本申請包含一個計算機可讀形式的序列表。該計算機可讀形式通過引用的方式合并入本文。對生物材料保藏的引用本申請包含對生物材料保藏的引用，該保藏通過引用的方式合并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)及其應(yīng)用，具體涉及一種具有分解蛋白質(zhì)性能的棒狀桿菌、生產(chǎn)方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：剩余污泥與乳制品廢水等廢物/廢水中含有豐富的蛋白質(zhì)，但由于其分子量過大而不能直接被微生物用于發(fā)酵，需要對此類廢物/廢水進行水解強化，將蛋白質(zhì)等大分子轉(zhuǎn)化為較易利用的小分子。大量研究表明，堿性條件能夠促進水解，溶出更多的胞外聚合物(extracellularpolymericsubstance,EPS)，并促進EPS等大分子轉(zhuǎn)化為小分子。具有水解發(fā)酵功能的厭氧微生物是發(fā)酵過程順利進行的重要保障，而堿性水解發(fā)酵會對剩余污泥中原有微生物的發(fā)酵能力產(chǎn)生負面影響，從而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物回收效率降低。因此，研究在堿性條件下能高效分解蛋白質(zhì)的菌株具有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是堿性水解發(fā)酵會對剩余污泥中原有微生物的發(fā)酵能力產(chǎn)生負面影響，從而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物回收效率降低，目的在于提供一種具有分解蛋白質(zhì)性能的棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6CGMCCNo.12827、生產(chǎn)方法及其應(yīng)用，在堿性條件下，通過所述棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6處理含蛋白質(zhì)廢物/廢水，可以在缺厭氧條件下同時實現(xiàn)蛋白質(zhì)的有效去除和固體減量，且成本低，效率穩(wěn)定。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種具有分解蛋白質(zhì)性能的棒狀桿菌，為棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6CGMCCNo.12827，所述菌株SPH6的核苷酸序列為SEQIDNO:1所示。一種所述的具有分解蛋白質(zhì)性能的棒狀桿菌的生產(chǎn)方法，所述棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6是從污泥中取樣，經(jīng)馴化、分離及純化制得。優(yōu)選地，一種具有分解蛋白質(zhì)性能的棒狀桿菌的生產(chǎn)方法，具體步驟包括：步驟1，富集：取污泥樣本，接種至裝有富集培養(yǎng)液的容器中，對容器進行密封處理，形成缺厭氧環(huán)境，制成菌種源，然后，取菌種源接種至裝有富集培養(yǎng)液的容器中進行培養(yǎng)，依次進行重復(fù)轉(zhuǎn)接；步驟2，分離純化：挑取出所述步驟1轉(zhuǎn)接后的培養(yǎng)液，在篩選培養(yǎng)基上反復(fù)劃線分離純化，直至獲得單菌落作為初篩菌種；所述富集培養(yǎng)液的組分包括氯化鈉、蛋白胨和酵母膏；所述篩選培養(yǎng)基的組分包括：脫脂牛奶、酵母膏、氯化鈉、無水硫酸鎂、硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、瓊脂粉和微量元素溶液；所述微量元素溶液的組分包括：硫酸亞鐵、五水合硫酸銅、十二水合硫酸鋁鉀、硼酸、四水合七鉬酸銨、無水氯化鈣、七水合硫酸鋅、七水合硫酸鈷和一水合硫酸錳。一種所述的具有分解蛋白質(zhì)性能的棒狀桿菌的應(yīng)用，所述棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6用于在堿性條件下進行蛋白質(zhì)的分解。所述棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6的生長細胞、細胞懸浮液等能在堿性條件下(pH＝9～11)分別以蛋白質(zhì)為氮源，進行蛋白質(zhì)的分解。一種所述的具有分解蛋白質(zhì)性能的棒狀桿菌的應(yīng)用，所述棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6用于在堿性條件下分解廢水或廢物中的蛋白質(zhì)。通過在富含蛋白質(zhì)的廢物或廢水中加入棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6，并且進行缺厭氧處理，即可實現(xiàn)廢物或廢水中蛋白質(zhì)的分解。優(yōu)選地，所述的具有分解蛋白質(zhì)性能的棒狀桿菌的應(yīng)用，具體步驟包括：步驟1，富集培養(yǎng)所述棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6；步驟2，將所述步驟1中富集培養(yǎng)的棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6以1～10％的接種量接種至含蛋白質(zhì)的廢物或廢水中，所述棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6利用廢物或廢水中的有機物質(zhì)對蛋白質(zhì)進行分解。優(yōu)選地，所述步驟2中，將接種有含蛋白質(zhì)的廢物或廢水的溫度控制為25～45℃。優(yōu)選地，所述步驟2中，將接種有含蛋白質(zhì)的廢物或廢水的pH值調(diào)節(jié)為8.0～13.0。優(yōu)選地，所述步驟2中，將接種有含蛋白質(zhì)的廢物或廢水進行攪拌處理，所述攪拌處理的轉(zhuǎn)速控制為70～100rpm。一種所述的具有分解蛋白質(zhì)性能的棒狀桿菌的應(yīng)用，所述棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6作為主要活性成分用于制備微生物菌劑。以棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6為主要活性物質(zhì)的菌劑制備，應(yīng)用領(lǐng)域包括但不限于本發(fā)明所述的含蛋白質(zhì)的廢水/廢物的處理。本發(fā)明提供的棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6，已于2016年08月08日，在北京保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其簡稱為CGMCC，保藏編號為No.12827。保藏單位的地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。棒狀桿菌的鑒定：所述棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6是從四川省成都市西航港污水處理廠貯泥池取樣，經(jīng)富集、分離、純化得到的一株革蘭氏陽性菌。所述棒狀桿菌菌株具有以下特征：(1)所述菌株的16SrRNA基因具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，在Genbank中的登錄號為KP276149，序列長度為1379bp；(2)所述菌株的形態(tài)特征：所述棒狀桿菌菌株在30～40℃溫度條件下，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)36～72h后，菌落凸起，全緣光滑，通過革蘭氏染色后在顯微鏡下成陽性，菌體呈短桿狀，大小為(0.4～1.1)μm×(0.7～2.1)μm，柵狀排列，沒有芽孢；(3)所述棒狀桿菌的部分生理生化特征：接觸酶反應(yīng)結(jié)果為陽性，氧化酶、脲酶反應(yīng)結(jié)果為陰性，VP結(jié)果呈陽性，能夠在8％的鹽度條件下生長。將純種菌株送交中國科學院微生物研究所進行鑒定，測序結(jié)果見SEQIDNO:1所示，根據(jù)細菌細胞形態(tài)、生理生化特征、基因序列等綜合分析，參考《伯杰氏系統(tǒng)細菌手冊》及InternationalJournalofSystematicandEvolutionaryMicrobiology有關(guān)研究論文，最終鑒定菌株為棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)，命名為SPH6。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果：本發(fā)明一種具有分解蛋白質(zhì)性能的棒狀桿菌、生產(chǎn)方法及其應(yīng)用，所述的棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SPH6能夠高效的分解蛋白質(zhì)、處理含蛋白質(zhì)廢物/廢水，成本低，效率穩(wěn)定，并且可以在缺厭氧條件下同時實現(xiàn)蛋白質(zhì)的有效去除和固體減量。附圖說明此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明實施例的進一步理解，構(gòu)成本申請的一部分，并不構(gòu)成對本發(fā)明實施例的限定。在附圖中：圖1為本發(fā)明菌株SPH6的掃描電鏡圖；圖2為實驗組和對照組分解蛋白質(zhì)的OD600曲線圖；圖3為實驗組和對照組分解蛋白質(zhì)的COD曲線圖；圖4為實驗組和對照組分解蛋白質(zhì)的氨氮濃度曲線圖；圖5為實驗組和對照組分解蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)濃度曲線圖；圖6為實驗組和對照組處理污泥的COD曲線圖；圖7為實驗組和對照組處理污泥的蛋白質(zhì)濃度曲線圖；圖8為不同接種量對菌株SPH6的比降解速率的影響曲線圖；圖9為不同溫度對菌株SPH6的比降解速率的影響曲線圖；圖10為不同pH值對菌株SPH6的比降解速率的影響曲線圖；圖11為不同轉(zhuǎn)速對菌株SPH6的比降解速率的影響曲線圖。具體實施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合實施例和附圖，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對本發(fā)明的限定。實施例1一種具有分解蛋白質(zhì)性能的棒狀桿菌的生產(chǎn)方法，具體步驟如下：步驟1，從四川省成都市西航港污水處理廠貯泥池取樣，接種到裝有100mL富集培養(yǎng)液的250mL錐形瓶中，每1L富集培養(yǎng)液含氯化鈉10g、蛋白胨10g、酵母膏5g，富集培養(yǎng)液的pH值為7.0左右，最后用玻璃塞塞好瓶口，并用封口膜封好；步驟2，以步驟1制備菌液為菌種源，取出10mL接種至新鮮的裝有100mL富集培養(yǎng)液的錐形瓶中，培養(yǎng)條件相同，每隔5d轉(zhuǎn)接一次；步驟3，所述步驟2中轉(zhuǎn)接3次后，用接種環(huán)挑取培養(yǎng)液，在篩選培養(yǎng)基上劃線分離。篩選培養(yǎng)基的成分為：每篩選培養(yǎng)基1L含脫脂牛奶10mL、酵母膏3g、氯化鈉0.5g、無水硫酸鎂0.5g、硫酸銨6.7g、磷酸氫二鉀1.2g、磷酸二氫鉀0.7g、瓊脂粉20g和微量元素溶液1mL；用3mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)篩選培養(yǎng)液的pH值為9.0～10.0；所述的微量元素溶液的成分為(g/L)：硫酸亞鐵0.01g、五水合硫酸銅0.01g、十二水合硫酸鋁鉀0.018g、硼酸0.01g、四水合七鉬酸銨0.01g、無水氯化鈣0.07g、七水合硫酸鋅0.18g、七水合硫酸鈷0.2g和一水合硫酸錳0.26g，所述微量元素溶液的pH值為5.5；步驟4，從平板上挑選形狀不同的菌落反復(fù)劃線純化，并進行顯微鏡觀察直至獲得單菌落作為初篩菌種。由此分離出一株高效的具有堿性蛋白質(zhì)分解能力的棒狀桿菌，命名為SPH6。對菌株SPH6的掃面電鏡圖如圖1所示，菌體呈短桿狀，大小為(0.4～1.1)μm×(0.7～2.1)μm，沒有芽孢。實施例2棒狀桿菌菌株SPH6對蛋白質(zhì)分解能力測定：將實施例1制備的菌株SPH6接種于裝有120mL富集培養(yǎng)基(已滅菌)的錐形瓶中，于30℃、80rpm、pH值為7.0的條件下培養(yǎng)24h，再于30℃、8rpm、pH值為10.0的條件下培養(yǎng)48h。富集培養(yǎng)基的成分為(g/L)：氯化鈉10g、蛋白胨10g和酵母膏5g。培養(yǎng)后，在4000rpm條件下離心15min，棄去上清液后以無菌水重懸三次，以獲得富集的棒狀桿菌菌株SPH6。將富集后的棒狀桿菌菌株SPH6以5％的接種量接種至一個裝有250mL以蛋白質(zhì)作為唯一氮源的測試培養(yǎng)基(已滅菌)的錐形瓶中，控制pH值為9.0～10.0，30℃、80rpm條件下培養(yǎng)，考察菌株SPH6對蛋白質(zhì)的分解能力，同時設(shè)置未接種的培養(yǎng)液作為對照組。蛋白質(zhì)分解能力測試培養(yǎng)基的成分為(g/L)：牛血清白蛋白0.6g、葡萄糖5g、氯化鈉0.5g、無水硫酸鎂0.5g、硫酸銨0.6g、磷酸氫二鉀1.2g、磷酸二氫鉀0.7g和微量元素溶液1mL，用3mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為9.0～10.0。微量元素溶液的成分為(g/L)：硫酸亞鐵0.01g、五水合硫酸銅0.01g、十二水合硫酸鋁鉀0.018g、硼酸0.01g、四水合七鉬酸銨0.01g、無水氯化鈣0.07g、七水合硫酸鋅0.18g、七水合硫酸鈷0.2g和一水合硫酸錳0.26g，pH值為5.5。試驗過程中，樣品經(jīng)8000rpm和4℃離心10min，每隔1d取上清液測定OD600、溶解性COD(快速消解法)、氨氮(納氏試劑分光光度法)、蛋白質(zhì)(Lowry法)含量，并與未接種的培養(yǎng)液的值進行對照。綜合比較圖2～5中所示對照組(未接種菌株SPH6)與實驗組(接種菌株SPH6)的結(jié)果，可得，隨著菌株SPH6的生長，培養(yǎng)基中的碳源和氮源逐漸被消耗，說明SPH6具有分解蛋白質(zhì)的能力。實施例3棒狀桿菌菌株SPH6處理污泥測定：將實施例2富集培養(yǎng)后的菌株SPH6以10％的接種量接種至污泥中，在溫度為37.5℃，pH值為10.5，轉(zhuǎn)速為80rpm的條件下培養(yǎng)3d。設(shè)置控制和平行實驗。污泥初始性質(zhì)：pH值為6.36，MLSS為15.49g/L，MLVSS為10.25g/L，SCOD為206mg/L，TCOD為16060mg/L，蛋白質(zhì)含量為52.3mg/L。以一定時間間隔取樣，測定溶解性COD和蛋白質(zhì)的含量。綜合比較圖6～7中所示(未接種菌株SPH6)與實驗組(接種菌株SPH6)的結(jié)果，可得，整個實驗過程中，實驗組的SCOD溶出量是對照組的2倍，蛋白質(zhì)溶出量是對照組的1.5倍。說明SPH6能夠促進污泥中有機物質(zhì)(特別是蛋白質(zhì))的溶出。棒狀桿菌菌株SPH6處理富含蛋白質(zhì)廢水的能力測定：將實施例2富集培養(yǎng)后的棒狀桿菌菌株SPH6以1～10％的接種量接種至250mL含有蛋白質(zhì)的人工配水廢水中。在溫度為25～45℃，pH值為8.0～13.0，轉(zhuǎn)速為70～100rpm的條件下培養(yǎng)84h。設(shè)置控制和平行試驗。人工配水廢水的成分(g/L)為：牛血清白蛋白0.6g、葡萄糖5g、氯化鈉0.5g、無水硫酸鎂0.5g、硫酸銨0.6g、磷酸氫二鉀1.2g、磷酸二氫鉀0.7g和微量元素溶液1mL，用3mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為9.0～10.0。微量元素溶液的成分為(g/L)：硫酸亞鐵0.01g、五水合硫酸銅0.01g、十二水合硫酸鋁鉀0.018g、硼酸0.01g、四水合七鉬酸銨0.01g、無水氯化鈣0.07g、七水合硫酸鋅0.18g、七水合硫酸鈷0.2g和一水合硫酸錳0.26g，pH值為5.5。其中以一定時間為間隔取樣，測定OD600、溶解性COD、牛血清白蛋白(BSA)以及氨氮的含量用于計算比降解速率(q)。整個試驗過程中菌株SPH6的比降解速率(q)最大可達0.0238mg/(mgcells·h)。操作參數(shù)接種量、溫度、pH值和轉(zhuǎn)速對菌株SPH6處理蛋白質(zhì)廢水的影響因素測定具體實施方案如實施例4～21所示：表1實施例4～21中菌株SPH6處理蛋白質(zhì)廢水的影響因素實施例接種量(％)溫度(℃)pH值轉(zhuǎn)速(rpm)45.5％37.588055.5％37.59.28065.5％37.510.58075.5％37.511.78085.5％37.5138095.5％2510.580105.5％32.510.580115.5％37.510.580125.5％4510.580135.5％37.510.570145.5％37.510.580155.5％37.510.590165.5％37.510.510017137.510.580183.237.510.580195.537.510.580207.837.510.580211037.510.580綜合考察圖8～11的結(jié)果，可得，隨著接種量、溫度、pH值和轉(zhuǎn)速的增加，菌株SPH6的比降解速率均呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，并且，在實驗條件范圍內(nèi)，比降解速率達到最大的最優(yōu)條件是接種量為5.5％、溫度為37.5℃、pH值為10.5、轉(zhuǎn)速為80rpm。以上所述的具體實施方式，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進行了進一步詳細說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>四川大學<120>一種具有分解蛋白質(zhì)性能的棒狀桿菌、生產(chǎn)方法及其應(yīng)用<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>1379<212>DNA<213>棒狀桿菌（Corynebacteriumsp.）<400>1acatgcagtcgaacggaaaggccccgcttgcggggtactcgagtggcgaacgggtgagta60acacgtgggtgatctgccctgcacttcgggataagcctgggaaactgggtctaataccgg120ataggacccctctttagtgtggggggtggaaagttttttcggtgtgggatgagcccgcgg180cctatcagcttgttggtggggtaatggcctaccaaggcgtcgacgggtagccggcctgag240agggtggacggccacattgggactgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtg300gggaatattgcacaatgggcggaagcctgatgcagcgacgccgcgtgggggatgacggcc360ttcgggttgtaaacctctttcgctagggacgaagcttttgtgacggtacctagataagaa420gcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttgtccgga480attactgggcgtaaagagctcgtaggtggtttgtcgcgtcgtctgtgaaattccggggct540taacttcgggcgtgcaggcgatacgggcaatacttgagtgctgtaggggagactggaatt600cctggtgtagcggtggaatgcgcagatatcaggaggaacaccgatggcgaaggcaggtct660ctgggcagtaactgacgctgaggagcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccct720ggtagtccatgccgtaaacggtgggcgctaggtgtaggggtcttccacgacttctgtgcc780gtagctaacgcattaagcgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaagg840aattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaaga900accttacctgggcttgacatacaccggaccgggccagagatggtctttcccttgtggctg960gtgtacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccg1020caacgagcgcaacccttgtcttatgttgccagcacgtagtggtggggactcatgagagac1080tgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtcc1140agggcttcacacatgctacaatggtcggtacaacgcgttgcgacactgtgaggtggagct1200aatcgctgaaagccggcctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcgg1260agtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacac1320accgcccgtcacgtcatgaaagttggtaacacccgaagccagtggcccaacccttgtgg1379當前第1頁1 2 3