專利名稱：以角質(zhì)層中的氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)的角質(zhì)層的透明性·保水性的評價方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以角質(zhì)層中的氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)的角質(zhì)層的透明性·保水性的評價方法；以角質(zhì)層的透明性·保水性為指標(biāo)的角質(zhì)層中的蛋白質(zhì)的氧化度的檢測方法；進(jìn)而涉及通過抑制角質(zhì)層中的蛋白質(zhì)的氧化來保持、提高角質(zhì)層的透明性·保水性的方法。
背景技術(shù)：
從進(jìn)行用于維持更健康皮膚的正確的皮膚護(hù)理的觀點出發(fā)，正確把握膚質(zhì)(或皮膚狀態(tài))是很重要的。因此，在用化妝品進(jìn)行皮膚護(hù)理時，人們通過例如向美容技術(shù)者問診等來評價化妝品使用者的膚質(zhì)。另外，為了客觀地評價膚質(zhì)，也使用各種測量儀器，根據(jù)觀察或測定出的參數(shù)來評價皮膚狀態(tài)或機(jī)能。
近年來，鑒于皮膚與隨著年齡增長的老化、光老化的關(guān)系，角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的研究日益盛行。作為主要的氧化蛋白質(zhì)，是受到氧化而結(jié)果導(dǎo)入了羰基的蛋白質(zhì)，一般包括，蛋白質(zhì)中的稱作Lys、Arg、Pro的氨基酸殘基的NH2基直接氧化形成羰基而生成的物質(zhì)；和脂質(zhì)氧化成過氧化脂質(zhì)，進(jìn)一步分解成活性高的醛，其與蛋白質(zhì)結(jié)合而生成的物質(zhì)。對氧化蛋白質(zhì)與老化相關(guān)的研究逐漸豐富，人們認(rèn)識到在老化(腦、肝、成纖維細(xì)胞)、阿爾茨海默氏病、早老癥(Werner綜合征)等中，氧化蛋白質(zhì)增加。
可以認(rèn)為，在皮膚中，皮膚表面的皮脂被自由基氧化而生成過氧化脂質(zhì)，由此使得蛋白質(zhì)開始氧化，過氧化脂質(zhì)一旦生成，氧化便連鎖地進(jìn)行，不僅僅對肌膚表面造成刺激，而且直至角質(zhì)層深處、對細(xì)胞造成損害。因此，為了對皮膚的氧化蛋白質(zhì)的性狀例如存在量、分布狀態(tài)等進(jìn)行評價，把握膚質(zhì)或皮膚狀態(tài)，然后確定皮膚護(hù)理法的策略、選擇化妝品，人們期待可以以任意的形式應(yīng)用其評價結(jié)果。但是，現(xiàn)在雖然預(yù)測到氧化蛋白質(zhì)與皮膚的損傷之間存在著不清楚的關(guān)系，但是尚未明確角質(zhì)層蛋白質(zhì)的氧化對皮膚的性狀實際上有怎樣的影響。

發(fā)明內(nèi)容
人們已經(jīng)預(yù)測到如果能夠?qū)⑵つw上存在的氧化蛋白質(zhì)的評價結(jié)果用于膚質(zhì)的改善等，則在皮膚學(xué)·化妝學(xué)方面是非常有用的，例如可以成為在近年的化妝品業(yè)界等中進(jìn)行的適當(dāng)?shù)钠つw護(hù)理法等的以建議為目的的提供咨詢服務(wù)的有利手段。
本發(fā)明者鑒于上述事實，研究了角質(zhì)層蛋白質(zhì)對皮膚性狀的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著角質(zhì)層蛋白質(zhì)的氧化的進(jìn)行，角質(zhì)層的保水性和透明性消失。雖然可以在一定程度上預(yù)測出由于紫外線的照射、干燥、老化等的原因，角質(zhì)層的保水性·透明性喪失，但是角質(zhì)層的保水性·透明性的下降與角質(zhì)層蛋白質(zhì)的氧化相關(guān)是本發(fā)明者首次發(fā)現(xiàn)的事實，該事實的查明從皮膚學(xué)、化妝品學(xué)的角度出發(fā)，是非常有意義的。
因此，基于上述事實的查明，本發(fā)明的第一觀點，是提供一種以角質(zhì)層中的氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)的用于評價角質(zhì)層的透明性和/或保水性的方法。在優(yōu)選的方式中，角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的檢測是通過對從皮膚取出的角質(zhì)層樣品中的氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)記，檢測該熒光來進(jìn)行的。氧化蛋白質(zhì)的羰基的特異的熒光標(biāo)記，優(yōu)選通過對氧化蛋白質(zhì)使用含有肼基的熒光物質(zhì)例如熒光素-5-氨基硫脲、德克薩斯紅酰肼(texas redhydrazide)等來進(jìn)行。
從其他觀點出發(fā)，本發(fā)明提供一種以角質(zhì)層的透明性和/或保水性為指標(biāo)的用于檢測角質(zhì)層中的蛋白質(zhì)的氧化度的方法。
進(jìn)而，本發(fā)明提供一種通過抑制角質(zhì)層中的蛋白質(zhì)的氧化來保持·提供角質(zhì)層的透明性和/或保水性的方法。
通過明確角質(zhì)層蛋白質(zhì)的氧化對肌膚的影響，可以提供以角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)的皮膚護(hù)理方法。


圖1是顯示丙烯醛處理導(dǎo)致的豬皮角質(zhì)層水分保持力下降的圖表。
圖2是顯示丙烯醛處理導(dǎo)致的豬皮角質(zhì)層水分保持力下降的圖表。
圖3是顯示次氯酸(20mM、1hn)引起的豬皮角質(zhì)層水分保持力下降的圖表。
圖4是顯示次氯酸處理導(dǎo)致的人胳膊皮膚角質(zhì)層水分保持力下降的圖表。
圖5是顯示丙烯醛處理導(dǎo)致的豬皮角質(zhì)層透明性下降的圖表。
具體實施例方式
在第一觀點中，提供一種以角質(zhì)層中的氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)的用于評價角質(zhì)層的透明性和/或保水性的方法。
如果角質(zhì)層或肌膚的“透明性”高，則肌膚顯示宛如透明的狀態(tài)，在美容上顯示非常好的外觀。另外，在角質(zhì)層或肌膚的“保水性”高的皮膚中，肌膚處于嬌嫩、濕潤的健康的狀態(tài)。因此，在美容學(xué)上，肌膚具有“透明性”·“保水性”是非常重要的，一般來說，角質(zhì)層、肌膚的“透明性”、“保水性”是通過美容技術(shù)者等的美容專家的主觀的感觀試驗、需要麻煩的操作、昂貴的裝置·設(shè)備的皮膚樣品的光學(xué)檢查、水分檢查等來進(jìn)行的。本發(fā)明通過以角質(zhì)層中的氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)，更詳細(xì)地說，通過檢測角質(zhì)層中的氧化蛋白質(zhì)的存在量、分布狀態(tài)等，可以用更簡單且客觀的手段來研究角質(zhì)層、以及肌膚的“透明性”·“保水性”。
人們進(jìn)行了大量的關(guān)于角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的研究，也已知其各種各樣的檢測方法。在本發(fā)明中，對角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的檢測方法沒有特別的限定，可以利用本領(lǐng)域周知的各種方法。例如，J.J.Thiele et al.FEBS Letter1998 Feb 6，422(3)，403-406中記載的角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的檢測方法，是通過將膠帶粘附在皮膚表層上，并進(jìn)行剝離即所謂的膠帶剝離操作，來獲得粘附有角質(zhì)層的膠帶(“膠帶角質(zhì)層”)，用ELISA檢測氧化蛋白質(zhì)的方法。J.J.Thiele et al.J.Invest.Dermatol.1999Sep.113(3)，335-359中記載的方法，是通過從膠帶角質(zhì)層中提取蛋白質(zhì)，對可溶性成分進(jìn)行DNPH標(biāo)記，實施SDS-PAGE，使用抗DNP抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，來進(jìn)行氧化蛋白質(zhì)的檢測。C.S.Sander et al.J.Invest.Dermatol.2002，Apr，118(4)，618-625中記載的方法，是通過用DNPH標(biāo)記人皮膚組織切片，用抗DNP進(jìn)行染色，來檢測氧化蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明的優(yōu)選的方式中，角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的檢測是通過對從皮膚取出的角質(zhì)層樣品中的氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)記，檢測該熒光來進(jìn)行的。該檢測可以在熒光顯微鏡下進(jìn)行。氧化蛋白質(zhì)的羰基的特異的熒光標(biāo)記，優(yōu)選通過對氧化蛋白質(zhì)使用含有肼基的熒光物質(zhì)例如熒光素-5-氨基硫脲、德克薩斯紅酰肼等來進(jìn)行。根據(jù)該方法，通過例如對由熒光顯微鏡獲得的檢測結(jié)果進(jìn)行圖像化，可以簡易地獲得皮膚角質(zhì)層的氧化蛋白質(zhì)在皮膚上的性狀的二維信息，可以謀求在例如化妝品等的銷售時的咨詢服務(wù)時應(yīng)用該氧化蛋白質(zhì)的信息。
在本發(fā)明中，來源皮膚的角質(zhì)層樣品，可以是來源身體的任一部分的樣品，另外，可以是這樣的樣品(組織或細(xì)胞)的培養(yǎng)物。作為該樣品的來源的身體的部位或區(qū)域的典型例，可以列舉出，臉的臉頰、額頭、指甲和軀干等。
這樣的樣品可以通過所謂的外科手段等的侵入方法而得到，但是，在特別是以評價膚質(zhì)為目的的情況下，為了簡便，優(yōu)選通過非侵入式方法從皮膚中取得。作為非侵入式方法，可以列舉出例如，該技術(shù)領(lǐng)域中常用的膠帶剝離、擦拭法等。
由于膠帶剝離通過在皮膚表面粘附膠帶片，并實施剝離，可以將皮膚的二維狀態(tài)直接轉(zhuǎn)印到該膠帶上，所以在本發(fā)明中是特別優(yōu)選的。如果通過膠帶剝離來采取膠帶角質(zhì)層、不進(jìn)行裁斷、以保持原樣的狀態(tài)對氧化蛋白質(zhì)進(jìn)行特異的熒光染色，則可以得到對應(yīng)于實際的皮膚的二維性狀的氧化蛋白質(zhì)的二維信息。
膠帶剝離的優(yōu)選方法是，首先，將皮膚表層用例如酒精等進(jìn)行凈化來消除皮脂、污漬等，將切成合適尺寸(例如5×5cm)的膠帶片輕輕地放在皮膚表面上，對整個膠帶施加均勻的力，壓平，然后用均勻的力將膠帶剝離。膠帶可以是市售的玻璃紙膠帶等，例如可以使用ScotchSuperstrength Mailing Tape(3M公司制)等。
本發(fā)明的優(yōu)選的方式中可利用的對氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)記的熒光物質(zhì)，優(yōu)選為具有可與氧化蛋白質(zhì)的羰基結(jié)合的肼基-NHNH2的物質(zhì)。這樣的熒光物質(zhì)的例子，可以列舉出，熒光素-5-氨基硫脲、德克薩斯紅酰肼等。
在使用這樣的含肼基的熒光物質(zhì)的情況下，氧化蛋白質(zhì)的檢測具體來說，例如可以如下那樣實施(1)通過例如膠帶剝離來采取角質(zhì)層樣品；(2)使適當(dāng)緩沖液(例如100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5))中的含肼基的熒光物質(zhì)與樣品在室溫下反應(yīng)數(shù)小時(例如1小時)；(3)在反應(yīng)結(jié)束后，用適當(dāng)?shù)纳砣芤?例如緩沖液磷酸緩沖生理食鹽液(PBS))充分洗滌后，用熒光顯微鏡檢測氧化蛋白質(zhì)；(4)任選地，進(jìn)行熒光顯微鏡拍照。
氧化蛋白質(zhì)的特異的熒光標(biāo)記也可使用生物素酰肼與熒光標(biāo)記抗生物素蛋白的組合。由于生物素酰肼也具有肼基，所以其可結(jié)合在蛋白質(zhì)的羰基上。在這種情況下，首先使生物素酰肼結(jié)合在氧化蛋白質(zhì)上，然后通過生物素-抗生物素蛋白結(jié)合來使熒光標(biāo)記抗抗生物素蛋白與生物素酰肼結(jié)合，結(jié)果使氧化蛋白質(zhì)被熒光標(biāo)記。生物素酰肼可以采用該領(lǐng)域公知的例如ピア一ス社制造銷售的產(chǎn)品。另外，熒光抗生物素蛋白可使用例如熒光素抗生物素蛋白等。
在使用這樣的含肼基熒光物質(zhì)的情況下，氧化蛋白質(zhì)的檢測具體來說例如可以如下那樣實施(1)通過例如膠帶剝離來采取角質(zhì)層樣品；(2)使適當(dāng)?shù)木彌_液(例如100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5))中的生物素酰肼與樣品在室溫下反應(yīng)數(shù)小時(例如1小時)；(3)在反應(yīng)結(jié)束后，用適當(dāng)?shù)纳砣芤?例如緩沖液磷酸緩沖生理食鹽液(PBS)充分洗滌后，使熒光標(biāo)記抗生物素蛋白在室溫中反應(yīng)數(shù)小時(例如1小時)；(4)用熒光顯微鏡檢測氧化蛋白質(zhì)；(5)任選地，進(jìn)行熒光顯微鏡拍照。
也可以通過使二硝基苯肼作用·結(jié)合在氧化蛋白質(zhì)的羰基上，用熒光色素標(biāo)記其二硝基苯酚部分，來進(jìn)行氧化蛋白質(zhì)的特異的熒光標(biāo)記。因此，在本發(fā)明更優(yōu)選的方式中，可以用熒光免疫測定法等來檢測與氧化蛋白質(zhì)的羰基結(jié)合了的二硝基苯肼的二硝基苯酚部分。
在利用這樣的二硝基苯肼進(jìn)行熒光標(biāo)記的情況下，氧化蛋白質(zhì)的檢測具體來說例如可以如下那樣實施(1)通過例如膠帶剝離來采取角質(zhì)層樣品；(2)使適當(dāng)?shù)木彌_液(例如100mM的MES-Na緩沖液(pH5.5))中的二硝基苯肼(DNPH)與樣品在室溫下反應(yīng)數(shù)小時(例如1小時)；(3)在反應(yīng)結(jié)束后，用適當(dāng)?shù)纳砣芤?例如緩沖液磷酸緩沖生理食鹽液(PBS))充分洗凈后，在抗DNP抗體例如兔DNP抗體(ZYMED公司制)的同樣的生理溶液中，在室溫反應(yīng)數(shù)小時(例如1小時)；(4)在反應(yīng)結(jié)束后，用同樣的生理溶液充分洗凈，使特異的熒光標(biāo)記的二級抗體例如熒光素標(biāo)記抗兔Ig(アマシヤムフアルマシアバイオテク社制)等與上述抗DNP抗體在室溫反應(yīng)數(shù)小時(例如1小時)；(5)用熒光顯微鏡檢測氧化蛋白質(zhì)；(6)任選地，進(jìn)行熒光顯微鏡拍照。
根據(jù)其他觀點，本發(fā)明提供一種以角質(zhì)層的透明性和/或保水性為指標(biāo)的用于檢測角質(zhì)層中的蛋白質(zhì)的氧化度的方法。如上所述，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了角質(zhì)層蛋白質(zhì)的氧化對肌膚的“透明性”·“保水性”的影響，但角質(zhì)層蛋白質(zhì)的氧化也可能對皮膚的包括肌膚老化在內(nèi)的其他各種性狀產(chǎn)生影響。因此，以角質(zhì)層的“透明性”·“保水性”為指標(biāo)，可以對以角質(zhì)層蛋白質(zhì)的氧化引起的皮膚老化為主的各種其他性狀進(jìn)行早期發(fā)現(xiàn)·處理。如上所述，角質(zhì)層、肌膚的“透明性”·“保水性”，可以通過美容技術(shù)者等的美容專家的主觀的感觀試驗、皮膚樣品的光學(xué)檢查、水分檢查等來進(jìn)行。
另外，本發(fā)明通過抑制角質(zhì)層中的蛋白質(zhì)的氧化，可以提供一種保持角質(zhì)層的透明性和/或保水性的方法。角質(zhì)層蛋白質(zhì)的氧化的抑制，可以通過將適當(dāng)?shù)目寡趸瘎⒗缈箟难?、維生素E等周知的化合物溶解在適當(dāng)?shù)娜軇┲?，適量應(yīng)用于肌膚等來實現(xiàn)。
下面列舉具體例來更具體地說明本發(fā)明。另外，本發(fā)明并不僅限于這些例子。
實施例試驗1以角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)的角質(zhì)層的“保水性”的評價(1)將干燥豬皮(アロアスク、大鵬藥品工業(yè)株式會社)在水中浸漬3天。取出豬皮，在0、1、10、100mM的丙烯醛(東京化成工業(yè)株式會社)溶液中浸漬3小時，進(jìn)行氧化處理。通過使丙烯醛作用于蛋白質(zhì)，來進(jìn)行氧化，生成醛蛋白質(zhì)加成體。氧化處理后，用水洗滌1小時，洗凈后，使角質(zhì)層側(cè)朝上在培養(yǎng)皿上開始干燥(濕度50％、溫度25℃)，用スキコン200(アイ·ビイ·エス株式會社)測定15分鐘后的角質(zhì)層水分量。
將角質(zhì)層水分量的結(jié)果以皮膚電導(dǎo)率值的形式示于圖1。如圖1所表明的那樣，可以觀察到丙烯醛導(dǎo)致的氧化處理濃度依賴性的水分量下降。即，可以觀察到氧化處理導(dǎo)致角質(zhì)層水分保持力下降。
試驗2以角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)的角質(zhì)層的“保水性”的評價(2)將黑豬皮膚用10mM的丙烯醛(東京化成工業(yè)株式會社)溶液氧化處理1小時。用水洗滌1小時后，充分拭去水分，利用スキコン200來經(jīng)時地測定角質(zhì)層水分量的變化。
其結(jié)果示于圖2中。在豬皮膚中，可以觀察到丙烯醛的氧化處理導(dǎo)致角質(zhì)層水分保持力下降。
試驗3以角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)的角質(zhì)層的“保水性”的評價(3)將黑豬皮膚在20mM的次氯酸中處理1小時。用水洗滌1小時后，充分拭去水分，利用スキコン來經(jīng)時地測定角質(zhì)層水分量的變化。
其結(jié)果示于圖3中。在豬皮膚中，可以觀察到次氯酸的氧化處理也導(dǎo)致角質(zhì)層水分保持力下降。
試驗4以角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)的角質(zhì)層的“保水性”的評價(4)將人胳膊皮膚在PBS或20mM的次氯酸中閉塞處理1小時。用水洗滌1小時后，充分拭去水分，利用スキコン來經(jīng)時地測定角質(zhì)層水分量的變化。
其結(jié)果示于圖4中。在人皮膚中，也可以觀察到氧化處理導(dǎo)致的角質(zhì)層水分保持力的下降。
試驗5以角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)的角質(zhì)層的“透明性”的評價將干燥豬皮(アロテスク、大鵬藥品工業(yè)株式會社)在水中浸漬3天。取出豬皮，在0、1、10、100mM的丙烯醛(東京化成工業(yè)株式會社)溶液中浸漬3小時，進(jìn)行氧化處理。在氧化處理后，用水洗滌1小時。洗凈后，使角質(zhì)層側(cè)朝上在培養(yǎng)皿上開始干燥(濕度50％、溫度25℃)，目視觀察干燥24小時后的豬皮的外觀。
其結(jié)果示于圖5。如圖5所表明的那樣，沒有實施氧化處理的豬皮的透明度高，與此相對，如果用丙烯醛處理，則透明度呈濃度依賴性地降低。
權(quán)利要求
1.一種用于評價角質(zhì)層的透明性和/或保水性的方法，以角質(zhì)層中的氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)。
2.如權(quán)利要求1所述的用于評價角質(zhì)層的透明性和/或保水性的方法，通過對從皮膚采取的角質(zhì)層樣品中的氧化蛋白質(zhì)的羰基進(jìn)行特異的熒光標(biāo)記，對該熒光進(jìn)行檢測，來進(jìn)行角質(zhì)層氧化蛋白質(zhì)的檢測。
3.一種用于檢測角質(zhì)層中的蛋白質(zhì)的氧化度的方法，以角質(zhì)層的透明性和/或保水性為指標(biāo)。
4.一種保持·提高角質(zhì)層的透明性和/或保水性的方法，通過抑制角質(zhì)層中的蛋白質(zhì)的氧化來進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供一種以角質(zhì)層中的氧化蛋白質(zhì)為指標(biāo)的角質(zhì)層的透明性·保水性的評價方法。
文檔編號A61K8/00GK1930473SQ20058000716
公開日2007年3月14日 申請日期2005年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月5日
發(fā)明者巖井一郎, 平尾哲二 申請人:株式會社資生堂