專利名稱：檢測植物感染番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA和組織印跡ELISA方法及其試劑盒及應(yīng)用的制作方法
檢測植物感染番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA和組織印跡 ELISA方法及其試劑盒及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明所屬的領(lǐng)域為植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其涉及番茄番茄黃化曲葉病毒的 dot-ELISA和組織印跡ELISA快速檢測方法及其檢測試劑盒的開發(fā)應(yīng)用。
背景技術(shù)：
番爺黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)導(dǎo)致番爺葉片上卷或下卷、葉片黃化、葉脈外突、植株矮化，嚴(yán)重時致番茄絕收。據(jù)報道，導(dǎo)致我國番茄黃化曲葉病的病原有15種，其中在我國發(fā)生面積最廣、危害最重的是番茄黃化曲葉病毒。番茄黃化曲葉病毒屬于雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬(ifegoffiori/YAs)病毒, 該屬病毒在自然條件下只能由煙粉風(fēng)tabaci)以持久性方式傳播。
自2006年上海和浙江先后在番茄上發(fā)現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒以來，該病毒引起的番茄曲葉病在華東地區(qū)迅速蔓延開來，在北京、山東、江蘇、安徽、浙江、海南、福建、云南、廣東、廣西、新疆等多個省份的番茄上流行爆發(fā)。由于全球氣候變暖和農(nóng)業(yè)發(fā)展格局的變化， 特別是苗木調(diào)運等商業(yè)活動的日益頻繁，使得番茄黃化曲葉病害在我國自南向北迅速擴(kuò)散和蔓延開來，對番茄生產(chǎn)構(gòu)成巨大威脅。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國番茄黃化曲葉病毒病害的年發(fā)生面積超過100萬畝，年經(jīng)濟(jì)損失至少20億人民幣。目前該病害已經(jīng)成為我國番茄生產(chǎn)上一個重要的制約因素。
由于番茄黃化曲葉病毒病害在我國的發(fā)生處于上升時期、暴發(fā)態(tài)勢嚴(yán)峻，因此強(qiáng)化番茄黃化曲葉病毒的早期監(jiān)測和預(yù)警技術(shù)非常緊迫。但是由于番茄黃化曲葉病毒只存在于植物韌皮部，且感病植物中病毒的含量較低，致使常規(guī)的病毒病檢測辦法難以應(yīng)用。目前，番茄黃化曲葉病毒的檢測技術(shù)主要依賴PCR擴(kuò)增、核酸雜交和血清學(xué)等手段。PCR檢測技術(shù)雖然靈敏性高，但需要經(jīng)過基因組DNA提取——PCR擴(kuò)增——電泳分析、甚至基因組序列測定這些步驟，實驗操作過程繁瑣、耗時長、且該技術(shù)完全依賴于PCR儀器和商業(yè)化的試劑而致試驗成本較高，不利于田間病毒病的大規(guī)模檢測。另外PCR技術(shù)因假陽性高等原因也不易向非專業(yè)人員推廣。核酸雜交技術(shù)雖特異性強(qiáng)，但實驗操作更為專業(yè)和繁瑣，除高度依賴儀器外對試劑也有很高要求。傳統(tǒng)使用的放射性同位素雖然靈敏性高，但該試劑對人體和環(huán)境均具有一定的危害，不利于環(huán)保。最近推出的替代性產(chǎn)品如地高辛試劑等雖無放射性污染但價格昂貴，從經(jīng)濟(jì)性和實用性的角度使得核酸雜交技術(shù)難以應(yīng)用于田間大量病毒樣品的檢測。以單克隆抗體為核心建立的血清學(xué)檢測技術(shù)是較為簡便的檢測方法，它具有操作方便、靈敏度高等優(yōu)點，但傳統(tǒng)血清學(xué)方法如三抗體夾心ELISA(TAS-ELISA)、抗原包被ELISA (ACP-ELISA)等方法需要在48孔或96孔酶聯(lián)反應(yīng)板進(jìn)行，實驗步驟多，各步驟反應(yīng)時間長，數(shù)據(jù)借助酶標(biāo)儀器讀值，且對儀器依賴性高，實驗材料成本高等特點不利于大規(guī)模樣品的檢測。本課題組原先申請的專利“分泌抗番茄黃化曲葉病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用”(中國專利申請?zhí)枮?01210004197. 7)中，其實施例已簡要提及dot-ELISA和 Tissue-blot ELISA檢測方法，但利用該方法在實際使用時發(fā)現(xiàn)，該方法只適合在一種植物(即番茄葉片)中檢測病毒，不適合其他植物；另外，由于植物取樣部位和試劑配比的問題致使病毒檢出率有待提高。特別是實施例中提及的Tissue-blot ELISA試劑盒，在田間應(yīng)用時番茄葉片消耗多、試劑用量大、成本較高。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，在進(jìn)一步優(yōu)化各實驗數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，提供檢測植物感染番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA和組織印跡ELISA方法及其試劑盒及應(yīng)用。
檢測植物感染番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA快速鑒定方法，包括如下步驟1)硝酸纖維素(NC)膜準(zhǔn)備用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每格規(guī)格1X1 Cm，在NC膜的一角做標(biāo)記，平整放入培養(yǎng)皿中央；2)植物樣品處理按重量體積比I:30至I: 50 (克/毫升)比例稱取植物莖干，加入O.01 mo I/L PBS將植物組織研磨成勻漿狀；3)點樣用移液槍吸取2ul植物上清液點到劃好的格子中央；4)封閉點樣后，將NC膜靜置晾干10分鐘，使用按5g脫脂奶粉加100 mL PBST緩沖液(含O. 05% Tween-20的O. 01 mo I/L PBS)的比例配制得至Ij 5%的脫脂奶粉封閉，37 °C靜置0.5-1小時；5)加一抗加入中國專利申請?zhí)枮?01210004197.7的番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體，該單克隆抗體用5%的脫脂奶粉1: 2000倍稀釋，37°C孵育I小時；6)洗滌棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動洗脫3次，每次3分鐘；7)加酶標(biāo)二抗棄洗脫液，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，二抗用5%的脫脂奶粉1: 8000倍稀釋，37°C孵育I小時；8)洗滌棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動洗脫5飛次，每次5分鐘；9)顯色顯色底物NBT66 ul和BCIP 33 ul (S3771 Promega)加到10 ml底物緩沖液中混勻，洗好的NC膜用濾紙吸干后放入底物顯色液中反應(yīng)10分鐘；10)終止反應(yīng)待NC膜上的樣品呈現(xiàn)紫色而陰性對照未顯色時棄顯色液終止反應(yīng)；11)記錄結(jié)果ddH2O浸泡NC I吳，晚干后記錄結(jié)果。
檢測植物感染番茄黃化曲葉病毒的組織印跡ELISA快速檢測方法，包括如下步驟1)NC膜準(zhǔn)備用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每格規(guī)格1X1 cm，在NC膜的一角做標(biāo)記，平整放入培養(yǎng)皿中央；2)植物樣品處理和點樣用刀片切割植物葉柄，使切口平齊，將切口截面按置于劃好的格子中央3飛秒，每個植物樣品重復(fù)上述操作步驟一次；操作過程中，每切割一個植物樣品更換一次刀片或用酒精棉消毒刀片；3)封閉點樣后，將NC膜靜置晾干10分鐘，使用按5g脫脂奶粉加100 mL PBST緩沖液(含O. 05% Tween-20的O. 01 mo I/L PBS)的比例配制得至Ij 5%的脫脂奶粉封閉，37 °C靜置0.5-1小時；4)加一抗加入中國專利申請?zhí)枮?01210004197.7的番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體，單克隆抗體用5%的脫脂奶粉1: 2000倍稀釋，37°C孵育I小時；5)洗滌棄液體，NC膜用PBST搖動洗脫3次，每次3分鐘；CN 102928598 A書明說3/8頁7)加酶標(biāo)二抗棄洗脫液，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，二抗用5%的脫脂奶粉1:8000倍稀釋，37 °C孵育I小時；8)洗滌棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動洗脫5飛次，每次5分鐘；9)顯色顯色底物NBT66 ul和BCIP 33 ul (S3771 Promega)加到10 ml底物緩沖液中混勻，洗好的膜用濾紙吸干后放入底物顯色液中反應(yīng)10分鐘；10)終止反應(yīng)待NC膜上的樣品呈現(xiàn)紫色而陰性對照未顯色時棄顯色液終止反應(yīng)；11)記錄結(jié)果ddH2O浸泡NC I吳，晚干后記錄結(jié)果。
番茄黃化曲葉病毒dot-ELISA和組織印跡ELISA檢測試劑盒，包括如下步驟1)試劑盒主要試劑與材料20X 濃縮 PBS (O. 2 mol/L PBS)10 ml單克隆抗體O. I mlAP標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗O. 02 mlIOX濃縮封閉液10 mlIOX濃縮抗體稀釋液20 ml20 X濃縮洗滌液70 ml封閉劑15 g底物緩沖液70 mlNC膜7張NBT儲備液O. 4 mlBCIP儲備液O. 2 ml2)試劑盒操作步驟組織印跡ELISA步驟2.I)取番茄莖干或葉柄，用刀片橫切，將橫切面立即在膜上壓印3-5秒。轉(zhuǎn)步驟2. 4。
dot-ELISA 步驟2. I)番茄莖干稱重后，按重量體積比I: 30-1: 50 (克/毫升)加入O. 01 mol/L PBS 研磨；2. 2) 5000 rpm 離心 3 分鐘；2. 3)取2 ul上清點到NC膜上；2. 4)室溫干燥10分鐘；2. 5) NC膜浸入到含5%封閉劑的I X封閉液中室溫封閉30-60分鐘；2.6) NC膜放入用I X抗體稀釋液1: 2000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60分鐘； 2.7) IX洗滌液洗膜3-4次，每次3分鐘；2.8) NC膜放入用I X抗體稀釋液1: 8000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30-60分鐘；2.9) IX洗滌液洗膜5-6次，每次3分鐘；2. 10)顯色底物 NBT 66 ul 和 BCIP 33 ul (S3771 Promega)加到 10 ml 底物緩沖液中混勻，洗好的膜用濾紙吸干后放入底物顯色液中反應(yīng)，待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時終止反應(yīng)(顯色5-20分鐘)，即在自來水中漂洗一下，肉眼觀察并記錄結(jié)果。
3)試劑盒使用注意事項73. 1)NC膜位于2張保護(hù)紙中間，不要用手直接觸摸NC膜；3. 2) NC膜上滴加檢測樣品的一面為正面，整個實驗過程中應(yīng)朝上；3. 3)抗體在使用前10分鐘內(nèi)稀釋；3. 4)底物顯色液要現(xiàn)配現(xiàn)用；3. 5) NC膜CK+處為陽性對照；NC膜CK-處為陰性對照；3.6)試劑盒反應(yīng)溫度為4-38°C，最佳反應(yīng)溫度為37°C ；3.7)試劑盒能檢測200個田間樣品。
4)貯藏條件及保存期試劑盒于2-8°C避光保存，但抗體-20°C冷凍保存更佳，NBT儲備液和BCIP儲備液須-20°C冷凍保存。保存期該產(chǎn)品有效期為6個月。
所述的方法適用于番爺黃化曲葉病毒的寄主-爺科植物，所述的爺科植物包括番茄、辣椒、茄子、煙草、龍葵、曼陀羅，取樣部位為植物的莖干或葉柄。
所述的方法可對田間大量樣品的帶毒情況進(jìn)行調(diào)查，計算番茄黃化曲葉病毒在田間的侵染率，評估番茄黃化曲葉病的田間發(fā)生分布及流行爆發(fā)趨勢以便及時采取防治措施。
本發(fā)明有益效果O本發(fā)明提供了兩種快速檢測植物感染番茄黃化曲葉病毒的血清學(xué)方法—— dot-ELISA和組織印跡ELISA鑒定方法。
2)本發(fā)明提供的檢測方法適用性廣。番茄黃化曲葉病毒大多感染茄科植物，而本發(fā)明提供的檢測方法能有效應(yīng)用于番茄、辣椒、茄子、煙草、龍葵、曼陀羅等多種茄科植物， 擴(kuò)大了植物的檢測范圍。
3)針對番爺黃化曲葉病毒只存在于植物韌皮部,且植株中病毒含量低的特點，經(jīng)過多次嚴(yán)格對比驗證，本發(fā)明提出取樣部位為番茄黃化曲葉病毒積累量高的植物莖干或葉柄。植株取樣部位的改變提高了檢測的靈敏性。
4)本發(fā)明提供的檢測試劑盒中的各種試劑的濃度和參數(shù)配比是經(jīng)上百次獨立實驗精細(xì)調(diào)試優(yōu)化所得。比如降低了植物組織的取樣量，減小對植物的損傷以保護(hù)農(nóng)民的最大經(jīng)濟(jì)效益；提高了單克隆抗體的使用濃度，優(yōu)化了試劑的參數(shù)配比等，在節(jié)約成本的基礎(chǔ)上實現(xiàn)病毒檢出率最高。各項指標(biāo)綜合運用能達(dá)到檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，耗時短，成本低，而且具有整個操作簡單快速，對專業(yè)技能要求低，實驗過程不需要儀器，實驗材料易于攜帶，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，實用性強(qiáng)等優(yōu)勢。一個人只需3-4小時可完成幾百份植物樣品的檢測，利于田間大規(guī)模的推廣和應(yīng)用。


圖1-3 dot-ELISA 磨樣示意圖；圖4 dot-ELISA方法檢測田間番茄樣品的結(jié)果；圖5-6組織印跡ELISA操作示意圖；圖7組織印跡ELISA方法檢測田間番茄樣品的結(jié)果；圖8田間番茄樣品經(jīng)PCR驗證結(jié)果；圖9番茄黃化曲葉病毒(TYLCV) dot-ELISA和組織印跡ELISA檢測試劑盒外包裝；圖10番茄黃化曲葉病毒(TYLCV) dot-ELISA和組織印跡ELISA檢測試劑盒的材料與試劑；圖11利用試劑盒中的dot-ELISA方法檢測杭州番茄樣品的結(jié)果；圖12利用試劑盒中的組織印跡ELISA方法檢測杭州番茄樣品的結(jié)果。
具體實施方式
實施例一利用dot-ELISA的方法檢測田間番爺植株中番爺黃化曲葉病毒的侵染情況。
從河南鄭州農(nóng)田采集具有發(fā)病癥狀的番茄14株，按照dot-ELISA的操作方法進(jìn)行檢測1)NC膜準(zhǔn)備用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每孔規(guī)格I X I cm，在NC膜的右下角做標(biāo)記，平整放入培養(yǎng)皿中央；2)樣品處理按I:50 (重量體積，克/暈升)的比例稱取番爺葉柄，加入O. 01 mol/ L PBS將番茄組織研磨成勻漿狀(圖1-3)；3)點樣離心后用移液槍吸取2ul上清點到劃好的格子中央；4)封閉點樣后，將NC膜靜置晾干10分鐘，加入5%的脫脂奶粉(按5g脫脂奶粉加 100 ml PBST 緩沖液(含 0. 05% Tween-20 的 0. 01 mol/L PBS)的比例配制)封閉，37°C靜置30分鐘；5)加一抗加入番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體，單克隆抗體用5%的脫脂奶粉I: 2000倍稀釋，37°C孵育I小時；6)洗滌棄液體，NC膜用PBST搖動洗脫3次，每次3分鐘；7)加酶標(biāo)二抗棄洗脫液，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(A3562 Sigma)，二抗用5%的脫脂奶粉1: 8000倍稀釋，37°C孵育I小時；8)洗滌棄液體，NC膜用PBST搖動洗脫5次，每次5分鐘；9)顯色顯色底物NBT66 ul和BCIP 33 ul (S3771 Promega)加到10 ml底物緩沖液(0. I mol/L Tris C1、0. I mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、pH9. 5)中混勻，洗好的 NC 膜用濾紙吸干后放入底物顯色液中反應(yīng)10分鐘；10)終止反應(yīng)待陽性對照呈現(xiàn)紫色而陰性對照未顯色時棄顯色液終止反應(yīng)；11)記錄結(jié)果ddH2O浸泡NC I吳，晚干后記錄結(jié)果。
實驗結(jié)果如圖4所示，14株番茄樣品的陽性率為100% (C7、D7為陽性對照，C8、D8 為陰性對照)，表明番茄黃化曲葉病毒在該地區(qū)較為普遍，發(fā)病較為嚴(yán)重。
實施例二 利用組織印跡ELISA的方法檢測田間番茄植株中番茄黃化曲葉病毒的侵染情況。
從河南鄭州農(nóng)田采集具有發(fā)病癥狀的番茄14株，按照組織印跡ELISA的操作方法再次進(jìn)行檢測1)NC準(zhǔn)備用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每孔規(guī)格IXI cm, 在NC膜的右下角做標(biāo)記，平整放入培養(yǎng)皿中央；2)點樣用刀片切割葉柄，使切口平齊(圖5)，將切口截面按置于劃好的格子中央Γ5 秒(圖6)，每個樣品重復(fù)一次(用同一刀片另切一次，重復(fù)上述操作步驟)，操作過程中，刀片每切割一個樣品用酒精棉擦拭一次；3)封閉點樣后，將NC膜靜置晾干10分鐘，加入5%的脫脂奶粉(按5g脫脂奶粉加 100 ml PBST緩沖液的比例配制)封閉，37°C靜置30分鐘；4)加一抗加入番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體，單克隆抗體用5%的脫脂奶粉I: 2000倍稀釋，37°C孵育I小時；5)洗滌棄液體，NC膜用PBST(含O. 05% Tween-20的O. 01 mol/L PBS)搖動洗脫3 次，每次3分鐘；7)加酶標(biāo)二抗棄洗脫液，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(A3562 Sigma)，二抗用5%的脫脂奶粉1: 8000倍稀釋，37°C孵育I小時；8)洗滌棄液體，NC膜用PBST搖動洗脫5次，每次5分鐘；9)顯色顯色底物NBT66 ul和BCIP 33 ul (S3771 Promega)加到10 ml底物緩沖液中(O. I mol/L Tris C1,0. I mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、ρΗ9· 5)混勻，洗好的膜用濾紙吸干后放入底物顯色液中反應(yīng)10分鐘；10)終止反應(yīng)待樣品呈現(xiàn)紫色而陰性對照未顯色時棄顯色液終止反應(yīng)；11)記錄結(jié)果ddH2O浸泡NC I吳，晚干后記錄結(jié)果。
檢測結(jié)果如圖7所示，樣品陽性率為100% (D5、D6為陽性對照，D7、D8為陰性對照)，同dot-ELISA檢測所得結(jié)果一致。另外，利用番茄黃化曲葉病毒的特異性引物PF (5，-GGCGCGCCCATGTCGAAGCGACCAG-3，)和 PR (5，-GTCGACTTAATTTGATATTGAATCATAGAAATAG-3，) 對該批次樣品進(jìn)行PCR驗證，14個樣品都擴(kuò)增出約750 bp的目的條帶(圖8)，PCR實驗數(shù)據(jù)證實這14個田間樣品都攜帶番茄黃化曲葉病毒。這表明兩種血清學(xué)快速檢測方法是準(zhǔn)確、靈敏、可靠的，適用于田間大批量樣品檢測的推廣應(yīng)用。
實施例三番茄黃化曲葉病毒dot-ELISA和組織印跡ELISA檢測試劑盒的開發(fā)I.試驗原理dot-ELISA和組織印跡ELISA是以NC膜為固相載體的ELISA檢測方法，具有簡便、快速、特異、敏感、便于推廣、不需特殊儀器等優(yōu)點，應(yīng)用前景廣。將含番茄黃化曲葉病毒樣品的提取液點到或壓印到NC膜上，干燥形成固相抗原；加入抗番茄黃化曲葉病毒的鼠單抗， 則單抗與固相抗原(番茄黃化曲葉病毒)形成抗原_抗體復(fù)合物；再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的抗鼠IgG抗抗體(即二抗)，則抗抗體與上述抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合形成抗原_抗體_酶標(biāo)抗抗體復(fù)合物；加入顯色底物，復(fù)合物上的酶催化底物生成沉淀型有色產(chǎn)物而顯色。由于每步之間均有洗滌的步驟，若待測樣品中不含番茄黃化曲葉病毒則酶標(biāo)抗體將被洗掉，底物不顯色而呈陰性反應(yīng)。肉眼觀察斑點顏色有無及深淺來進(jìn)行樣品中番茄黃化曲葉病毒的定性和半定量檢測。
2.主要試劑與材料20X 濃縮 PBS (0. 2 mol/L PBS)10 mlTYLCV單克隆抗體0. I mlAP 標(biāo)記羊抗鼠 IgG 二抗(A3562 Sigma)0. 02 ml10X 濃縮封閉液(0. I mol/L PBST)10 ml10X濃縮抗體稀釋液(50%的脫脂奶粉、0. lmol/L PBST)20 ml20X 濃縮洗滌液(O. 2 mol/L PBST)70 ml封閉劑(脫脂奶粉)底物緩沖液(O. I mol/L Tris C1.0. 025 mol/L MgCl、pH9.5) NC 膜(Amersham)以上試劑均保存于4°C下 NBT 儲備液(S377I Promega)BCIP 儲備液(S377I Promega)O. 4 ml O. 2 ml以上試劑均保存于-20°C下3.操作步驟組織印跡ELISA步驟I)取番茄莖干或葉柄，用刀片橫切，將橫切面立即在膜上壓印3-5秒，其中葉片需緊卷成筒后用刀片橫切。轉(zhuǎn)步驟4)。
dot-ELISA 步驟1)番爺莖干或葉片稱重后，按1:30-1:50(重量體積，克/暈升)加入O. 01 mol/L PBS 研磨；2)5000 rpm 離心 3 min;3)取2ul上清點到NC膜上；4)室溫干燥10min;5)NC膜浸入到含5%封閉劑的封閉液中室溫封閉30-60 min;6)NC膜放入用抗體稀釋液1: 2000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min;7)洗滌液洗膜3-4次，每次3min;8)NC膜放入用抗體稀釋液1: 8000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育 30-60 min;9)洗滌液洗膜5-6次，每次3min;10)顯色底物NBT66 ul和BCIP 33 ul加到10 ml底物緩沖液中混勻，洗好的膜用濾紙吸干后放入底物顯色液中反應(yīng)，待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時終止反應(yīng) (顯色5-20 min),即在自來水中漂洗一下，肉眼觀察結(jié)果，并記錄結(jié)果。
4.緩沖液配比1)0.01 mol/L PBS :用去離子水將20X濃縮PBS按I :19體積比進(jìn)行稀釋(S卩I份20X 濃縮PBS+19份去離子水或礦泉水)。
2)含5%封閉劑的封閉液用去離子水將10X濃縮封閉液按I :9體積比進(jìn)行稀釋 (I份10X濃縮封閉液+9份去離子水)，稀釋后按每20 ml稀釋封閉液加入Ig封閉劑配制成含5%封閉劑的封閉液，配制好的封閉液在4°C冰箱可保存一個月。
3)洗滌液用去離子水將20X濃縮洗滌液按I :19體積比進(jìn)行稀釋(或按需量稀釋)(I份20X濃縮洗滌液+19份去離子水)，稀釋后的洗滌液在4°C環(huán)境可保存一個月。
4)抗體稀釋液用去離子水將10X抗體稀釋液按I :9體積比進(jìn)行稀釋(I份10X 抗體稀釋液+9份去離子水)，稀釋后按每20 ml稀釋液加入Ig封閉劑配制成抗體稀釋液。 配制好的抗體稀釋液在4°C冰箱可保存一個月。
5)底物顯色液66 uL NBT和33 uL BCIP加到10 mL的底物緩沖液混勻。
5.注意事項111)NC膜位于2張保護(hù)紙中間，不要用手直接觸摸膜，用鑷子和戴一次性PE手套取膜；2)NC膜上滴加檢測樣品的一面為正面，整個實驗過程中應(yīng)朝上；3)抗體在使用前10min之內(nèi)稀釋；4)底物顯色液要現(xiàn)配現(xiàn)用；5)硝酸纖維素膜CK+處為陽性對照；硝酸纖維素膜CK-處為陰性對照；6)試劑盒反應(yīng)溫度為4-38°C，最佳反應(yīng)溫度為37°C；7)試劑盒能檢測200個田間樣品。
6.貯藏條件及保存期試劑盒于2-8°C避光保存，但抗體-20°C冷凍保存更佳，NBT儲備液和BCIP儲備液須-20°C冷凍保存。保存期該產(chǎn)品有效期為6個月。
實施例四番茄黃化曲葉病毒dot-ELISA和組織印跡ELISA檢測試劑盒測試用研發(fā)的植株檢測試劑盒(圖9和圖10)，分別通過dot-ELISA及組織印跡ELISA的方法對田間具有發(fā)病癥狀的植物樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果快速、可靠(圖11、12)，表明該植株檢測試劑盒可大批量使用。
權(quán)利要求
1.一種檢測植物感染番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA快速鑒定方法，其特征在于包括如下步驟1)硝酸纖維素(NC)膜準(zhǔn)備用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每格規(guī)格1X1 cm，在NC膜的一角做標(biāo)記，平整放入培養(yǎng)皿中央；2)植物樣品處理按重量體積比I:30至I: 50 (克/毫升)比例稱取植物莖干，加入O.01 mo I/L PBS將植物組織研磨成勻漿狀；3)點樣用移液槍吸取2ul植物上清液點到劃好的格子中央；4)封閉點樣后，將NC膜靜置晾干10分鐘，使用按5g脫脂奶粉加100 mL PBST緩沖液的比例配制得到5%的脫脂奶粉封閉，37°C靜置O. 5-1小時，所述的PBST緩沖液含O. 05%Tween-20 的 O. 01 mol/L PBS ；5)加一抗加入中國專利申請?zhí)枮?01210004197.7的番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體，該單克隆抗體用5%的脫脂奶粉1: 2000倍稀釋，37°C孵育I小時；6)洗滌棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動洗脫3次，每次3分鐘；7)加酶標(biāo)二抗棄洗脫液，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，二抗用5%的脫脂奶粉1: 8000倍稀釋，37°C孵育I小時；8)洗滌棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動洗脫5飛次，每次5分鐘；9)顯色顯色底物NBT66 ul和BCIP 33 ul加到10 ml底物緩沖液中混勻，洗好的NC膜用濾紙吸干后放入底物顯色液中反應(yīng)10分鐘；10)終止反應(yīng)待NC膜上的樣品呈現(xiàn)紫色而陰性對照未顯色時棄顯色液終止反應(yīng)；11)記錄結(jié)果ddH2O浸泡NC I吳，晚干后記錄結(jié)果。
2.一種檢測植物感染番茄黃化曲葉病毒的組織印跡ELISA快速檢測方法，其特征在于包括如下步驟1)NC膜準(zhǔn)備用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每格規(guī)格I X Icm，在NC膜的一角做標(biāo)記，平整放入培養(yǎng)皿中央；2)植物樣品處理和點樣用刀片切割植物葉柄，使切口平齊，將切口截面按置于劃好的格子中央3飛秒，每個植物樣品重復(fù)上述操作步驟一次；操作過程中，每切割一個植物樣品更換一次刀片或用酒精棉消毒刀片；3)封閉點樣后，將NC膜靜置晾干10分鐘，使用按5g脫脂奶粉加100 mL PBST緩沖液的比例配制得到5%的脫脂奶粉封閉，37°C靜置O. 5-1小時；所述的PBST緩沖液含O. 05%Tween-20 的 O. 01 mol/L PBS ；4)加一抗加入中國專利申請?zhí)枮?01210004197.7的番茄黃化曲葉病毒的單克隆抗體，單克隆抗體用5%的脫脂奶粉1: 2000倍稀釋，37°C孵育I小時；5)洗滌棄液體，NC膜用PBST搖動洗脫3次，每次3分鐘；7)加酶標(biāo)二抗棄洗脫液，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，二抗用5%的脫脂奶粉1:8000倍稀釋，37°C孵育I小時；8)洗滌棄液體，NC膜用PBST緩沖液搖動洗脫5飛次，每次5分鐘；9)顯色顯色底物NBT66 ul和BCIP 33 ul加到10 ml底物緩沖液中混勻，洗好的膜用濾紙吸干后放入底物顯色液中反應(yīng)10分鐘；10)終止反應(yīng) 待NC膜上的樣品呈現(xiàn)紫色而陰性對照未顯色時棄顯色液終止反應(yīng)；11)記錄結(jié)果ddH2 O浸泡NC I吳，晚干后記錄結(jié)果。
3. 一種番茄黃化曲葉病毒dot-ELISA和組織印跡ELISA檢測試劑盒，其特征在于包括如下步驟I)試劑盒試劑與材料20X 濃縮 PBS (O. 2 mol/L)10 ml單克隆抗體O. I mlAP標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗O. 02 mlIOX濃縮封閉液10 mlIOX濃縮抗體稀釋液20 ml20 X濃縮洗滌液70 ml封閉劑15 g底物緩沖液70 mlNC膜7張NBT儲備液0. 4 mlBCIP儲備液0. 2 ml2)試劑盒操作步驟 組織印跡ELISA步驟 2. I)取番茄莖干或葉柄，用刀片橫切，將橫切面立即在膜上壓印3-5秒；P'dot-ELISA 步驟 2. I)番爺莖干稱重后，按重量體積比1: 30-1:50 (克/毫升)加入0.01轉(zhuǎn)步驟2. 4研磨；2. 2) 5000 rpm 離心 3 分鐘；2. 3)取2 ul上清點到NC膜上；2. 4)室溫干燥10分鐘；2. 5) NC膜浸入到含5%封閉劑的I X封閉液中室溫封閉30-60分鐘；2. 6) NC膜放入用I X抗體稀釋液1: 2000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60分鐘；2.7) IX洗滌液洗膜3-4次，每次3分鐘；2.8) NC膜放入用I X抗體稀釋液1: 8000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30-60分鐘；2.9) IX洗滌液洗膜5-6次，每次3分鐘；2.10)顯色底物NBT 66 ul和BCIP 33 ul加到10 ml底物緩沖液中混勻，洗好的膜用濾紙吸干后放入底物顯色液中反應(yīng)，待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時終止反應(yīng)，顯色時間5-20分鐘，即在自來水中漂洗一下，肉眼觀察并記錄結(jié)果；3)試劑盒使用注意事項3.1)NC膜位于2張保護(hù)紙中間，不要用手直接觸摸NC膜；3.2) NC膜上滴加檢測樣品的一面為正面，整個實驗過程中應(yīng)朝上；3.3)抗體在使用前10分鐘內(nèi)稀釋；3.4)底物顯色液要現(xiàn)配現(xiàn)用；3.5) NC膜CK+處為陽性對照；NC膜CK-處為陰性對照；.3.6)試劑盒最佳反應(yīng)溫度為37°C ；.3.7)試劑盒能檢測200個田間樣品；4)貯藏條件及保存期試劑盒于2-8°C避光保存，但其中抗體_20°C冷凍或2-8°C保存，NBT儲備液和BCIP儲備液須_20°C冷凍保存；保存期該試劑盒有效期為6個月。
4.一種如權(quán)利要求1、2、3任一項所述的方法或試劑盒的應(yīng)用，其特征在于所述的方法適用于番茄黃化曲葉病毒的寄主——茄科植物，所述的茄科植物包括番茄、辣椒、茄子、煙草、龍葵、曼陀羅，取樣部位為植物的莖干或葉柄。
5.一種如權(quán)利要求1、2、3任一項所述的方法或試劑盒的應(yīng)用，其特征在于所述的方法可對田間大量樣品的帶毒情況進(jìn)行調(diào)查，計算番茄黃化曲葉病毒在田間的侵染率，評估番茄黃化曲葉病的田間發(fā)生分布及流行爆發(fā)趨勢以便及時采取防治措施。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測植物感染番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA和組織印跡ELISA方法及其試劑盒及應(yīng)用。利用針對番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白制備的單克隆抗體，建立配比最優(yōu)化的斑點酶聯(lián)免疫吸附法(dotenzyme-linkedimmunosorbentassay，dot-ELISA)及組織印記ELISA的方法，并研發(fā)快速檢測試劑盒。該發(fā)明適用于番茄、辣椒、茄子、煙草、龍葵、曼陀羅等茄科植物。利用該發(fā)明可對田間蔬菜樣品番茄黃化曲葉病毒感染情況進(jìn)行調(diào)查，檢測病毒病的發(fā)病率，評估番茄黃化曲葉病毒在田間的發(fā)生分布情況及流行爆發(fā)趨勢。該檢測方法靈敏度高、特異性好、耗時短、成本低，為番茄黃化曲葉病毒的快速、大規(guī)模檢測提供技術(shù)支撐。
文檔編號G01N33/577GK102928598SQ20121042622
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月30日
發(fā)明者謝艷, 周雪平, 吳建祥, 矯曉陽, 倪躍群 申請人:浙江大學(xué)