同時檢測CYVCV和CCDaV的一步法PCR檢測引物對、試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)的病毒檢測領(lǐng)域，具體的說，涉及一種同時檢測CYVCV和 (XDaV的一步法PCR檢測引物對、試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 柑橘是世界第一大水果，我國柑橘栽培面積和產(chǎn)量均居世界首位，在國民經(jīng)濟(jì)中 占有十分重要的地位。近幾年來，隨著我國柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)帶的確立，柑橘的種 植區(qū)域更趨集中，面積亦進(jìn)一步擴(kuò)大，而病害問題日益引起生產(chǎn)者的重視。隨著國際柑橘 貿(mào)易的持續(xù)增長及種質(zhì)資源交換的日益頻繁，各種檢疫性柑橘病害傳入我國的機(jī)率不斷加 大。
[0003] 柑橘黃化脈明病毒（Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV)為柑桔病毒屬 (Mandarivirus)的RNA病毒，病毒粒子呈彎曲線狀，大小約為670-700nmX 13-14nm。CYVCV 基因組含有7529個核苷酸，可能包含有6個開放讀碼框（ORFs)。柑橘褪綠矮化相關(guān)病毒 (Citrus chlorotic dwarf-associated virus，CCDaV)為雙生病毒屬（Geminiviridae)的 DNA病毒，病毒粒子呈雙聯(lián)體結(jié)構(gòu)，無包膜，由兩個不完整的二十面體組成。（XDaV基因組為 3. 4-3. 6kb，具有5個ORFs。由CYVCV和CCDaV引起的柑橘黃脈病和柑橘褪綠矮化病是重要 的柑橘病毒類病害，主要分布于巴基斯坦、印度、土耳其等國，對檸檬、粗檸檬、雜柑等柑橘 品種造成了極其嚴(yán)重的損失。近年來我國相繼在云南、四川等地發(fā)現(xiàn)了柑橘黃脈病和柑橘 褪綠矮化病，其發(fā)生呈不斷擴(kuò)大、加重的趨勢。由于這兩種病毒病均為在我國首次發(fā)現(xiàn)，因 此尚缺乏完善的檢測技術(shù)。
[0004] 傳統(tǒng)的柑橘病毒病檢測主要采用指示植物鑒定的方法，但時間長，需半年左右的 時間，而且由于柑橘黃脈病和柑橘褪綠矮化病在指示植物檸檬上引起的癥狀相似，因此需 要同時使用葡萄柚、大翼萊檬等多種指示植物來加以區(qū)分。雖然我國目前已建立了 CYVCV 的常規(guī)PCR檢測方法，但是常規(guī)檢測技術(shù)一次只能檢測一種病原物，且無法檢測CCDaV。鑒 于CYVCV和CCDaV在田間時有復(fù)合侵染發(fā)生，因此為提高檢測效率，急需建立一種能夠快 速、準(zhǔn)確、靈敏、經(jīng)濟(jì)，并同時檢測CYVCV和(XDaV的PCR檢測方法。多重PCR (multiplex PCR)又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一 PCR反應(yīng)體系里加上二對以上引物，同時 擴(kuò)增出多個核酸片段的PCR反應(yīng)，因其快捷、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，為實(shí)現(xiàn)同時檢測CYVCV和 (XDaV提供了一種重要的選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的能同時檢測CYVCV和(XDaV的一步 法PCR檢測引物對、試劑盒及方法，適合田間樣品的大規(guī)模測定和莖尖嫁接脫毒苗的快速 評價。
[0006] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 本發(fā)明的目的之一是提供一種同時檢測CYVCV和(XDaV的一步法PCR檢測引物 對，包括 CYVCV 檢測引物對：CYVCV-4f/CYVCV-4r ;CCDaV 檢測引物對：CCDV-2f/CCDV-2r ; COX基因檢測引物對：Antl/Senl ;所述引物對的序列如下：
[0008]CYVCV-4f : 5 ' -ATTACAGTGGTAGGGAGGAG-3 '，
[0009]CYVCV-4r : 5 ' -CCCAGCAGGACGAGTTAG-3 '，
[0010]CCDV-2f : 5，-ACAAGACTATCATAGCACGAGACG-3，，
[0011]CCDV-2r : 5 ' -TTTGAACTGTTTAAGTCCATCCC-3 '，
[0012] Ant1 :5 ' -CAATATCATTGATGTCCAATACT-3 '，
[0013] Senl :5' -ATTTATGTAATGGATTTAAGACCC-3'。
[0014] 本發(fā)明的另一目的是提供一種同時檢測CYVCV和(XDaV的一步法PCR檢測試劑 盒：主要包括前述引物對 CYVCV-4f/CYVCV-4r、CCDV-2f/CCDV-2r 和 Antl/Senl，以及 PCR 反應(yīng)試劑。
[0015] 本發(fā)明的目的還在于提供一種同時檢測CYVCV和(XDaV的一步法PCR檢測方法， 包括如下步驟：
[0016] (1)提取柑橘待測樣品的總核酸；
[0017] (2)將提取到的總核酸進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增所用引物為權(quán)利要求1中所述 引物對 CYVCV-4f/CYVCV-4r，CCDV-2f/CCDV-2i和 Antl/Senl ;
[0018] (3)對步驟⑵所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測是否含有CYVCV、(XDaV和COX基因的擴(kuò)增 片段，從而判斷樣品中的總核酸是否被提取出來，且樣品是否感染CYVCV或CCDaV。
[0019] 所述步驟⑵中PCR的反應(yīng)體系為：10 yM CYVCV引物CYVCV-4f/4r各0? 2 y L， 10 y M CCDaV 引物 CCDaV-2f/2i各 0? 5 y L，10 y M 內(nèi)參基因引物 Antl/Senl 各 0? 1 y L，5 y L 2 Xlstep buffer，0.4 yL PrimScript IStep Enzyme Mix，1.0 yL DEPC 水。PCR 反應(yīng)條件 為：5(TC 30min，94°C 2min ;94°C 30sec，55°C 30sec，72°C 45sec，循環(huán) 30 次。
[0020] 所述步驟（2)中引物對CYVCV-4f/CYVCV-4r擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為1314bp，引物 對CCDV-2f/CCDV-2i擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為916bp，引物對Antl/Senl擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為 372bp〇
[0021] 所述步驟（3)中對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測的方法為：將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 0-1. 5%瓊脂 糖凝膠電泳，觀察是否出現(xiàn)1314bp、916bp和372bp的條帶，如果同時出現(xiàn)1314bp和372bp 的條帶，說明樣品感染了 CYVCV;如果同時出現(xiàn)916bp和372bp的條帶，說明樣品感染了 (XDaV;如果同時出現(xiàn)1314bp、916bp和372bp三條條帶，說明樣品同時感染了 CYVCV和 CCDaV。如果未擴(kuò)增出372bp的條帶，說明樣品總核酸提取失敗，需重新提取樣品的總核酸。
[0022] 本發(fā)明的有益效果是：建立了一種多重PCR檢測方法，該方法能夠通過一步PCR同 時檢測CYVCV和CCDaV，并且還能檢測出樣品中的看家基因從而進(jìn)一步提高了檢測結(jié)果的 可靠性；該方法避免了常規(guī)PCR需要對CYVCV和CCDaV分別進(jìn)行檢測的重復(fù)勞動，檢測特異 性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定性好，工序簡單，節(jié)約成本，適用于大規(guī)模推廣；為及時掌握田間柑橘 黃脈病和柑橘褪綠矮化病的發(fā)生、分布情況，同時縮短熱處理-莖尖嫁接脫毒苗的檢測周 期，推進(jìn)苗木無病毒化進(jìn)程，確保我國柑橘產(chǎn)業(yè)安全，提供了重要的技術(shù)保障。
【附圖說明】
[0023] 圖1為一步法PCR同時檢測樣品中CYVCV和(XDaV的電泳結(jié)果圖。
[0024] 圖2為一步法PCR同時檢測CYVCV和(XDaV特異性檢測圖。
[0025] 圖3為本發(fā)明方法檢測田間樣品部分電泳結(jié)果圖。
[0026] 圖4為普通PCR對田間樣品進(jìn)行CYVCV檢測部分電泳條帶圖。
[0027] 圖5為普通PCR對田間樣品進(jìn)行(XDaV檢測部分電泳條帶圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 實(shí)施例1設(shè)計特異引物
[0029] 分別根據(jù) GenBank 中 CYVCV(ID 號：JX040635. 1)的外殼蛋白基因，CCDaV(ID 號： KF561253)的移動蛋白基因，以及C0X(ID號：L22244. 1)3'端的保守區(qū)域設(shè)計了多重PCR中 檢測CYVCV、CCDaV和內(nèi)參C0X的引物對
[0030] CYVCV-4f/CYVCV-4r，CCDV-2f/CCDV-2i和 Antl/Senl。并在 GenBank 中通過 Blast 比對，保證了引物的特異性。引物序列見表1。
[0031] 表1 一步法PCR同時檢測CYVCV和(XDaV所用引物序列
【主權(quán)項】
1. 一種同時檢測CYVCV和CXDaV的一步法PCR檢測引物對，其特征在于：包括CYVCV檢 測引物對：CYVCV-4f/CYVCV-4r ;CCDaV檢測引物對：CCDV-2f/CCDV-2r ;COX基因檢測引物 對：Antl/Senl ;所述引物對的序列如下： CYVCV-4f :5' -ATTACAGTGGTAGGGAGGAG-3'， CYVCV-4r :5' -CCCAGCAGGACGAGTTAG-3'， CCDV-2f :5' -ACAAGACTATCATAGCACGAGACG-3'， CCDV-2r :5' -TTTGAACTGTTTAAGTCCATCCC-3'， Antl :5' -CAATATCATTGATGTCCAATACT-3'， Senl :5' -ATTTATGTAATGGATTTAAGACCC-3'。
2. -種同時檢測CYVCV和CXDaV的一步法PCR檢測試劑盒，其特征在于：主要包括權(quán) 利要求1中所述引物對以及PCR反應(yīng)試劑。
3. -種同時檢測CYVCV和CXDaV的一步法PCR檢測方法，其特征在于：所述方法包括 如下步驟： (1) 提取柑橘待測樣品的總核酸； (2) 將提取到的總核酸進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增所用引物為權(quán)利要求1中所述引物 對 CYVCV-4f/CYVCV-4r，CCDV-2f/CCDV-2i和 Antl/Senl ; (3) 對步驟（2)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測是否含有CYVCVXCDaV和COX基因的擴(kuò)增片段， 從而判斷樣品是否感染CYVCV或(XDaV。
4. 如權(quán)利要求3所述的同時檢測CYVCV和CXDaV的一步法PCR檢測方法，其特征在于： 所述步驟（2)中PCR的反應(yīng)體系為：10 y M CYVCV引物CYVCV-4f/4r各0. 2 y L，10 y M CCDaV 引物〇〇^￥-2以21'各0.5 1^，10 1^內(nèi)參基因引物六拉1/56111各0.11^，5 1^2\18七印 buffer, 0. 4 y L PrimScript IStep Enzyme Mix，L 0 y L DEPC 水。
5. 如權(quán)利要求3或4所述的同時檢測CYVCV和CXDaV的一步法PCR檢測方法，其特征 在于：所述步驟（2)中 PCR 反應(yīng)條件為：50°C 30min，94°C 2min ;94°C 30sec，55°C 30sec， 72°C 45sec，循環(huán) 30 次。
6. 如權(quán)利要求5所述的同時檢測CYVCV和CCDaV的一步法PCR檢測方法，其特征在 于：所述步驟（2)中引物對CYVCV-4f/CYVCV-4r擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為1314bp，引物對 CCDV-2f/CCDV-2i擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為916bp，引物對Antl/Senl擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為 372bp〇
7. 如權(quán)利要求5所述的同時檢測CYVCV和CXDaV的一步法PCR檢測方法，其特征在于： 所述步驟（3)中對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測的方法為：將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 0-1. 5%瓊脂糖凝膠電 泳，觀察是否出現(xiàn)1314bp、916bp和372bp的條帶，如果同時出現(xiàn)1314bp和372bp的條帶， 說明樣品感染了 CYVCV ;如果同時出現(xiàn)916bp和372bp的條帶，說明樣品感染了 CCDaV ;如果 同時出現(xiàn)1314bp、916bp和372bp三條條帶，說明樣品同時感染了 CYVCV和CCDaV。
8. -種如權(quán)利要求1所述的同時檢測CYVCV和CCDaV的一步法PCR檢測引物對在柑橘 黃脈病和柑橘褪綠矮化病檢測中的應(yīng)用。
9. 一種如權(quán)利要求2所述的同時檢測CYVCV和CCDaV的一步法PCR檢測試劑盒在柑橘 黃脈病和柑橘褪綠矮化病檢測中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種同時檢測CYVCV和CCDaV的一步法PCR檢測引物對、試劑盒及方法。引物對包括CYVCV檢測引物對：CYVCV-4f/CYVCV--4r；CCDaV檢測引物對：CCDV-2f/CCDV-2r；COX基因檢測引物對：Ant1/Sen1。同時檢測CYVCV和CCDaV的一步法PCR檢測方法，包括步驟：(1)提取柑橘待測樣品的總核酸；(2)將提取到的總核酸進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增；(3)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測是否含有CYVCV、CCDaV和COX基因的擴(kuò)增片段，從而判斷樣品是否感染CYVCV或CCDaV。本發(fā)明方法檢測特異性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定性好，工序簡單，節(jié)約成本，適用于大規(guī)模推廣。
【IPC分類】C12Q1-68, C12R1-94, C12Q1-70, C12N15-11
【公開號】CN104745725
【申請?zhí)枴緾N201510103671
【發(fā)明人】周彥, 陳洪明, 王雪峰, 李中安, 周常勇
【申請人】西南大學(xué)柑桔研究所
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月10日