分泌抗番茄斑萎病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分泌抗番茄斑萎病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。用差速離心的方法提純的番茄斑萎病毒病毒粒子為抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、克隆，獲得1株能穩(wěn)定傳代并分泌抗番茄斑萎病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1A5，保藏號(hào)為CGMCCNo.9343。雜交瘤細(xì)胞分泌的單抗腹水ELISA效價(jià)達(dá)10-8，抗體類型及亞類為IgG1，kappa鏈。1A5分泌的單抗僅與番茄斑萎病毒有特異性反應(yīng)，與蕪菁花葉病毒、番茄花葉病毒、鳶尾黃斑病毒、黃瓜花葉病毒等不反應(yīng)。且該單抗能特異和靈敏地檢測(cè)番茄斑萎病毒。該雜交瘤細(xì)胞株及其分泌的單抗為該番茄病毒病的診斷、檢測(cè)及科學(xué)防控提供技術(shù)和物質(zhì)支撐。
CGMCC No9343
20140703
【專利說(shuō)明】 分泌抗番茄斑萎病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種分泌抗番茄斑萎病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]番爺斑萎病毒(10111511:0 8^01:1:6(1 ^111:是一種危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要病毒。它的寄主范圍很廣，可侵害160種雙子葉植物與10種單子葉植物，尤其是爺科、菊科和豆科的部分植物。在歐洲、北美、南美、亞洲和大洋洲等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)廣泛分布，熱帶、亞熱帶、溫帶地區(qū)均有發(fā)生。屬于歐洲及地中海植物保護(hù)組織(^90)八2類檢疫性有害生物，同時(shí)也是中國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物。
[0003]番茄斑萎病毒最初是1919年在澳洲發(fā)現(xiàn)于番茄，81-111616?^將此病命名為斑萎病。1317在世界上溫帶和亞熱帶地區(qū)比較常見。1941年前后1317成為影響歐洲煙草種植者經(jīng)濟(jì)收入的一種重要病毒。1317在巴西東南部也廣泛流行。
[0004]病毒粒體扁球狀，直徑80?96納米，易變形，具包膜，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜腔里，有的具尾狀擠出物，質(zhì)粒含20%類脂，7%碳水化合物，5%1？嫩。致死溫度40?461，10分鐘；稀釋限點(diǎn)100?1000倍，體外存活期3?4小時(shí)。
[0005]傳播途徑廣泛，汁液可接種，種子也能傳染，此外煙薊馬、豆薊馬(1.361:08118)、薊馬、煙草褐薊馬(17.&)及苜猜薊馬(17.0001(16^18)等均可進(jìn)行持久性傳毒。薊馬只能在幼蟲期獲得病毒。傳毒需要在體內(nèi)繁殖，蔥薊馬經(jīng)5?10天變?yōu)槌上x后才能傳毒，煙薊馬最短獲毒期為15?30分鐘，豆薊馬需30分鐘，時(shí)間長(zhǎng)傳毒效率升高，薊馬一旦帶毒，傳毒達(dá)20天，具終生傳毒能力。病毒接種多在番茄葉表細(xì)胞淺表皮吸食時(shí)獲取，一般經(jīng)4天潛育即發(fā)病。番茄、瓜葉菊等外種皮帶毒，不進(jìn)入胚胎。
[0006]該病癥狀變化大。苗期染病，幼葉變?yōu)殂~色上卷，后形成許多小黑斑，葉背面沿脈呈紫色，有的生長(zhǎng)點(diǎn)死掉，莖端形成褐色壞死條斑，病株僅半邊生長(zhǎng)或完全矮化或落葉呈萎蔫狀，發(fā)病早的不結(jié)果。坐果后染病，果實(shí)上出現(xiàn)褪綠環(huán)斑，綠果略凸起，輪紋不明顯，青果上產(chǎn)生褐色壞死斑，呈瘤狀突起，果實(shí)易脫落。成熟果實(shí)染病輪紋明顯，紅黃或紅白相間，褪綠斑在全色期明顯，嚴(yán)重的全果僵縮，臍部癥狀與臍腐病相似，但該病果實(shí)表皮變褐壞死別于臍腐病。
[0007]此病毒可以通過(guò)一些野生植物品種來(lái)越冬。但是，病毒流行水平主要依賴于蟲口密度。最主要的介體昆蟲薊馬的成蟲藏在土壤中，春季土壤溫度上升后，害蟲會(huì)遷移到雜草上。目前尚未育出抗131^的專用品種，防治困難。
[0008]針對(duì)抗番茄斑萎病毒單克隆抗體的制備展開工作。當(dāng)前監(jiān)測(cè)體系尚不完善，甚至主要流行區(qū)也未開展相關(guān)預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)的工作。目前用來(lái)檢測(cè)這種病毒的方法主要是田間觀測(cè)、奶士⑶檢測(cè)、電鏡觀察等方法。這幾種方法都具有其局限性，而且不適合大批量的田間樣品檢測(cè)。而血清學(xué)的方法適用于田間樣品批量檢測(cè)，但必須依賴于特異性的病毒單抗。
[0009]以番茄斑萎病毒提純病毒粒子為抗原通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備了 I株分泌抗TSWV的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞1A5，以其分泌的單抗為核心建立了檢測(cè)TSWV的高通量的血清學(xué)方法和檢測(cè)試劑盒，并成功應(yīng)用于田間植物樣品中番茄斑萎病毒的檢測(cè)，從而為我國(guó)番茄斑萎病的診斷、早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警、科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗番茄斑萎病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用。
[0011]分泌抗番茄斑萎病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1A5，它能分泌抗番茄斑萎病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株1A5于2014年7月3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.9343 ；
抗番茄斑萎病毒的單克隆抗體腹水的ELISA效價(jià)達(dá)10_8，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈,該單克隆抗體檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:81920倍稀釋；
抗番茄斑萎病毒的單克隆抗體僅與番茄斑萎病毒有特異性反應(yīng)，而不與鳶尾黃斑病毒、花生環(huán)斑病毒、西瓜銀色斑駁病毒、蕪菁花葉病毒、番茄花葉病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、水稻矮縮病毒、水稻條紋病毒、水稻齒葉矮縮病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系反應(yīng)抗番茄斑萎病毒(TSWV)單克隆抗體在該病毒檢測(cè)及檢疫上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果:1)提供的雜交瘤細(xì)胞株分泌抗番茄斑萎病毒特異性單克隆抗體，以該單抗為核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、DAS-ELISAjPTAS-ELISA等免疫學(xué)方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特異、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)番茄斑萎病毒；2)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體檢測(cè)番茄斑萎病毒，不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè)備；3)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體，可有效地用于田間蔬菜作物中的番茄斑萎病毒的檢測(cè)、診斷。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1是dot-ELISA方法檢測(cè)番茄斑萎病毒的靈敏度分析；
圖2是dot-ELISA方法檢測(cè)田間植物樣品中番茄斑萎病毒的結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0014]分泌抗番茄斑萎病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1A5，它能分泌抗番茄斑萎病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株1A5于2014年7月3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，郵編:100101，保藏號(hào)為 CGMCC N0.9343 ；
抗番茄斑萎病毒的單克隆抗體腹水的ELISA效價(jià)達(dá)10_8，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈,該單克隆抗體檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:81920倍稀釋；
抗番茄斑萎病毒的單克隆抗體僅與番茄斑萎病毒有特異性反應(yīng)，而不與鳶尾黃斑病毒、花生環(huán)斑病毒、西瓜銀色斑駁病毒、蕪菁花葉病毒、番茄花葉病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯X病毒、水稻矮縮病毒、水稻條紋病毒、水稻齒葉矮縮病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒哪株系、株系和？八卩株系反應(yīng)抗番茄斑萎病毒01317)單克隆抗體在該病毒檢測(cè)及檢疫上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)試劑盒。
[0015]本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株能大量分泌抗番茄斑萎病毒單抗，且其特異性強(qiáng)、效價(jià)高、穩(wěn)定性好。以該單抗為核心建立了檢測(cè)1317的高通量的血清學(xué)方法和檢測(cè)試劑盒，并可應(yīng)用于田間作物中1317含量的檢測(cè)，從而為我國(guó)番茄斑萎病毒的檢測(cè)、檢疫、早期監(jiān)測(cè)和預(yù)警、科學(xué)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。
[0016]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0017]一、雜交瘤細(xì)胞獲得及其單克隆抗體的制備
1.免疫原及檢測(cè)抗原的制備
1)將大研缽和組織攪拌器預(yù)冷；
2)稱取5008本氏煙病葉，每1008病葉中加入邱7.5的0.51磷酸鹽緩沖液(即？8緩沖液)20001 (含0.011版1-201'八和0.1%巰基乙醇),勻漿2分鐘后用雙層尼龍紗布過(guò)濾，濾液離心(600017111111, 20111111)去植物組織殘潘；
3)所得上清液邊攪拌邊滴加2.5% 11-1^011 乂-100，4% ？26 (分子量為6000)和0.111101/1 ^01, 41攪拌處以上；
4)離心(11000:^/111111，15111111)得沉淀；
5)沉淀用邱7.5的0.51 ？8 (含0.011 %012和0.51脲)充分洗滌，離心(6000^7111111, 15-11)后吸出上清置于離心管，沉淀再洗滌，離心反復(fù)3次；
6)合并上清液，超速離心(3300017111111,1000111)所得沉淀懸浮后離心 (800017111111,15111111)；
7)合并上清液再超速離心(3300017111111,100111111),離心管底部加有20%-30%鹿糖墊；
8)所得沉淀用邱7.5的0.51 ？8 (含0.011 %012?懸浮，懸浮液即為病毒提純液；
2.免疫動(dòng)物
用提純的番茄斑萎病毒的病毒粒子免疫四周齡體重18-208 8^18/0雌性小鼠。即番茄斑萎病毒的病毒粒子100147只與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0.2“每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0.2“每只，過(guò)3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。
[0018]細(xì)胞融合
取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞($2/0)按6:1的比例，在無(wú)血清的尺?11-1640培養(yǎng)基中混勻，1500印111離心5-11,去除培養(yǎng)基，用50 % ？26 (81^,分子量1500)作為融合劑，在371下水浴下加入101，使其融合2-11,用無(wú)血清的1？？11-1640培養(yǎng)基終止融合后1500印111離心5111111，沉淀用撤！'培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，371，5 % (?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0019]雜交瘤細(xì)胞、陽(yáng)性孔的篩選及其克隆
細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用撤I培養(yǎng)基換液一次，第10天用肌培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底5%-50%時(shí)，以感染13驟病毒的番茄葉片和提純病毒為檢測(cè)抗原包被，用常規(guī)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，共獲32個(gè)陽(yáng)性孔。選擇5個(gè)呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn)行有限稀釋法克隆，獲得I株能分泌抗TSWV的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株1A5。經(jīng)6個(gè)月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞株均能良好生長(zhǎng)，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。
[0020]單克隆抗體的特異性檢測(cè)
用感染鳶尾黃斑病毒、花生環(huán)斑病毒、西瓜銀色斑駁病毒、蕪菁花葉病毒、番茄花葉病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、水稻矮縮病毒、水稻條紋病毒、水稻齒葉矮縮病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系的病葉汁包被ELISA板，以相應(yīng)的健葉提取液作陰性對(duì)照，以番茄斑萎病毒的感染病葉為陽(yáng)性對(duì)照，用ACP-ELISA法測(cè)定單抗的特異性反應(yīng)。ACP-ELISA方法具體為上述病毒感染的病葉用液氮研磨成粉末，按1: 30 (w/v, g /mL)加入ELISA包被液研磨后10ul/孔包被ELISA板，4°C過(guò)夜或37°C 2小時(shí)使其吸附于ELISA板孔；PBST洗滌三次后用3%的脫脂奶粉或1% BSA或3%牛血清封閉30-60min ;加入適當(dāng)稀釋的單抗10ul/孔，370C 1-2小時(shí)；PBST洗滌三次后加入稀釋10000倍的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗(Sigma公司)10ul/孔，37°C 1-2小時(shí)；PBST洗滌四次后，用PNPP底物顯色，2moI/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD4tl5的值，以與陰性O(shè)D值比值大于2.1為陽(yáng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1A5單抗對(duì)TSWV有特異性反應(yīng)，而與鳶尾黃斑病毒、花生環(huán)斑病毒、西瓜銀色斑駁病毒、蕪菁花葉病毒、番爺花葉病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、水稻矮縮病毒、水稻條紋病毒、水稻齒葉矮縮病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系及健康植物均無(wú)免疫反應(yīng)。
[0021]單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入5-10 X 15個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000rpm離心3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取I倍體積腹水加2倍體積0.06 M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水)，室溫下邊加邊攪拌，4°C澄清I小時(shí)，12000rpm離心20min，收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小時(shí)，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4°C流動(dòng)透析24小時(shí)后即獲純化的腹水抗體，-70°C保存。
[0022]單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價(jià)測(cè)定
將純化的單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C小鼠IgG1、IgG2aUgG2bUgG3^IgM抗體作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果為1A5單抗亞類為IgGUkappa鏈。用間接ELISA方法檢測(cè)單抗腹水效價(jià)，檢測(cè)結(jié)果表明上述單抗腹水效價(jià)在1 一8。
[0023]二、病毒免疫學(xué)檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒
1.dot-ELISA方法的建立及其田間植物樣品檢測(cè)應(yīng)用
將番茄葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10-30 (w/v，g /1^)加入0.01 mol/L PBS(pH7.4)后研磨；病汁液5000 rpm離心3 min;取3 μ I上清點(diǎn)到硝酸纖維素膜(NC)上，同時(shí)設(shè)置健康和感病番茄葉汁分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照；室溫干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30min ；NC膜放入適度稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min ;用PBST洗膜3-4次，每次3 min ；NC膜放入適度稀釋的八？酶標(biāo)記羊抗鼠I姊二抗中室溫孵育30-60 111111； ？881洗膜4-5次，每次 3 111111； 66 111 咄I 和 33 11 I 801？底物職)加入到 10 1111 底物緩沖液(0.1 11101/
I 11-18 01,0.1 11101/1 ^01,0.025 11101/1^9.5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果。待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯，而陰性沒(méi)有任何顯色時(shí)自來(lái)水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。
[0024]用方陣試驗(yàn)確定檢測(cè)番茄病葉的單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗(yàn)表明1八5單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:5000和1:8000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測(cè)1317病葉的方法。靈敏度分析表明，當(dāng)番茄葉片稀釋到1:10240倍(界八，時(shí)，以1八5單抗建立的(1於-此檢測(cè)仍呈現(xiàn)紫色的陽(yáng)性斑點(diǎn)，即其檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:10240倍稀釋(圖0。
[0025]用建立的方法對(duì)2013年采自田間樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，532個(gè)樣品中有35個(gè)樣品產(chǎn)生紫色的陽(yáng)性斑點(diǎn)(圖2?。陽(yáng)性樣品進(jìn)一步用奶-？0？分析，結(jié)果表明所有的陽(yáng)性樣品均檢測(cè)到1317特異性的產(chǎn)物，？⑶產(chǎn)物核酸測(cè)序表明陽(yáng)性樣品感染1317。說(shuō)明該方法能準(zhǔn)確、可靠地用于植物樣品中1317的檢測(cè)。
[0026]2.以單抗為核心建立的抗原包被￡113八(八⑶-此〗“)方法檢測(cè)植物樣品中的丁層V
方法的操作步驟:
(1)用0.051碳酸鹽緩沖液(邱9.6)^1: 30 (界八，8 /此)倍稀釋的病葉汁液100111/孔加入此13八板，以13驟番茄病葉和健康番茄分別為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，371 2匕或41過(guò)夜；
(2)？881洗滌后用5%脫脂奶粉封閉300111 ；
(3)單抗腹水5000倍稀釋后100111/孔，371比；
(4)？881洗滌后加入5000倍稀釋的堿性磷酸脂酶(八？)標(biāo)記的羊抗鼠I姊二抗(31 卿￡1), 100111/ 孔，37。。，1匕；
(5)用？831洗滌后加入硝基磷酸鹽底物100111/孔，室溫30-11；
(6)用肉眼觀察，底物顏色變成黃綠色的孔為陽(yáng)性，用2001/1氫氧化鈉酸終止反應(yīng)后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)00405值，以9/心2.1作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
[0027]方法檢測(cè)靈敏度檢測(cè)
單抗腹水工作濃度為5000倍稀釋，對(duì)病葉從1:10至81920作倍比稀釋，以相應(yīng)稀釋度的健葉汁液作陰性對(duì)照，進(jìn)行上述八八方法檢測(cè)。結(jié)果表明八方法對(duì)1:10?20480倍稀釋的病葉汁液仍呈陽(yáng)性反應(yīng)，即對(duì)檢測(cè)病葉的靈敏度可達(dá)到1:20480，，表明八方法具有高度的靈敏性和可靠性。
[0028]檢測(cè)13驟的1八3-此檢測(cè)方法 1^8-2118^方法的操作流程:
1)1:5000倍稀釋的抗的兔抗血清(由純化的原核表達(dá)免疫兔子制備)100111/孔包被聚苯乙烯板，3700，2-處或41，過(guò)夜；
2)^881洗滌三次后加1-10%的脫脂奶粉或1-3%88^或3-6%牛血清封閉200111/孔于 37。〇封閉 30-60111111
3)加入檢測(cè)樣品100111/孔。以1317病葉為陽(yáng)性對(duì)照，以相應(yīng)的健康樣品為陰性對(duì)照，37°C l-2h ；
4)洗滌后用封閉液稀釋5000倍的單抗腹水10ul/孔，37°Cl_2h
5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋的AP標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗(Sigma) 10ul/孔，37°C
l-2h
6)PBST洗滌后加PNPP底物于室溫顯色30min，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色的孔為陽(yáng)性，2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用680型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)405nm的OD值，以P/N>
2.1作為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。。
[0029]TAS-ELISA檢測(cè)方法最適條件的確定:
采用TAS-ELISA方陣試驗(yàn)進(jìn)行，即橫向分別加用包被緩沖液從1: 100至1: 102400倍比稀釋的兔抗TSWV血清；加入TSWV病葉汁；縱向分別加用封閉液從1: 5至1:2048000倍比稀釋單抗腹水；AP標(biāo)記的兔抗鼠IgG二抗按Sigma公司說(shuō)明書稀釋，I: 10000倍；按TAS-ELISA方法流程進(jìn)行操作。結(jié)果為TSWV的兔抗血清及單抗的最適稀釋度分別為I: 5000、I: 8000。
[0030]TAS-ELISA方法檢測(cè)靈敏度的確定
在兔抗血清和單抗腹水最適工作濃度下，將TSWV病葉汁用PBS倍比稀釋后進(jìn)行TAS-ELISA測(cè)定，結(jié)果為:TAS-ELISA檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:81920倍稀釋(w/v，g /mL)，說(shuō)明本方法具有很好的靈敏度。
[0031]番茄斑萎病毒dot-ELISA檢測(cè)試劑盒
1)試劑盒主要成分:
TSffV單克隆抗體I管0.2 ml
AP標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗I管0.1 ml
NBT/BCIP底物各I瓶分別為2 ml和Iml
陽(yáng)性對(duì)照(含TSWV番茄葉汁)I管2 ml
陰性對(duì)照(健康番茄葉汁) I管2 ml
抗體稀釋液(1X) I瓶80ml
以上試劑均保存于4°C下硝酸纖維素膜(NC) 10張
2)檢測(cè)番茄樣品的操作步驟:
a.將葉片稱重后用液氮研磨成粉末,按1:10?30(w/v,g /mL)加入0.01 mol/L PBS(PH7.4)后研磨；
b.病汁液5000rpm離心3 min;
c.取3μ I上清點(diǎn)到NC上，同時(shí)設(shè)置健康和感病番茄葉汁分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照，室溫干燥10-20 min;
d.NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ；
e.NC膜放入1:3000倍稀釋的單抗中室溫孵育30?60 min ；
f.用PBST洗膜3?4次，每次3min ； NC膜放入1:8000稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗中室溫孵育30?60 min;
g.PBST洗膜4?5次，每次3 min; 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10 ml底物緩沖液(0.1 11101/1 11-18 01,0.1 11101/1 ^01,0.025 11101/1 1甙1、邱9.5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；
11.待陽(yáng)性對(duì)照顯色明顯(紫色),而陰性沒(méi)有任何顯色時(shí)自來(lái)水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。
[0032]3)保存及有效期
于2?81避光保存，有效期12個(gè)月。
[0033]4)緩沖液配方:
磷酸鹽緩沖液$83,0.01 001/1,邱7.4):
就18 8
1(010.2 8
^2？040.2 8
恥2腦4魯12?。?038
疊氮化鈉0.2 8
加蒸餾水950溶解后調(diào)邱至7.4，定容至1000 211“ 洗滌液(0.01 11101/1 ？881?:
1000 1111 0.0111101/1 ？88 中加 0.5 1111 I'界6611-20
￡[13八封閉液:
0.01 001/1 ？831'中加入脫脂奶粉至終濃度5% (秦。
【權(quán)利要求】
1.一種分泌抗番茄斑萎病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株1A5，其特征在于能分泌抗番茄斑萎病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細(xì)胞株1A5于2014年7月3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC N0.9343。
2.一種如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株1A5分泌的抗番茄斑萎病毒的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體腹水ELISA效價(jià)達(dá)10_8,抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體檢測(cè)病葉的靈敏度達(dá)到1:81920倍稀釋。
3.—種如權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株1A5分泌的抗番茄斑萎病毒的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體僅與番茄斑萎病毒有特異性反應(yīng)，而不與鳶尾黃斑病毒、花生環(huán)斑病毒、西瓜銀色斑駁病毒、蕪菁花葉病毒、番茄花葉病毒、煙草花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、水稻矮縮病毒、水稻條紋病毒、水稻齒葉矮縮病毒、小麥黃花葉病毒、大麥黃花葉病毒、大麥黃矮病毒GAV株系、GPV株系和PAV株系反應(yīng)。
4.一種如權(quán)利要求2所述的抗番茄斑萎病毒的單克隆抗體在該病毒檢測(cè)及檢疫上的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測(cè)方法和免疫學(xué)檢測(cè)試劑盒。
【文檔編號(hào)】C12N5/20GK104450623SQ201410627331
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月10日
【發(fā)明者】吳建祥, 周雪平, 謝艷, 李娜 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)