重RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，可以看出退火溫度為51℃、54.8℃和56.3℃時(shí)，感病樣品可同時(shí)擴(kuò)增出3個(gè)清晰分明的特異性目的條帶(圖3，A)，但健康對(duì)照中非特異性擴(kuò)增明顯(圖3，B)；退火溫度為62.7℃時(shí)，雖然陽(yáng)性樣品中內(nèi)參基因的目的條帶較弱(圖3，A)，但健康對(duì)照中無(wú)非特異性擴(kuò)增且無(wú)拖尾現(xiàn)象(圖3，B)，可以初步確定退火溫度最佳范圍是62～63℃。

4.引物濃度的優(yōu)化

(1)CYVCV和CTV引物濃度

最初就影響一步法多重RT-PCR擴(kuò)增的CTV和CYVCV引物濃度進(jìn)行了優(yōu)化調(diào)整，PCR反應(yīng)條件為：50℃30min；94℃4min；94℃30s，55℃50s，72℃1min，35個(gè)循環(huán),72℃10min；10℃終止反應(yīng)。多重RT-PCR反應(yīng)體系中CYVCV引物濃度為0.1μmol/L，Ubiquitin引物濃度為0.3μmol/L，CTV引物濃度從0.1μmol/L增加到0.15μmol/L，CTV的目的條帶增亮，擴(kuò)增效率增加，而CYVCV的擴(kuò)增效率有所下降，CYVCV的目的條帶變?nèi)?圖4A)。多重RT-PCR反應(yīng)體系中CTV引物濃度為0.13μmol/L，Ubiquitin引物濃度為0.3μmol/L CYVCV引物濃度從0.1μmol/L增加到0.2μmol/L，CYVCV的目的條帶逐漸增亮，擴(kuò)增效率提高，而CTV的目的條帶亮度變化不明顯(圖4B)。初步確定CYVCV引物濃度為0.15～0.2μmol/L，CTV引物濃度為0.1～0.13μmol/L，Ubiquitin引物濃度為0.3μmol/L。

(2)內(nèi)參引物濃度

經(jīng)過(guò)退火溫度優(yōu)化后，退火溫度最佳范圍62～63℃時(shí)，陽(yáng)性樣品中內(nèi)參基因的目的條帶較弱，進(jìn)一步調(diào)整內(nèi)參引物濃度，多重RT-PCR體系中CYVCV引物各0.2μL，CTV引物各0.13μL，Ubiquitin引物濃度分別為0.3、0.4和0.5μmol/L，在退火溫度為63℃50s進(jìn)行PCR反應(yīng)。UBQ濃度為0.3μmol/L和0.4μmol/L時(shí)，內(nèi)參基因的條帶不清晰(圖5)，UBQ濃度為0.5μmol/L時(shí)，擴(kuò)增出的2種病毒和內(nèi)參基因的目的條帶均清晰(圖5)，因此最終確定UBQ濃度為0.5μmol/L。

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，最終確定感染CYVCV和CTV 2種病毒病的柑桔樣品的一步法多重RT-PCR反應(yīng)體系和一步法多重RT-PCR反應(yīng)程序。一步法多重RT-PCR體系(10μL)為：2×1Step Buffer 5μL，25mmol/L的Mg²⁺0.25μL，10mmol/L的dNTPs 0.2～0.25μL，CYVCV引物0.15～0.2μL，CTV引物0.1～0.13μL，內(nèi)參引物0.5μL，PrimeScript 1Step Enzyme Mix 0.3μL，總核酸模板1μL，用滅菌純水將體積補(bǔ)至10μL。一步法多重RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃30min；94℃4min；94℃30s，62～63℃50s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；10℃終止反應(yīng)。利用建立的多重體系對(duì)感病樣品和健康樣品進(jìn)行一步法多重RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果顯示2種病毒和內(nèi)參基因的目的條帶均清晰，這說(shuō)明建立的一步法多重RT-PCR檢測(cè)體系擴(kuò)增效果較好(圖6)。

實(shí)施例3

1.一步法單一和多重RT-PCR檢測(cè)靈敏度比較結(jié)果

檢測(cè)靈敏度測(cè)試結(jié)果表明，一步法單一RT-PCR體系對(duì)復(fù)合感染2種病毒的陽(yáng)性樣品能夠檢測(cè)出CYVCV的總核酸最大稀釋倍數(shù)為10^-2倍(圖7，A)，能夠檢測(cè)出CTV的總核酸最大稀釋倍數(shù)為10^-2倍(圖7，B)。一步法多重RT-PCR體系能夠檢測(cè)出CYVCV和CTV的總核酸最大稀釋倍數(shù)為10^-2倍(圖7，C)，達(dá)到單一RT-PCR體系的檢測(cè)靈敏度。該一步法多重RT-PCR方法最低能從4ng/μL總核酸中檢測(cè)出CYVCV和CTV，其靈敏度與單一RT-PCR檢測(cè)靈敏度一致。

2.一步法多重RT-PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序

多重RT-PCR擴(kuò)增獲得的DNA片段經(jīng)電泳、分別切膠回收，克隆到T載體上，經(jīng)公司測(cè)序后，序列用NCBI Blast進(jìn)行同源性搜索比對(duì)。結(jié)果顯示，CYVCV的特異片段與已提交的中國(guó)湖南分離物(KT124646)和中國(guó)重慶分離物(KP313240)同源性達(dá)到99％，與其他分離物同源性均在95％以上。CTV特異片段與中國(guó)分離物(FJ998200)和兩個(gè)意大利分離物(KJ790175和KC748392)同源性均高達(dá)99％，與美國(guó)分離物(DQ363901)同源性為97％，與其他分類(lèi)物同源性均96％以上。CYVCV和CTV的擴(kuò)增片段與NCBI中登錄的序列具有較高的同源性，表明擴(kuò)增獲得的DNA片段是目的條帶。

3.一步法多重RT-PCR檢測(cè)體系的實(shí)際運(yùn)用

應(yīng)用優(yōu)化后建立的一步法多重RT-PCR檢測(cè)體系對(duì)33個(gè)柑橘田間樣品進(jìn)行檢測(cè)(圖8)，快速評(píng)價(jià)這2種病毒在田間的侵染情況，結(jié)果表明(表3)，33個(gè)田間樣品中，CYVCV感染率為54.5％，CTV感染率為66.7％，復(fù)合侵染的樣品高達(dá)36.4％；CYVCV和CTV復(fù)合侵染的樣品主要集中在甜橙和溫州蜜柑中。對(duì)相應(yīng)樣品進(jìn)行一步法RT-PCR檢測(cè)，其結(jié)果與多重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果一致。

表3 33份田間不同柑橘樣品的一步法多重RT-PCR檢測(cè)

最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大學(xué)

<120> 一種同時(shí)檢測(cè)柑橘黃化脈明病毒和衰退病毒的多重RT-PCR方法及其應(yīng)用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taccgcagct atccatttcc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcagaaatcc cgaaccacta 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcattgcaaa gtgacgacga c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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