專利名稱：一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及番茄黃化曲葉病毒接種鑒定的研究，更具體的說(shuō)是一種快速、簡(jiǎn)捷、高效的鑒定天津地區(qū)番茄黃化曲葉病毒抗性接種的方法。
背景技術(shù)：
番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)主要危害番茄、辣椒、茄子、甘藍(lán)和黃瓜等蔬菜以及煙草等經(jīng)濟(jì)作物，特別是在番茄上危害更重。針對(duì)于TYLCV 病毒的發(fā)生和危害，如何準(zhǔn)確、快速、高效地檢測(cè)到該病毒的存在和發(fā)生，是蔬菜安全可持續(xù)生產(chǎn)的迫切需要。目前，鑒定番茄黃化曲葉病抗性的方法有煙粉虱傳毒、嫁接接種和機(jī)械傳毒等等。 其中，嫁接法以嫩病葉做接穗，采用腹接法接種到健康番茄上，它的優(yōu)點(diǎn)是能夠?yàn)榇b定植株提供高含量的ITLCV病毒，但該方法耗時(shí)耗力，只適于少量鑒定。機(jī)械傳播是在人工環(huán)境下把感染TYLCV的曼陀羅、心葉煙或潘那利番茄作為毒源，通過(guò)機(jī)械傳播侵染健康番茄植株，成功率較低，且病毒從番茄傳到番茄上成功的例子只有很少的報(bào)道，因此，在接種中一般不用該TYLCV病毒。在育種進(jìn)程中最常用的接種方法是煙粉虱接種鑒定法，包括溫室中煙粉虱接種、回型籠中煙粉虱接種、露地?zé)煼凼臃N3種類型，但這個(gè)方法也有一些缺點(diǎn)1.蟲口密度不均一對(duì)抗性鑒定的影響。若蟲口密度過(guò)大，一些抗病品種也會(huì)表現(xiàn)出感病來(lái)；若蟲口密度太小，又區(qū)分不出抗感品種。目前對(duì)蟲口密度的要求還沒(méi)有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。 2.蟲子逃逸引起病害的大面積發(fā)生。煙粉虱的體長(zhǎng)一般為l_2mm，它可隨著調(diào)查人員的進(jìn)出而逃逸出來(lái)，從而給周圍番茄產(chǎn)區(qū)帶來(lái)災(zāi)害。3.受季節(jié)限制。煙粉虱的最佳活動(dòng)溫度是 ^_28°C，低于15°C蟲子基本不活動(dòng)，也就不能傳毒，這就會(huì)延緩接種鑒定的進(jìn)程。農(nóng)桿菌接種法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種病毒抗性鑒定方法。利用TYLCV-DNA侵染性克隆，通過(guò)根癌農(nóng)桿菌侵染待鑒定植株，病毒DNA可在植物體內(nèi)形成、復(fù)制、運(yùn)輸并誘發(fā)癥狀。侵染性克隆技術(shù)首先在噬菌體病毒Qβ、脊髓灰質(zhì)炎病毒b^iorir皿)中獲得成功，植物病毒侵染性克隆由Ahlquist等(1984)在雀麥花葉病毒virus, BMV)首次報(bào)道，至今國(guó)外已有大量的植物病毒被成功地構(gòu)建了全長(zhǎng)cDNA侵染性克隆 (2008)。^iang等(2010，2009)分別構(gòu)建了番木瓜黃曲病毒的侵染性克隆和上海分離物 YLCV-[CN:SH2]的侵染性克隆，證明通過(guò)農(nóng)桿菌注射能誘導(dǎo)出病毒侵染癥狀。本發(fā)明的研究表明(2011)天津地區(qū)的分離物與上海和山東等省的分離物基因序列不同，編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白的序列有2處突變，導(dǎo)致天津地區(qū)分離物與其它地區(qū)分離物氨基酸的不同，分別是90位E到G和104位H到Y(jié)，推測(cè)這兩個(gè)突變可能增強(qiáng)了其致病力。目前，國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)天津地區(qū)TYLCV的侵染性克隆工作的報(bào)道，因此，針對(duì)以天津?yàn)榇淼娜A北地區(qū)抗番茄曲葉病毒栽培專用品種缺乏的現(xiàn)狀，開展侵染性克隆構(gòu)建工作，建立一套方便、可靠、安全的接種新方法，為抗病育種提供一種客觀的評(píng)價(jià)體系，從而篩選培育出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的專用品種，對(duì)于提高番茄市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，推進(jìn)蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展
4具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)不能準(zhǔn)確地對(duì)TYLCV抗性進(jìn)行鑒定的問(wèn)題，本發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究工作，構(gòu)建了針對(duì)天津地區(qū)TYLCV的侵染性克隆(代號(hào)為TYLCV-TJ)，通過(guò)莖桿注射接種番茄黃化曲葉病毒，鑒定不同番茄材料對(duì)該病毒的抗性。此方法無(wú)需飼養(yǎng)煙粉虱、操作簡(jiǎn)單、效率高、重復(fù)性好、可控性好，能提供相對(duì)一致的接種壓力，結(jié)果準(zhǔn)確，是一種簡(jiǎn)便有效的接種鑒定方法。本發(fā)明所公開的技術(shù)內(nèi)容如下
一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行
1)DNA提取從收集的發(fā)病植株的葉片中提取基因組總DNA ；
2)引物的設(shè)計(jì)以植物總DNA為模板，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物-對(duì)病毒DNA-A進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中擴(kuò)增所用PCR引物為
BamHI 上 ag tgggatccac ttctaaatg
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2356Fbggatggaaatgtgctgacct
BamRbgtggatcccacatattgcaa
a:擴(kuò)增全長(zhǎng)的DNA-A序列；
b 擴(kuò)增0. 4A的DNA-A序列；
3)擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD-19T載體上，分別命名為1. OA-pMD和0. 4A_pMD并轉(zhuǎn)化到 DH5a菌液中；
4)串聯(lián)重復(fù)的克隆用BamHI酶切切下1.OA-pMD的病毒全長(zhǎng)DNA ；用BamHI切開含有 0. 4A病毒基因組片段的0. 4A-pMD載體；利用試劑盒回收相應(yīng)大小的片段，利用T4連接酶將二者相連得到1. 4A-pMD重組載體，轉(zhuǎn)化至Dffia菌液中；
5)正向串聯(lián)重復(fù)序列的獲得
1. OA和0. 4A兩個(gè)片段，利用引物C擴(kuò)增陽(yáng)性克隆菌液，比較大小后選出正向串聯(lián)的菌落形成1. 4A串聯(lián)的克??；所用引物為
PMD19F ccgcc aag ctt gca tgccg
BamR cgtggatcccacatattgcaa ；
6)表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化
利用KnpI和Mil對(duì)含有1. 4A TYLCV的1. 4A_pMD質(zhì)粒和植物表達(dá)載體pRI IOl-An 進(jìn)行雙酶切，然后利用T4連接酶將目的片段與表達(dá)載體進(jìn)行連接得到1.4A- pRI，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α中；用凍融法將1. 4Α- pRI直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含利福平和卡那霉素平板，溫箱培養(yǎng)2 3d ；挑取單菌落接種于anl含利福平50ug / mL和卡那霉素50ug / mL的TCB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜后，取ImI 菌液置于1.5ml離心管，離心收集菌體，加50 L無(wú)菌水煮沸l(wèi)Omin，取上清作模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 0%瓊脂凝膠電泳驗(yàn)證；
7)重組質(zhì)粒的提取與鑒定
用 TAKARAMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0 (50 次量)試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒 DNA的微量提取，利用Mil和KnpI雙酶切1. 4A -pRI，37°C酶切消化Ih后瓊脂糖凝膠電泳8)序列測(cè)定與分析
數(shù)據(jù)處理借助 DNAMAN Version 6. 0 (Lynnon Biosoft, QuebeCanada)進(jìn)行，利用 BLAST 程序在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找與DNA-A序列最相近的基因組序列；
9)農(nóng)桿菌接種及病毒DNA的檢測(cè)和田間調(diào)查
將含有病毒DNA-A侵染性克隆的農(nóng)桿菌LBA4404分別接種在含卡那霉素(50 ug/mL) 和利福平(50 ug/mL)的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C，200 rpm振蕩培養(yǎng)48 h，接種時(shí)，取一支 1 mL的一次性注射器，吸取培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液，在距離供試植株根部1-2 cm處取三點(diǎn)進(jìn)行韌皮部注射，接種植株置于防蟲溫室中培養(yǎng)，在注射接種后30天，采集葉片約0. 5克，抽 DNA-A后進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)植株高度和葉片進(jìn)行癥狀的觀察。本發(fā)明通過(guò)該方法能科學(xué)高效準(zhǔn)確地鑒定出番茄對(duì)ITLCV的抗性，其特點(diǎn)在于 (1)本發(fā)明公開的接種鑒定方法與其它的侵染性克隆不同的是本發(fā)明是利用雙子葉植
物表達(dá)載體pRI-101-AN。該載體能特異地在番茄體內(nèi)高效表達(dá)有利于病毒癥狀的誘導(dǎo)且具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。(2)本發(fā)明將含有雙向起動(dòng)子的頂區(qū)序列串聯(lián)在了全長(zhǎng)基因組編碼序列之后，而其它的如TYLCV的YlO分離物是將頂區(qū)串聯(lián)在了全長(zhǎng)基因組之前，實(shí)驗(yàn)證明這種策略同樣能有效起動(dòng)病毒的編碼，為侵染性克隆的構(gòu)建提供了更多的途徑。(3)本發(fā)明是針對(duì)天津地區(qū)特有的番茄黃化曲葉病毒序列而構(gòu)建的表達(dá)載體，其所編碼的氨基酸與其它地區(qū)是不同的，見(jiàn)文獻(xiàn)《華北農(nóng)學(xué)報(bào)》2011年第1期“天津地區(qū)番茄黃化曲葉病毒DNA-A的克隆和序列分析”。本發(fā)明更加詳細(xì)的方法如下 1材料和方法
1.1材料
毒源TYLCV侵染植株所引起的典型癥狀為黃脈、曲葉、曲莖、葉片皺縮、葉脈增厚、葉色褪綠、植株矮化等癥狀。采集表現(xiàn)這些癥狀的栽培番茄，-70°C保存待用。菌株與載體大腸桿菌和農(nóng)桿菌L. BA4404DH5 α購(gòu)均自北京博美科生物技術(shù)有限公司；分子量標(biāo)準(zhǔn)Taq酶和克隆載體pMD-19T植物表達(dá)載體pRI IOl-An均購(gòu)自寶生物工程有限公司。限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶及DNA購(gòu)自寶信購(gòu)自New England Biolabs01. 2 方法
(1)取材料，加液氮研磨成粉末狀，迅速移入1.5ml Eppendorf管中；
(2)加入800μ 1的CTAB提取緩沖液，混勻(CTAB在65°C水浴預(yù)熱)，每5min輕輕震蕩幾次，20min 后 12000 r/min，離心 15 min ；
(3)小心吸取上清液，加入等體積的酚氯仿(各400μ 1)溶液，混勻，4°C，12000 r/min, 離心10 min ；
(4)小心吸取上清液，加入等體積的氯仿，混勻，4°C，12000r/min，離心10 min。(5)重復(fù)步驟(4) 1-2次，以蛋白層不出現(xiàn)為止；
(6)取上清，-20°C沉淀lh，4°C，12000 r/min，離心 10 min ；
(7)棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次；
(8)室溫下干燥后(一般干燥5-15min)，溶于30-50 μ 1 DEPC去離子水中，于_20°C或者-70°C下保存?zhèn)溆谩Ｒ锏脑O(shè)計(jì)
根據(jù)于力等人設(shè)計(jì)的1對(duì)簡(jiǎn)并引物，用于擴(kuò)增該保守區(qū)的的片段。引物序列分別為
CoPR,5，>GA(AGCT)G(GC)ATG(ACT)GT(AG)CA (AGT)GCCATATA<3，， AV494，5，>GCC (CT)AT (AG)TA (CT)AG (AG) AAGCC (AC)AG<3，。對(duì)該部分區(qū)域進(jìn)行克隆及序列測(cè)序，BLAST比較確定其是否為TYLCV分離物。根據(jù)已知片段的序列擴(kuò)增未知的全長(zhǎng)序列。在設(shè)計(jì)引物時(shí)加入載體的酶切位點(diǎn)
表1克隆所用PCR引物
權(quán)利要求
1. 一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行1)DNA提取從收集的發(fā)病植株的葉片中提取基因組總DNA ；2)引物的設(shè)計(jì)以植物總DNA為模板，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物-對(duì)病毒DNA-A進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中擴(kuò)增所用PCR引物為BamHI _tag tgggatccac ttctaaatgBamHI Τ" aggatcc catattgcaagacagactac2356FbggatggaaatgtgctgacctBamRbgtggatcccacatattgcaaa 擴(kuò)增全長(zhǎng)的DNA-A序列；b 擴(kuò)增0. 4A的DNA-A序列；3)擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD-19T載體上，分別命名為1. OA-pMD和0. 4A_pMD并轉(zhuǎn)化到 DH5a菌液中；4)串聯(lián)重復(fù)的克隆用BamHI酶切切下1.OA-pMD的病毒全長(zhǎng)DNA ；用BamHI切開含有 0. 4A病毒基因組片段的0. 4A-pMD載體；利用試劑盒回收相應(yīng)大小的片段，利用T4連接酶將二者相連得到1. 4A-pMD重組載體，轉(zhuǎn)化至Dffia菌液中；5)正向串聯(lián)重復(fù)序列的獲得1. OA和0. 4A兩個(gè)片段，利用引物C擴(kuò)增陽(yáng)性克隆菌液，比較大小后選出正向串聯(lián)的菌落形成1. 4A串聯(lián)的克??；所用引物為PMD19F ccgcc aag ctt gca tgccgBamR cgtggatcccacatattgcaa ；6)表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化利用KnpI和Mil對(duì)含有1. 4A TYLCV的1. 4A_pMD質(zhì)粒和植物表達(dá)載體pRI IOl-An進(jìn)行雙酶切，然后利用T4連接酶將目的片段與表達(dá)載體進(jìn)行連接得到1.4A- pRI，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α中；用凍融法將1. 4Α- pRI直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含利福平和卡那霉素平板，溫箱培養(yǎng)2 3d ；挑取單菌落接種于anl含利福平50ug / mL和卡那霉素IOOug / mL的YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜后，取ImI 菌液置于1.5ml離心管，離心收集菌體，加50 L無(wú)菌水煮沸l(wèi)Omin，取上清作模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 0%瓊脂凝膠電泳驗(yàn)證；7)重組質(zhì)粒的提取與鑒定用 TAKARAMiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. 0 (50 次量)試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒 DNA的微量提取，利用Mil和KnpI雙酶切1. 4A -pRI，37°C酶切消化Ih后瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果；8)序列測(cè)定與分析數(shù)據(jù)處理借助 DNAMAN Version 6. 0 (Lynnon Biosoft, QuebeCanada)進(jìn)行，利用 BLAST 程序在GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找與DNA-A序列最相近的基因組序列；9)農(nóng)桿菌接種及病毒DNA的檢測(cè)和田間調(diào)查將含有病毒DNA-A侵染性克隆的農(nóng)桿菌LBA4404分別接種在含卡那霉素(50 ug/mL) 和利福平(50 ug/mL)的YEB液體培養(yǎng)基中，28°C，200 rpm振蕩培養(yǎng)48 h，接種時(shí)，取一支 1 mL的一次性注射器，吸取培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液，在距離供試植株根部1-2 cm處取三點(diǎn)進(jìn)行韌皮部注射，接種植株置于防蟲溫室中培養(yǎng)，在注射接種后30天，采集葉片約0. 5克，抽DNA-A后進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)植株高度和葉片進(jìn)行癥狀的觀察。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，它是針對(duì)天津地區(qū)特有的番茄黃化曲葉病毒序列而構(gòu)建了針對(duì)天津地區(qū)TYLCV的侵染性克隆，通過(guò)莖桿注射接種番茄黃化曲葉病毒，鑒定不同番茄材料對(duì)該病毒的抗性。此方法無(wú)需飼養(yǎng)煙粉虱、操作簡(jiǎn)單、效率高、重復(fù)性好、可控性好，能提供相對(duì)一致的接種壓力，結(jié)果準(zhǔn)確，是一種簡(jiǎn)便有效的接種鑒定方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102392080SQ20111036516
公開日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者劉仲齊, 王建江, 薛俊, 金鳳媚 申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心