專利名稱：抗番茄花葉病毒基因及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及番茄抗病基因工程技術(shù)的改進(jìn)，具體講是一種抗番茄花葉病毒基因及其分離方法。本發(fā)明通過改進(jìn)的DNA重組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3從番茄(Lycopersicon esculentum Miller)組織培養(yǎng)苗Y-3中分離出來，其屬于植物抗病蛋白的利用、基因性狀的改良和作物優(yōu)良品種的培育技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，栽培番茄(L.esculentum.Mill)的雜交育種經(jīng)過幾十年的基因重組和后代選擇已經(jīng)得到了比較充分的利用，然而許多有利用價(jià)值的農(nóng)藝性狀，例如抗病、抗蟲、耐儲(chǔ)藏以及雄性不育等性狀，多來源于栽培番茄的近緣野生種，如，智利番茄(L.chilence)、秘魯番茄(L.peruvianum)、多毛番茄(L.hirsutum)等，是通過傳統(tǒng)雜交育種的方法進(jìn)行優(yōu)良基因性狀的改良。這就存在著群體大、篩選任務(wù)重、世代分離長(zhǎng)、后代性狀不穩(wěn)定的問題，使得新品種的選育滿足不了品種更新和生產(chǎn)發(fā)展要求的問題。特別是對(duì)于那些由多基因控制的農(nóng)藝性狀，以及那些由基因突變產(chǎn)生的抗性性狀，就更加突出，其影響了野生資源的利用和番茄品種的改良。根據(jù)有關(guān)調(diào)查，葉霉病和病毒病是當(dāng)前農(nóng)用大棚栽培番茄的主要病害，每年的發(fā)病都會(huì)造成約20％左右的產(chǎn)量損失。因此，通過生物技術(shù)手段和基因工程的方法，首先從野生種質(zhì)資源中分離和克隆這些基因，然后再向優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的番茄品種中引進(jìn)分離的抗病基因是解決上述問題的唯一途徑。這就是本發(fā)明的所要研究解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，應(yīng)用現(xiàn)代的分子生物學(xué)技術(shù)，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)和DNA重組技術(shù)，實(shí)現(xiàn)番茄抗病基因的準(zhǔn)確、快速、有效地分離、克隆和重組，在目標(biāo)基因首先在原核中生物體中表達(dá)驗(yàn)證以及核苷酸序列比較的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建植物基因表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因在植物體中的表達(dá)，為番茄基因資源的利用、目標(biāo)性狀的分子育種奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明要設(shè)計(jì)一種番茄抗病基因的快速分離方法，其應(yīng)用DNA重組技術(shù)和分子生物學(xué)方法，使得野生番茄種質(zhì)資源的抗病基因快速分離，為用于番茄等茄科植物的功能基因的分離以及優(yōu)良品種的培育提供實(shí)踐基礎(chǔ)。
本發(fā)明的目的是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，研制了一種抗番茄花葉病毒基因。該基因即為PCR擴(kuò)增片斷NR11/Y-3，該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3是從番茄(Lycopersicon esculentumMiller)組織培養(yǎng)苗Y-3中分離的；該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3的核苷酸序列為SEQ NO.1所示的708-3293nt之間的片斷，其長(zhǎng)度從ATG到TGA為2586nt，其分子量為98.539KDa；其與AF536201，即Tm-22基因有99.85％的同源性；該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3在1100，1122，1147和1904位點(diǎn)處分別有G，G，C，G堿基的突變；該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3是一個(gè)與Tm-22類似的基因開放閱讀框。
所述的該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3，當(dāng)其插入到克隆載體pBS-T中時(shí)，獲得了含有擴(kuò)增片斷NR11/Y-3的重組DNA質(zhì)粒pBS-T(NR11/Y-3)，該質(zhì)粒pBS-T(NR11/Y-3)擁有功能相關(guān)的基因編碼區(qū)、轉(zhuǎn)錄起始區(qū)以及結(jié)合位點(diǎn)，他們的名稱及其功能分別是(1)f1(+)單鏈DNA復(fù)制區(qū)(134-411)；(2)半乳糖苷酶LacZ基因編碼區(qū)(460-3401)；
(3)M13+(-47)引物結(jié)合位點(diǎn)(577-594)；(4)T7啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)(626-644)；(5)T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(643)；(6)用于擴(kuò)增基因插入的多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)(653-3345)；(7)目標(biāo)基因的擴(kuò)增片斷NR11/Y-3的核苷酸序列(708-3293)；(8)編碼的半乳糖苷酶LacZ基因啟動(dòng)子區(qū)(3402-3523)；(9)pUC復(fù)制啟動(dòng)子區(qū)(3743-4410)；(10)Ampicillin抗性基因編碼區(qū)(4561-5418)。
一種含有抗番茄花葉病毒基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3的質(zhì)粒載體。該載體位于大腸桿菌菌株pBS-T(NR11/Y-3)D中，其菌種保藏號(hào)CCTCC NOM205011，菌種保藏日為2005年1月24日；其質(zhì)粒含有從番茄組織培養(yǎng)苗Y-3中分離的一個(gè)抗番茄花葉病毒基因的擴(kuò)增片斷NR11/Y-3。
一種抗番茄花葉病毒基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3的編碼蛋白。該編碼蛋白與AF536201，即Tm-22基因的編碼蛋白有99.85％的同源性；其氨基酸序列在374和382位點(diǎn)處分別存在甘氨酸和丙氨酸兩個(gè)氨基酸的變異；這種變異不同于已有的AF536201，即Tm-22基因的編碼蛋白；從ATG到TGA編碼有681個(gè)氨基酸；該編碼蛋白是一個(gè)具有抗番茄花葉病毒病功能的受體蛋白激酶。
一種含有抗番茄花葉病毒基因的分離方法。采用以下分離步驟1)提取高純度番茄基因組DNA；2)PCR擴(kuò)增常規(guī)PCR擴(kuò)增技術(shù)，其中，引物長(zhǎng)度在30-40bp之間，變性溫度為95℃；3)擴(kuò)增的目標(biāo)基因插入pBS-T克隆載體上。
所述的1)步中，高純度番茄基因組DNA的提取方法是(1)取番茄Y-3的組織培養(yǎng)苗幼嫩葉片放入1.5ml的離心管中，浸入液氮，用牙簽搗碎；(2)加入細(xì)胞裂解液，65℃溫育20分鐘；(3)加入600μl氯仿，混勻，12,000rpm離心2分鐘，取上清，加入600μl氯仿∶苯酚∶異戊醇，混勻，12,000rpm離心2分鐘，取上清，加入到1ml-20℃的異丙醇中，沉淀20分鐘；(4)12,000rpm離心5分鐘，去上清，沉淀加入70％乙醇600μl，洗兩遍；沉淀用50-100μl的、pH8.0的含有0.01mol/L Tris.HCl，0.01mol/L EDTA的TE緩沖液溶解；(5)加入RNA酶3-5μl，降解RNA，得到高純度的核基因組DNA。
所述的細(xì)胞裂解液，其組分為pH8.0的0.1mol/L Tris-HCl；2.8-3.3％，CTAB，w/v；0.02mol/L EDTA；1.4mol/LNaCl；1.8-2.5％PVP，v/v。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1)應(yīng)用簡(jiǎn)捷的、高純度番茄基因組DNA提取方法；2)采用DNAman軟件編程設(shè)計(jì)特異性目標(biāo)基因片段的引物；3)采用LA Taq酶進(jìn)行目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增；4)目標(biāo)基因在pBS-T載體上的克隆；5)目標(biāo)基因測(cè)序和同源性比對(duì)驗(yàn)證；6)獲得番茄目標(biāo)抗性基因。
本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)一是從番茄的組織培養(yǎng)苗中分離抗病基因，特別適應(yīng)于分離單一抗病基因；二是所分離的抗病基因與目標(biāo)基因相比同源性高、準(zhǔn)確性高，目標(biāo)基因的應(yīng)用簡(jiǎn)捷快速，三是擴(kuò)增的基因片段突變率低，分離的抗病基因與目標(biāo)基因的核苷酸序列的堿基差異低于0.15％，不影響擴(kuò)增基因的完整表達(dá)；四是方法簡(jiǎn)捷，省時(shí)省力，易于操作，從分離純化基因組DNA到完成基因的克隆只有兩天的時(shí)間，只要擁有分子生物學(xué)基本技術(shù)和方法的人都會(huì)加以操作和應(yīng)用；五是該基因克隆的方法是與轉(zhuǎn)基因技術(shù)相結(jié)合。
附圖及其說明

圖1為目標(biāo)基因克隆pBS-T(NR11/Y-3)質(zhì)粒DNA的核苷酸序列表SEQ NO.1。
圖2為目標(biāo)基因擴(kuò)增片段NR11/Y-3與Tm-22基因(AF536201)的核苷酸序列比較圖譜。
圖中，NR11/Y-3核苷酸序列在1100，1122，1147和1904位點(diǎn)處分別有G，G，C，G堿基的突變而不同于AF536201的Tm-22基因相同位點(diǎn)的A，T，G，A；與AF536201(Tm-22基因)同源性高達(dá)99.85％，分子量為98.539Kda，是一個(gè)抗病毒病的Tm-22-like基因。
圖3為目標(biāo)基因擴(kuò)增片段NR11/Y-3的編碼蛋白與Tm-22基因(AF536201)編碼蛋白的氨基酸序列比較圖譜。
圖中，目標(biāo)基因擴(kuò)增片段NR11/Y-3的編碼蛋白與Tm-22基因(AF536201)編碼蛋白的同源性高達(dá)99.77％，其氨基酸序列在374和382位點(diǎn)處分別由G(甘氨酸)和A(丙氨酸)兩個(gè)氨基酸的變異，相同位點(diǎn)的AF536201的編碼蛋白為W(色氨酸)和G(甘氨酸)。這說明目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增片段NR11/Y-3是一個(gè)來源于番茄組織培養(yǎng)突變體的植株苗，該突變體的PCR擴(kuò)增片段是一個(gè)抗病基因——Tm-22-like基因，其編碼蛋白是一個(gè)具有抗番茄花葉病毒病功能的受體蛋白激酶。
圖4為目標(biāo)基因克隆載體pBS-T(NR11/Y-3)組成示意圖。
所示圖中有 表示f1(+)單鏈DNA復(fù)制區(qū)(134-411)； 表示半乳糖苷酶LacZ基因編碼區(qū)(460-3401)； 表示M13+(-47)引物結(jié)合位點(diǎn)(577-594)； 表示T7啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)(626-644)； 表示T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(643)； 表示用于擴(kuò)增基因插入的多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)(653-3345)；表示目標(biāo)基因NR11/Y-3的全基因序列(708-3293)； 表示編碼的半乳糖苷酶LacZ基因啟動(dòng)子區(qū)(3402-3523)； 表示pUC復(fù)制啟動(dòng)子區(qū)(3743-4410)；表示Ampicillin抗性基因編碼區(qū)(4561-5418)。
圖5為番茄目標(biāo)基因分離技術(shù)路線流程示意圖。
參見圖示，取番茄幼嫩葉片1切碎放入1.5ml的離心管2中，浸入液氮3，用牙簽4搗碎，加入細(xì)胞裂解液5，溫育、分離、沉淀得到高純度的核基因組DNA 6。取1μl核基因組DNA，加入1μl的擴(kuò)增引物、LA Taq酶、Buffer、dNTP、無離子水等在PCR儀器7中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在瓊脂糖凝膠電泳8中回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物9，擴(kuò)增產(chǎn)物的膠回收片段NR11/Y-3連接到pBS-T載體10上，18℃，1小時(shí)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α11，挑選轉(zhuǎn)化的白色克隆12，酶切和測(cè)序驗(yàn)證獲得目標(biāo)基因的克隆pBS-T(NR11/Y-3)D。
圖6為目標(biāo)基因克隆pBS-T(NR11/Y-3)質(zhì)粒DNA的酶切電泳圖。圖6所示泳道1為pBS-T(NR11/Y-3)質(zhì)粒DNA的EcoRI酶切片段，其中，2955bp為載體載體片段2607bp為目標(biāo)基因基因的EcoRI酶切片段；泳道2為L(zhǎng)amdaDNA的EcoRI/HindIII Marker；泳道3pET30a的質(zhì)粒DNA長(zhǎng)度為5422bp的EcoRI酶切片段，用以目標(biāo)基因在大腸桿菌表達(dá)的載體。
圖7為番茄分離的目標(biāo)基因在大腸桿菌表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖。
圖7所示pBS-T(NR11/Y-3)質(zhì)粒DNA2607bp的EcoRI酶切片段，與pET30a的質(zhì)粒DNA 5422bp的EcoRI酶切片段；按照說明書要求用T4連接酶連接后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，該菌株37℃過夜培養(yǎng)12小時(shí)以后，30℃誘導(dǎo)4小時(shí)，提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，得到原核表達(dá)的蛋白，分子量約為112.5KDa。
泳道1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker(97.4Kda、66.2Kda、40.0KDa、26.6KDa、19.7KDa、14.4KDa)；泳道230℃誘導(dǎo)4小時(shí)，目標(biāo)基因編碼蛋白表達(dá)，分子量約為112.5KDa；泳道330℃誘導(dǎo)6小時(shí)，目標(biāo)基因編碼蛋白表達(dá)；泳道430℃誘導(dǎo)4小時(shí)，pET30a載體蛋白表達(dá)，沒有分子量為112.5KDa的蛋白表達(dá)；泳道530℃誘導(dǎo)6小時(shí)，pET30a載體蛋白的表達(dá)，沒有分子量為112.5KDa的蛋白表達(dá)。
圖8為半葉法檢測(cè)分離蛋白番茄花葉病毒的抗性。
圖8所示菌株pBS-T(NR11/Y-3)B經(jīng)過洗滌包涵體、變性、復(fù)性、酶切、層析分離，洗出目的蛋白，待測(cè)樣品的總蛋白濃度調(diào)整到10μg/ml左右，與番茄花葉病毒(ToMV)等體積混合后，磨擦接種心葉煙的右半葉。左半葉用蒸餾水與ToMV等體積混合液摩擦接種。試驗(yàn)表明，左半葉用蒸餾水與TMV等體積混合液摩擦接種平均枯斑數(shù)為42-47個(gè)不等，而回收蛋白與ToMV等體積混合后，磨擦接種心葉煙的右半葉沒有枯斑發(fā)生，說明回收純化的目標(biāo)基因編碼蛋白同Tm-22基因的編碼蛋白一樣具有抗番茄花葉病毒的活性。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所限定的抗番茄花葉病毒基因即為PCR擴(kuò)增片斷NR11/Y-3，該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3是從番茄(Lycopersicon esculentum Miller)組織培養(yǎng)苗Y-3中分離的；該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3的核苷酸序列為SEQ NO.1所示的708-3293nt之間的片斷，其長(zhǎng)度從ATG到TGA為2586nt，其分子量為98.539KDa；其與AF536201，即Tm-22基因有99.85％的同源性；該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3在1100，1122，1147和1904位點(diǎn)處分別有G，G，C，G堿基的突變；該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3是一個(gè)與Tm-22類似的基因開放閱讀框。
實(shí)驗(yàn)證明，該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3，當(dāng)其插入到克隆載體pBS-T中時(shí)，獲得了含有擴(kuò)增片斷NR11/Y-3的重組DNA質(zhì)粒pBS-T(NR11/Y-3)，該質(zhì)粒pBS-T(NR11/Y-3)擁有功能相關(guān)的基因編碼區(qū)、轉(zhuǎn)錄起始區(qū)以及結(jié)合位點(diǎn)，他們的名稱及其功能分別是(1)f1(+)單鏈DNA復(fù)制區(qū)(134-411)；(2)半乳糖苷酶LacZ基因編碼區(qū)(460-3401)；(3)M13+(-47)引物結(jié)合位點(diǎn)(577-594)；(4)T7啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)(626-644)；(5)T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(643)；(6)用于擴(kuò)增基因插入的多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)(653-3345)；(7)目標(biāo)基因的擴(kuò)增片斷NR11/Y-3的核苷酸序列(708-3293)；(8)編碼的半乳糖苷酶LacZ基因啟動(dòng)子區(qū)(3402-3523)；(9)pUC復(fù)制啟動(dòng)子區(qū)(3743-4410)；(10)Ampicillin抗性基因編碼區(qū)(4561-5418)。
本發(fā)明所轉(zhuǎn)化的是含有抗番茄花葉病毒基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3的質(zhì)粒載體。該載體位于大腸桿菌菌株pBS-T(NR11/Y-3)D中，其菌種保藏號(hào)CCTCC NOM205011，菌種保藏日為2005年1月24日；其質(zhì)粒含有從番茄組織培養(yǎng)苗Y-3中分離的一個(gè)抗番茄花葉病毒基因的擴(kuò)增片斷NR11/Y-3。
本發(fā)明所轉(zhuǎn)化并表達(dá)的是抗番茄花葉病毒基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3的編碼蛋白。該編碼蛋白與AF536201，即Tm-22基因的編碼蛋白有99.85％的同源性；其氨基酸序列在374和382位點(diǎn)處分別存在甘氨酸和丙氨酸兩個(gè)氨基酸的變異；這種變異不同于已有的AF536201，即Tm-22基因的編碼蛋白；從ATG到TGA編碼有681個(gè)氨基酸；該編碼蛋白是一個(gè)具有抗番茄花葉病毒病功能的受體蛋白激酶。
本發(fā)明所設(shè)計(jì)的含有抗番茄花葉病毒基因的分離方法。采用以下分離步驟1)提取高純度番茄基因組DNA；2)PCR擴(kuò)增常規(guī)PCR擴(kuò)增技術(shù)，其中，引物長(zhǎng)度在30-40bp之間，變性溫度為95℃；3)擴(kuò)增的目標(biāo)基因插入pBS-T克隆載體上。
所述的1)步中，高純度番茄基因組DNA的提取方法是(1)取番茄Y-3的組織培養(yǎng)苗幼嫩葉片放入1.5ml的離心管中，浸入液氮，用牙簽搗碎；(2)加入細(xì)胞裂解液，65℃溫育20分鐘；(3)加人600μl氯仿，混勻，12,000rpm離心2分鐘，取上清，加入600μl氯仿∶苯酚∶異戊醇，混勻，12,000rpm離心2分鐘，取上清，加入到1ml-20℃的異丙醇中，沉淀20分鐘；(4)12,000rpm離心5分鐘，去上清，沉淀加入70％的乙醇600μl，洗兩遍；沉淀用TE緩沖液溶解；(5)加入RNA酶3-5μl，降解RNA，得到高純度的核基因組DNA。
本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)過程是首先從番茄的葉片組織培養(yǎng)產(chǎn)生的再生苗中，篩選對(duì)番茄花葉病毒具有抗性的突變體植株苗，用這個(gè)具有番茄花葉病毒抗性的植株葉片提取高純度的DNA，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)公布的基因序列，設(shè)計(jì)幾十對(duì)PCR擴(kuò)增引物，采用大連寶生物技術(shù)公司的LA Taq酶進(jìn)行目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增，克隆到了一個(gè)目標(biāo)基因擴(kuò)增片段NR11/Y-3，將這個(gè)基因擴(kuò)增片段克隆到克隆載體pBS-T中，獲得一個(gè)番茄的目標(biāo)基因克隆pBS-T(NR11/Y-3)，該基因克隆的DNA連接片段總長(zhǎng)度為5562nt(附圖1)，其含有目標(biāo)基因NR11/Y-3的DNA片段，長(zhǎng)度為2586nt，編碼蛋白的氨基酸為861aa；pBS-T載體長(zhǎng)度2976nt，包含有f1(+)單鏈DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄區(qū)(306nt)，半乳糖苷酶LacZ基因(478nt)，ampicillin氨芐青霉素抗性基因編碼區(qū)(857nt)。該目標(biāo)基因的克隆pBS-T(NR11/Y-3)的核苷酸序列為附圖SEQ NO.1所示；該克隆的圖譜結(jié)構(gòu)特征是，在多克隆位點(diǎn)區(qū)(107nt)內(nèi)的EcoRI酶切片段之間插入一個(gè)長(zhǎng)度為2586nt(708-3293位點(diǎn)間)的目標(biāo)基因片段NR11/Y-3，采用核苷酸序列分析和比對(duì)證實(shí)，這是一個(gè)與AF536201(Tm-22基因)同源性高達(dá)99.85％的抗番茄花葉病毒病基因(如圖2)，分子量為98.539KDa，它來源于番茄的組織培養(yǎng)形成的突變體植株苗Y-3，基因型不同于GenBank獲得Tm-22基因(AF536201)的番茄品種Money Maker-vir等品種。其中，克隆的這個(gè)抗病毒病基因擴(kuò)增片段NR11/Y-3，其核苷酸序列在1100，1122，1147和1904位點(diǎn)處分別有G，G，C，G堿基的突變而不同于AF536201的Tm-22基因(相同位點(diǎn)分別為A，T，G，A)。該基因擴(kuò)增片段NR11/Y-3的編碼蛋白與Tm-22基因(AF536201)編碼蛋白的同源性高達(dá)99.77％，其氨基酸序列在374和382位點(diǎn)處分別由G(Gly，甘氨酸)和A(Ala，丙氨酸)兩個(gè)氨基酸的變異，相同位點(diǎn)的AF536201的編碼蛋白為W(Trp，色氨酸)和G(Gly，甘氨酸)(見圖3)。這說明NR11/Y-3是一個(gè)來源于番茄組織培養(yǎng)苗的抗病毒病基因——Tm-22-like基因，其編碼蛋白是一個(gè)具有抗番茄花葉病毒病功能的受體激酶。這一結(jié)果表明，采用本發(fā)明的技術(shù)和方法所分離的番茄基因，可以獲得同源性接近100％的目標(biāo)基因片段；將目標(biāo)基因克隆pBS-T(NR11/Y-3)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得含有克隆基因片段NR11/Y-3的菌株pBS-T(NR11/Y-3)D，其菌種保藏號(hào)CCTCC NOM205011，菌種保藏日為2005年1月24日。
所述番茄抗病基因快速分離的技術(shù)方法有五個(gè)步驟(見圖5)第一步是高純度番茄基因組DNA的提??；其方法是用簡(jiǎn)捷的、快速的方法提取番茄幼嫩葉片的基因組DNA；具體步驟是1)取番茄Y-3的組織培養(yǎng)苗幼嫩葉片放入1.5ml的離心管中，浸入液氮，用牙簽搗碎；2)加入細(xì)胞裂解液600μl(所述的細(xì)胞裂解液，其組分為pH8.0的0.1mol/L Tris-HCl；2.8-3.3％，CTAB，w/v；0.02mol/L EDTA；1.4mol/L NaCl；1.8-2.5％PVP，v/v。)65℃溫育20分鐘，3)加入600μl氯仿，混勻，12,000rpm離心2分鐘，取上清，加入600μl氯仿∶苯酚∶異戊醇，混勻，12,000rpm離心2分鐘，取上清，加入到1ml-20℃的異丙醇中，沉淀20分鐘；4)12,000rpm離心5分鐘，去上清，沉淀加入70％乙醇600μl，洗兩遍，沉淀用50-100μl的、pH8.0的含有0.01mol/L Tris.HCl，0.01mol/L EDTA的TE緩沖液溶解；5)加入RNA酶3-5μl，降解RNA，得到高純度的核基因組DNA。
第二步特異性目標(biāo)基因片段擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)；其方法是根據(jù)番茄相關(guān)文獻(xiàn)公布的相關(guān)基因序列。引物的設(shè)計(jì)采用DNAman軟件進(jìn)行，并依照要求編程。設(shè)計(jì)幾十對(duì)PCR擴(kuò)增引物，擴(kuò)增引物的長(zhǎng)度約為30-40bp其中，獲得目標(biāo)基因擴(kuò)增片段NR11/Y-3的引物分別為JPri-5和JPri-6，其長(zhǎng)度分別是40bp和32bp。
第三步是采用LA Taq酶進(jìn)行目標(biāo)基因的PCR擴(kuò)增；其方法是采用大連寶生物公司的LATaq酶進(jìn)行目標(biāo)基因的擴(kuò)增，各個(gè)成分與含量按照說明書的要求進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性，95℃5min，循環(huán)參數(shù)為95℃30s，56℃45s，72℃2.5min，35次循環(huán)，最后72℃延伸5min。
第四步是克隆擴(kuò)增產(chǎn)物到pBS-T載體(上海生工產(chǎn)品)上；其方法是從瓊脂糖凝膠中回收PCR擴(kuò)增片段，方法采用上海生工的UNIQ-10三聯(lián)柱式DNA膠回收試劑盒，方法依照說明進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物的膠回收片段NR11/Y-3連接到pBS-T載體上，方法采用大連寶生物的DNALigation Kit Ver 2.1依照說明進(jìn)行，時(shí)間1小時(shí)，溫度18℃，連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，42℃熱激1.5分鐘，然后在含有X-gal、IPTG和50mg/l氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，挑選白色克隆，限制性酶切鑒定后，測(cè)序驗(yàn)證，獲得含有與目標(biāo)基因高度同源的Tm-22-like基因，克隆菌株編碼為pBS-T(NR11/Y-3)D，該克隆菌株細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒含有一個(gè)來源于番茄組織培養(yǎng)苗Y-3的番茄抗病毒病基因片段。
第五步是進(jìn)行同源性比對(duì)驗(yàn)證；其方法是將該克隆的PCR擴(kuò)增片段NR11/Y-3測(cè)序，測(cè)序工作由上海生工通過DNA自動(dòng)測(cè)序儀來完成，測(cè)序結(jié)果用Blast方法在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證，結(jié)果表明，菌株pBS-T(NR11/Y-3)D的克隆片段NR11/Y-3，是一個(gè)同源性與Tm-22基因(AF536201)高達(dá)99.85％抗花葉病毒病的基因片段，其開放閱讀框架長(zhǎng)度為2586nt，它的分子量為98.539KDa，它的核苷酸序列有4個(gè)位點(diǎn)的堿基不同于GenBank中的Tm-22基因，而且有兩個(gè)特異氨基酸的變異。由于它來源于對(duì)番茄花葉病毒病表現(xiàn)抗性的突變體植株苗Y-3，該突變體與Money Maker-vir，以及ATV847和Craigella GCR267沒有親緣關(guān)系，因此證明，所克隆的基因片段編碼了一個(gè)抗番茄花葉病毒病的抗性基因——Tm-22-like基因。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明擴(kuò)增的基因片段突變率低。例如，該試驗(yàn)例擴(kuò)增的番茄抗病毒病的基因片段NR11/Y-3與目標(biāo)基因的核苷酸序列的堿基差異僅有0.15％，幾乎不影響擴(kuò)增基因的完整表達(dá)。
本發(fā)明的目標(biāo)基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)驗(yàn)證(見圖6、7)其方法是用EcoRI酶切pBS-T(NR11/Y-3)質(zhì)粒DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收長(zhǎng)度為2607bp的DNA片段；同時(shí)酶切pET30a的質(zhì)粒DNA，回收長(zhǎng)度為5422bp的DNA片段；將這兩段DNA片段按照說明書要求用T4連接酶(大連寶生物產(chǎn))連接后，即獲得目標(biāo)基因原核細(xì)胞的表達(dá)載體，其DNA長(zhǎng)度為8029bp，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，即獲得番茄花葉病毒病的抗性基因NR11/Y-3的原核細(xì)胞的表達(dá)菌株pBS-T(NR11/Y-3)B，該菌株37℃過夜培養(yǎng)12小時(shí)以后，30℃誘導(dǎo)4小時(shí)，提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，得到表達(dá)的蛋白，分子量約為112.5KDa，應(yīng)用Promega公司的MagneHisTMProtein PurificationSystem試劑盒(V8500)，按照說明書的要求進(jìn)行。同樣獲得純化表達(dá)的擁有His標(biāo)記的編碼蛋白。
本發(fā)明的目標(biāo)基因編碼蛋白對(duì)番茄花葉病毒的抗性試驗(yàn)(見圖8)菌株pBS-T(NR11/Y-3)B經(jīng)過洗滌包涵體、變性、復(fù)性、凝血酶酶切，先經(jīng)DEAE SepharoseFast Flow陰離子交換層析分離，再經(jīng)Sephacyl S2200凝膠過濾層析分離，于0.2mol/L NaCl洗出并獲得目的蛋白，回收純度為15％。利用BCA定量法將待測(cè)樣品的總蛋白濃度調(diào)整到10μg/ml左右，與番茄花葉病毒(ToMV)等體積混合后，磨擦接種心葉煙的右半葉。左半葉用蒸餾水與ToMV等體積混合液摩擦接種。每個(gè)處理接種2～3株，每株接種3～5片葉，3d后記錄枯斑數(shù)并繼續(xù)觀察直至7d。抑制率(％)＝(對(duì)照平均每葉枯斑數(shù)-處理平均每葉枯斑數(shù))×100％/對(duì)照平均每葉枯斑數(shù)。圖8表明，左半葉用蒸餾水與TMV等體積混合液摩擦接種平均枯斑數(shù)為42-47個(gè)不等，而回收蛋白與ToMV等體積混合后，磨擦接種心葉煙的右半葉沒有枯斑發(fā)生，說明回收純化的目標(biāo)基因編碼蛋白具有抗番茄花葉病毒的活性。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都會(huì)理解，在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)于上述實(shí)施例進(jìn)行修改，添加和替換都是可能的，其都沒有超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種抗番茄花葉病毒基因，其特征在于該基因即為PCR擴(kuò)增片斷NR11/Y-3，該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3是從番茄(Lycopersicon esculentum Miller)組織培養(yǎng)苗Y-3中分離的；該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3的核苷酸序列為SEQ NO.1所示的708-3293nt之間的片斷，其長(zhǎng)度從ATG到TGA為2586nt，其分子量為98.539KDa；其與AF536201，即Tm-22基因有99.85％的同源性；該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3在1100，1122，1147和1904位點(diǎn)處分別有G，G，C，G堿基的突變；該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3是一個(gè)與Tm-22類似的基因開放閱讀框。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗番茄花葉病毒基因，其特征在于所述的該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3，當(dāng)其插入到克隆載體pBS-T中時(shí)，獲得了含有擴(kuò)增片斷NR11/Y-3的重組DNA質(zhì)粒pBS-T(NR11/Y-3)，該質(zhì)粒pBS-T(NR11/Y-3)擁有功能相關(guān)的基因編碼區(qū)、轉(zhuǎn)錄起始區(qū)以及結(jié)合位點(diǎn)，他們的名稱及其功能分別是(1)f1(+)單鏈DNA復(fù)制區(qū)(134-411)；(2)半乳糖苷酶LacZ基因編碼區(qū)(460-3401)；(3)M13+(-47)引物結(jié)合位點(diǎn)(577-594)；(4)T7啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)(626-644)；(5)T7啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(643)；(6)用于擴(kuò)增基因插入的多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)(653-3345)；(7)目標(biāo)基因的擴(kuò)增片斷NR11/Y-3的核苷酸序列(708-3293)；(8)編碼的半乳糖苷酶LacZ基因啟動(dòng)子區(qū)(3402-3523)；(9)pUC復(fù)制啟動(dòng)子區(qū)(3743-4410)；(10)Ampicillin抗性基因編碼區(qū)(4561-5418)。
3.一種含有抗番茄花葉病毒基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3的質(zhì)粒載體，其特征在于該載體位于大腸桿菌菌株pBS-T(NR11/Y-3)D中，其菌種保藏號(hào)CCTCC NOM205011，菌種保藏日為2005年1月24日；其質(zhì)粒含有從番茄組織培養(yǎng)苗Y-3中分離的一個(gè)抗番茄花葉病毒基因的擴(kuò)增片斷NR11/Y-3。
4.一種抗番茄花葉病毒基因擴(kuò)增片斷NR11/Y-3的編碼蛋白，其特征在于該編碼蛋白與AF536201，即Tm-22基因的編碼蛋白有99.85％的同源性；其氨基酸序列在374和382位點(diǎn)處分別存在甘氨酸和丙氨酸兩個(gè)氨基酸的變異；這種變異不同于已有的AF536201，即Tm-22基因的編碼蛋白；從ATG到TGA編碼有681個(gè)氨基酸；該編碼蛋白是一個(gè)具有抗番茄花葉病毒病功能的受體蛋白激酶。
5.一種含有抗番茄花葉病毒基因的分離方法，其特征在于采用以下分離步驟1)提取高純度番茄基因組DNA；2)PCR擴(kuò)增常規(guī)PCR擴(kuò)增技術(shù)，其中，引物長(zhǎng)度在30-40bp之間，變性溫度為95度；3)目標(biāo)基因的擴(kuò)增片段插入pBS-T克隆載體上。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述含有抗番茄花葉病毒基因的分離方法，其特征在于所述的1)步中，高純度番茄基因組DNA的提取方法是(1)取番茄Y-3的組織培養(yǎng)苗幼嫩葉片放入1.5ml的離心管中，浸入液氮，用牙簽搗碎；(2)加入細(xì)胞裂解液，65℃溫肓20分鐘；(3)加入600μl氯仿，混勻，12,000rpm離心2分鐘，取上清，加入600μl氯仿∶苯酚∶異戊醇，混勻，12,000rpm離心2分鐘，取上清，加入到1ml-20℃的異丙醇中，沉淀20分鐘；(4)12,000rpm離心5分鐘，去上清，沉淀加入70％乙醇600μl，洗兩遍；沉淀用50-100μl的、pH8.0的含有0.01mol/L Tris.HCl，0.01mol/L EDTA的TE緩沖液溶解；(5)加入RNA酶3-5μl，降解RNA，得到高純度的核基因組DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述含有抗番茄花葉病毒基因的分離方法，其特征在于所述的細(xì)胞裂解液，其組分為pH8.0的0.1mol/L Tris-HCl；2.8-3.3％，CTAB，w/v；0.02mol/L EDTA；1.4mol/L NaCl；1.8-2.5％PVP，v/v。
全文摘要
本發(fā)明是一種抗番茄花葉病毒基因及其分離方法，該基因擴(kuò)增片斷NR11/Y－3是從番茄組織培養(yǎng)苗Y－3中分離的；該基因的核苷酸序列為SEQ NO.1所示的708－3293 nt之間的片斷，長(zhǎng)度從ATG到TGA為2586nt，分子量為98.539KDa；其與AF536201，即Tm－文檔編號(hào)C12N15/54GK1727481SQ200510042560
公開日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2005年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月14日
發(fā)明者姜國勇 申請(qǐng)人:姜國勇