專利名稱：OsAKT1蛋白在培育耐低鉀逆境脅迫植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及OsAKTl蛋白在培育耐低鉀逆境脅迫植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鉀是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素，是植物體內(nèi)含量最豐富的一價陽離子，約占植物干重的2%-10%。鉀在植物體內(nèi)具有分布廣、含量高、移動性強等特點，主要集中在生命活動最旺盛的部位，通常優(yōu)先分布于芽、幼葉、上部莖和根尖等生長活動旺盛的器官與組織中。
鉀不參與任何有機物質(zhì)的形成，但鉀的許多生理作用卻是其它元素所不可替代的。鉀在植物體中的作用可以分成以下幾類調(diào)節(jié)酶的活性，促進氮的吸收和蛋白質(zhì)合成， 調(diào)節(jié)韌皮部溶質(zhì)運輸，影響光合作用，調(diào)節(jié)細胞膨壓和滲透勢，維持細胞電荷平衡等。從而對植物的生長發(fā)育、產(chǎn)量形成等產(chǎn)生重要影響。
土壤中的鉀是植物鉀素最主要的來源。自然條件下植物吸收的鉀元素除少部分來自灌溉水外，其余全靠土壤供給，即使在栽培作物施用鉀肥的情況下，作物吸收的鉀也有 40-80%來自土壤。因此，土壤中鉀的狀況對植物的鉀營養(yǎng)和鉀肥施用效果有著極其重要的意義。土壤全鉀含量一般占土壤總重的O. 1%-3%，由于植物只能從土壤中吸收以離子形式存在的鉀元素，因此其中只有大約2%的鉀對植物直接有效，其余的鉀都以不能被植物直接吸收利用的形式被固定在土壤礦物中。
目前我國農(nóng)作物生產(chǎn)發(fā)展所面臨的嚴峻狀況是土壤缺鉀且鉀肥資源極其匱乏，因此從經(jīng)濟上和長遠的戰(zhàn)略上考慮，深入了解和認識植物對低鉀脅迫的反應(yīng)機制，提高農(nóng)作物的耐低鉀能力，對于提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供OsAKTl蛋白在培育耐低鉀逆境脅迫植物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種培育耐低鉀逆境脅迫的植物的方法，包括如下步驟將OsAKTl 蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参铮玫綄Φ外浤婢趁{迫耐受能力增強的轉(zhuǎn)基因植株；
所述OsAKTl蛋白獲自水稻(Oryza sativa),是如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
所述OsAKTl蛋白的編碼基因為如下I)或2)或3)或4)的DNA分子
I)序列表中序列2自5’末端第I至2805位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列2所示的DNA分子；
3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植株耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子；
4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子。
上述嚴格條件可為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用 2XSSC、0. 1%SDS 和 I XSSC,O. 1%SDS 各洗膜一次。
所述OsAKTl蛋白的編碼基因可通過表達載體導(dǎo)入所述目的植物。
可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA 片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標記物或是抗化學(xué)試劑標記基因等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
所述表達載體具體可為在1301-Ubiq質(zhì)粒的多克隆位點(如Bam HI和SmaI酶切位點之間)插入所述OsAKTl蛋白的編碼基因得到的重組質(zhì)粒甲。
攜帶有所述OsAKTl蛋白的編碼基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍法、花粉管通道法等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。所述基因可通過所述重組質(zhì)粒甲導(dǎo)入所述目的植物中。
所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
所述雙子葉植物可為擬南芥，如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥或其突變株。所述突變株具體可為ataktl突變體。
所述“對低鉀逆境脅迫耐受能力增強”體現(xiàn)為植株對K+的吸收能力增強和/或植株(植株的地下部分和/或地上部分)中的K+含量增加。
本發(fā)明還保護所述OsAKTl蛋白或所述OsAKTl蛋白的編碼基因在培育耐低鉀逆境脅迫植物中的應(yīng)用。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為擬南芥， 如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥或其突變株。所述突變株具體可為ataktl突變體。
以上任一所述“低鉀”可為鉀離子濃度為ImM以下，如500 μ M以下、250 μ M以下、 100 μ M以下、50 μ M以下、5 μ M以下或O μ Μ。
本發(fā)明還保護所述OsAKTl蛋白、所述OsAKTl蛋白的編碼基因或以上任一所述方法在植物育種中的應(yīng)用。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為擬南芥，如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥或其突變株。所述突變株具體可為ataktl突變體。
本發(fā)明還保護所述OsAKTl蛋白在參與生物體中的K+轉(zhuǎn)運中的應(yīng)用。
本發(fā)明公開了水稻OsAKTl蛋白及其編碼基因的工程應(yīng)用，特別公開了該基因在提高植物對土壤中有效鉀利用效率方面的應(yīng)用。OsAKTl蛋白在水稻中負責(zé)調(diào)控從土壤中吸收K+。OsAKTl基因的敲除突變體導(dǎo)致水稻對K+的吸收顯著減少，并出現(xiàn)明顯的缺鉀褐斑。 OsAKTl基因過表達植物對K+的吸收能力大大增加。本發(fā)明可用于提高植物耐低鉀能力，為 培育適用于鉀貧瘠土壤的水稻新品種提供了保障。


圖1為osaktl突變體植株中T-DNA的插入位置。圖2為實施例2中的PCR擴增產(chǎn)物的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為實施例2中各個株系中OsAKTl基因的相對表達量。圖4為實施例2中Southern blot鑒定的結(jié)果。圖5為實施例2中水稻品種“Dongjin”、osaktl突變體的全植株照片。圖6為實施例2中根長、冠長和鉀離子含量的測定結(jié)果。圖7為實施例3的結(jié)果照片。圖8為實施例4中的PCR擴增產(chǎn)物的0. 8%瓊脂糖凝膠電泳圖。圖9為實施例4中各個株系的擬南芥培養(yǎng)7天后的照片。圖10為實施例4中全植株的鉀離子含量的測定結(jié)果。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平 均值。osaktl突變體，在水稻品種“Dongjin”的OsAKTl基因中插入T-DNA得到，獲自 Rice GE (http://signal.salk.edu/cgi_bin/RiceGE J0B=TEXT&TYPE=GENE&QUERY=0s0 lg45990，編號為PFG_1B-16021. L ；osaktl突變體植株的T-DNA的插入位置見圖1，其中 實心盒為外顯子，線條為內(nèi)含子，ATG為轉(zhuǎn)錄起始點。同樣從Rice GE可以獲得水稻品種 “Dongjin”(野生型植株)。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)TAIR 網(wǎng)站(http://www. arabidopsis. org/)。酵母表達載體p416_GPD (包含氨基酸選擇標記)購于http://www. biomart, cn/ infosupply/9602211. htm，貨號為 87360。酵母突變菌株R5421 (在文獻中被稱作“strain CY162”)參考文獻Robert L.Nakamura, Julie A.Anderson, Richard F. Gaber. (1997)Determination of Key StructuralRequirements of a K+ Channel Pore.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY272, 1011 - 1018.;該突變圖菌株為鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白基因突變體。野生型酵母R757 (在文獻中被稱作“strain R757”)參考文獻Robert L.Nakamura, Julie A.Anderson, Richard F. Gaber. (1997)Determination of Key Structural Requirementsof a K+ Channel Pore. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 272，1011 - 1018.。ataktl 突變體參考文獻Xu J, Li HD, Chen LQ, Wang Y, Liu LL, ffu WH. (2006) Aprotein kinase, interacting with two calcineurin B-like proteins, regulates K+transporterAKTI in Arabidopsis. Cell, 125:1347-1360 ;該突變體植株的出發(fā)植株為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。
1301-Ubiq 質(zhì)粒參考文獻Baisheng Yu, Zhongwei Linl, Haixia Li, Xiaojiao Li,Jiayang Li,Yonghong Wang, Xia Zhang,Zuofeng Zhu, Wenxue Zhai,Xiangkun Wang, Daoxin Xie and Chuanqing Sun. (2007)TAC I, a major quantitative trait locus controllingtiIIer angle in rice. The Plant Journal 52，891-898 ;1301_Ubiq 質(zhì)粒是將ubiquitin啟動子插入PCAMBIA1301的Pst I酶切位點得到的質(zhì)粒。
農(nóng)桿菌菌株GV3101 :提及“農(nóng)桿菌菌株GV3101”的參考文獻R. Berres，L. Otten, B. Tinland, E. Malgarini-Clog, B. Walter. (1992)Transformation of vitis tissue by differentstrains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6b gene. Plant Cell Reports 11, 192-195.。
實施例I、OsAKTl蛋白及其編碼基因的獲得
在TIGR 網(wǎng)站(http://rice, plantbiology. msu. edu)上輸入 L0C_01g45990 得到一段編碼水稻高親和鉀離子通道基因的DNA序列。根據(jù)植物分子生物學(xué)國際植物基因命名法委員會，(Commission for Plant Gene Nomenclature of the International Society forPlant Molecular Biology)的要求，將該DNA序列命名為OsAKTl基因，編碼OsAKTl蛋白。OsAKTl蛋白如序列表的序列I所示(由935個氨基酸殘基組成)。OsAKTl基因的開放閱讀框如序列表的序列2所T]^(2808bp)。該基因具有11個外顯子和10個內(nèi)含子。
實施例2、OsAKTl蛋白的功能驗證
分別將水稻品種“Dongjin”(用DJ表示)、osaktl突變體分別進行如下鑒定
一、分子鑒定
I、PCR 鑒定
分別提取植株幼苗的地下部分(根部)和地上部分(冠部)的總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，用Primerl和Primer2組成的引物對進行PCR擴增(靶序列約為llOObp)，以鑒定OsAKTl基因的表達量。采用OsACTIN基因為看家基因，用Primer3和 Primer4組成的引物對進行PCR鑒定(祀序列約為600bp)。
Primerl :5，-AATGGCTGGTGTCGTAAAGG-3，；
Primer2 :5’ -AGATGATCGCCGTCTCTGAT-3’。
Primerf :5’ -TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3’ ；
Primer4 5，-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3，。
PCR擴增產(chǎn)物的O. 8%瓊脂糖凝膠電泳圖見圖2。
2、Real-time PCR 鑒定
提取植株幼苗的總RNA并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，采用Primer5和 Primer6組成的引物對進行Real-time PCR,以鑒定OsAKTl基因的表達量。采用OsACTIN基因為看家基因，用Primer7和Primer8組成的引物對進行Real-time PCR鑒定。Real-time PCR 中使用 SYBR Green Master mix 和 ABI 7500 sequence detection system (Applied Biosystems)。數(shù)據(jù)的處理采用Comparative CT方法。以O(shè)sACTIN基因作為內(nèi)對照對數(shù)據(jù)進行歸一化。
Primer5 :5’ -TTGCGTTTGAATCGTACAGC-3’ ；
Primer6 :5’ -CCTTTACGACACCAGCCATT-3’。
Primer7 :5’ -TGGTCGTACCACAGGTATTGTGTT-3’ ；
Primer8 :5， -AAGGTCGAGACGAAGGATAGCAT-3，。
以水稻品種“Dongjin”的根部中OsAKTl基因的表達量作為1，水稻品種“Dongjin” 的冠部、osaktl突變體的根部和冠部中OsAKTl基因的相對表達量見圖3。
結(jié)果表明0sAKTl基因在水稻品種“Dongjin”中正常表達，而在osaktl突變體中表達量顯著降低；與水稻品種“Dongjin”相比，osaktl突變體植株地下部分中OsAKTl基因的表達量降低了 98.91% ;與水稻品種“Dongjin”相比，osaktl突變體植株地上部分中 OsAKTl基因的表達量降低了 95. 73%。
3、osaktl突變體植株T-DNA插入拷貝數(shù)的Southern blot鑒定
提取osaktl突變體植株葉片的基因組DNA，用不同限制性內(nèi)切酶進行消化后進行 1%瓊脂糖凝膠進行電泳，采用非放射性地高辛標記的探針進行Southern blot鑒定，結(jié)果見圖4。osaktl突變體的T-DNA片段是單拷貝插入的。
二、OsAKTl蛋白的功能驗證
I、分組處理
正常水培液的配制方法114.25mg NH4NO3^50. 38mg NaH2PO4 · 2Η20、89· 25mgK2S04、 110. 75mg CaCl2、405mg MgSO4 ·7Η20、1· 88mg MnCl2 ·4Η20、92· 5 μ g(NH4)6Mo7024 ·4Η20、1· 17mg Η3Β03、437μ g ZnSO4 · 7Η20、388μ g CuSO4 · 5Η20、34· 75mgFeS04 · 7Η20、46· 53mg Na2EDTA,用去離子水定容至1L，用NaOH調(diào)節(jié)pH為5. 70-5. 80。
正常水培液中的K+濃度約為ImM。
低鉀水培液甲的配制方法改變K2SO4的加入量，其它均同正常水培液。
低鉀水培液甲中的K+濃度為100 μ Μ。
低鉀水培液乙的配制方法改變K2SO4的加入量，其它均同正常水培液。
低鉀水培液乙中的K+濃度為10 μ M0
第一組將消毒后浸種并催芽的水稻種子放置于用去離子水浸濕的濾紙上，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，然后將幼苗移至正常水培液中培養(yǎng)10天后拍照、測量根冠長度并檢測鉀尚子含量。
第二組將消毒后浸種并催芽的水稻種子放置于用去離子水浸濕的濾紙上，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，然后將幼苗移至低鉀水培液甲中培養(yǎng)10天后拍照、測量根冠長度并檢測鉀離子含量。
第三組將消毒后浸種并催芽的水稻種子放置于用去離子水浸濕的濾紙上，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，然后將幼苗移至低鉀水培液乙中培養(yǎng)10天后拍照、測量根部和冠部長度并檢測鉀離子含量。
2、表型觀察
水稻品種“Dongjin”、osaktl突變體的全植株照片見圖5A,等位葉照片見圖5B。 在正常水培液中培養(yǎng)10天后，水稻品種“Dongjin”和osaktl突變體的全植株表型和葉片表型均一致，生長狀態(tài)良好。在低鉀水培液中培養(yǎng)10天后，osaktl突變體表現(xiàn)出葉片失綠并出現(xiàn)褐色的的缺鉀斑，而水稻品種“Dongjin”的葉片仍保能保持綠色，且突變體植株的根冠高度也顯著低于水稻品種“Dongjin”。以上結(jié)果表明，OsAKTl基因參與了低鉀通路，是低鉀耐受基因。
根部和冠部長度的結(jié)果見圖6。
3、根冠鉀離子含量的測定
( I)將植株用雙蒸水清洗干凈，將地下部分(根部)和地上部分(冠部)分開，放置于 80°C烘箱中烘干四天，至其重量恒定。
(2)將烘干的地下部分和地上部分分別在分析天平上稱量并記錄干重，然后分別放入坩堝內(nèi)。
(3)將坩堝放入馬弗爐中，300°C烘烤I小時，然后將溫度調(diào)至575°C再烘烤7小時， 關(guān)閉馬弗爐，待其冷卻至200°C以下后取出坩堝。
(4)每個坩堝中加IOmL O. IM HCl水溶液，以溶解剩余物。
(5)將步驟(4)得到的溶液用O. IM HCl水溶液稀釋后作為待測溶液。
(6)用Z5000型原子吸收分光光度計面積法測定稀釋溶液的鉀濃度。采用KCl制作標準曲線。
(7)換算每g干重的植物材料中含有多少mg鉀離子。
進行三次重復(fù)實驗，每次重復(fù)實驗中每個株系取3株植株，結(jié)果取平均值。
鉀離子含量結(jié)果見圖6。
圖6中a :根部和冠部長度(cm) ；b :根部鉀含量；c :冠部鉀含量。在不同濃度鉀離子濃度的水培液培養(yǎng)下，osaktl突變體根部和冠部的鉀離子含量都低于野生型，說明 osaktl突變體對低鉀敏感，OsAKTl是低鉀耐受基因。在低鉀(10 μ M)條件下培養(yǎng)10天后， 與水稻品種“Dongjin”相比，osaktl突變體植株根部的鉀離子含量降低了 42. 95%。
實施例3、酵母異源表達OsAKTl蛋白
一、重組表達載體的構(gòu)建
I、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
2、以步驟2合成的雙鏈DNA分子為模板，用OsAKTl-F和OsAKTl-R組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
OsAKTl-F :5，-TTGAATTCATGGCGAGGTGGGGCGCCGCT-3’ ；
OsAKTI-R : 5 ’ -TTGTCGACCTAGCTCTTGCCTTTCATCTTCTC-3，。
3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切步驟2的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
4、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切酵母表達載體p416_GPD，回收載體骨架 (約 5800bp)。
5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒p416_0sAKTl。 根據(jù)測序結(jié)果對重組質(zhì)粒p416-0sAKTl進行結(jié)構(gòu)描述如下在酵母表達載體P416-GPD的 EcoRI和SalI酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的DNA分子。
二、酵母的轉(zhuǎn)化
將重組質(zhì)粒p416_0sAKTl導(dǎo)入酵母突變菌株R5421，得到酵母轉(zhuǎn)化子 R5421-0sAKTl，具體步驟如下
I、挑取酵母突變菌株R5421單克隆于YPDA液體培養(yǎng)基中，30°C、250r/min培養(yǎng)至 0D_ 約為 I. 6-1. 8。
2、將步驟I得到的菌液按1:10的體積比轉(zhuǎn)接至新的YPDA液體培養(yǎng)基，30°C、9250r/min培養(yǎng)至0D600=0. 8-1. O,收集細胞沉淀。
3、將步驟2得到細胞沉淀懸浮于ddH20中，每個感受態(tài)細胞懸浮于60 μ I ddH20, 然后加入以下成分240 μ I 50g/100mL的PEG4000水溶液、36μL I. OM LiAc水溶液，IOyL 5. Omg/mL 的 SS-DNA (Sigma, D1626)，5 μ L 重組質(zhì)粒 p416_0sAKTl (含 O. 1-10 μ g) ;30°C水浴 30分鐘，42°C水浴25分鐘，然后收集菌體并涂布于營養(yǎng)缺陷型平板上30°C培養(yǎng)2_3天。
營養(yǎng)缺陷型平板的制備方法將6. 7g無氨基酸酵母氮源、O. 77g-Ura DOSupplement,20g葡糖糖、15g瓊脂粉和7. 455g KCl溶于水并用水定容至1L，用NaOH調(diào) pH=5. 8。
三、對照酵母轉(zhuǎn)化子的獲得
用酵母表達載體P416-GH)代替重組質(zhì)粒P416-0SAKT1進行步驟二，得到酵母轉(zhuǎn)化子 R5421-p416-GPD。
四、酵母互補實驗
AP固體培養(yǎng)基的制備方法將20mL 50X鹽溶液、ImL 1000X微量元素溶液、 ImLlOOOX 維生素溶液、O. 77g_Ura DO Supplement、IOmL IOOXUra 母液和 20g 葡萄糖混合，加入KCl (通過加入量不同，使得培養(yǎng)基中的K+濃度不同)，用Arginine調(diào)到pH=6. 5。
50 X 鹽溶液含有 400mM H3PO4^OOmM L-arginineUOOmM MgSO4 和 IOmM CaCl2 的水溶液。
1000X 微量元素溶液含有 500 μ g/ml Η3Β04、50 μ g/ml CuSO4UOO μ g/ml ΚΙ、 400 μ g/mlMnS04、200 μ g/ml Na2MoO4 和 400 μ g/ml ZnSO4 的水溶液。
1000 X 維生素溶液含有 10 μ g/ml biotin (生物素)、10g/ml nicotinic acid (煙草酸)、10g/ml inositol (肌醇)和 lg/ml pantothenic acid (泛酸)的水溶液。
100 XUra母液含有2g/L Ura (尿嘧啶)的水溶液。
將野生型酵母R757 (陽性對照)、酵母轉(zhuǎn)化子R5421_0sAKTl (在圖7中用 “R5421+0sAKTl 表示”)、酵母轉(zhuǎn)化子 R5421_p416_GPD (在圖 7 中用 “R5421+p416” 表示)以及酵母突變菌株R5421 (陰性對照)培養(yǎng)于AP固體培養(yǎng)基(K+濃度分別為50mM、10mM、5mM、 ImM、500 μ Μ、250 μ Μ、100 μ M或50 μ Μ)上，分別稀釋不同梯度點斑進行培養(yǎng)，觀察不同材料的菌斑的生長情況。
結(jié)果見圖7。酵母突變菌株R5421和酵母轉(zhuǎn)化子R5421-p416-GPD在ImM K+濃度以下均不能生長，而酵母轉(zhuǎn)化子1 5421-0^1(1'1在5(^1 K+濃度時仍然可以生長。結(jié)果表明，OsAKTl蛋白介導(dǎo)了酵母細胞膜的K+轉(zhuǎn)運。
實施例4、轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表型檢測
—、過表達載體構(gòu)建
I、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。
2、以步驟I合成的雙鏈DNA分子為模板，用0sAKTl_UN1301F和0sAKTl_UN1301R 組成的弓I物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
0sAKTl-UN1301F :5’ - TTAGATCTATGGCGAGGTGGGGCGCCGCT-3’
0sAKTl-UN1301R :5’ - TTCCCGGGCTAGCTCTTGCCTTTCATCTTCTC-3>。
3、用限制性內(nèi)切酶Bgl II和SmaI雙酶切步驟2的PCR擴增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
4、用限制性內(nèi)切酶Bam HI和SmaI雙酶切1301-Ubiq質(zhì)粒，回收載體骨架(約11800bp)。
5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒。根據(jù)測序結(jié)果， 對重組質(zhì)粒甲進行結(jié)構(gòu)描述如下在1301-Ubiq質(zhì)粒的Bam HI和SmaI酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的DNA分子。
二、過表達載體轉(zhuǎn)化擬南芥
I、將步驟一得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101，得到重組農(nóng)桿菌。
2、將步驟I得到的重組農(nóng)桿菌乙通過花浸泡法轉(zhuǎn)化ataktl突變體，收獲T1代種子。
3、將T1代植株自交并收獲種子(T2代種子)，將T2代種子培育為T2代植株。
4、將T2代植株在含50mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上進行潮霉素抗性篩選，對于某一 T1代植株，如果其T2代植株在潮霉素抗性篩選中顯示3:1的分離比，該T1代植株為單拷貝 OsAKTl基因過表達植株。
5、將單拷貝OsAKTl基因過表達植株的T2代植株自交并收獲種子(T3代種子)，將 T3代種子培育為T3代植株。
6、將T3代植株在含50mg/L潮霉素的MS培養(yǎng)基上進行潮霉素抗性篩選，對于某一 T2代植株，如果其T3代植株均為潮霉素抗性植株，該T2代植株為純合的OsAKTl基因過表達植株，該植株及其自交后代為一個OsAKTl基因過表達株系。
三、轉(zhuǎn)空載體擬南芥的獲得
用1301-Ubiq質(zhì)粒代替重組質(zhì)粒甲進行步驟二，得到轉(zhuǎn)空載體植株。
四、耐逆性鑒定
分別對如下植株進行鑒定隨機選取的2個轉(zhuǎn)OsAKTl基因擬南芥單拷貝純合株系 (株系I、株系2、株系3)的T3代種子、轉(zhuǎn)空載體植株的T3代種子、ataktl突變體的種子和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的種子。
將擬南芥種子放置于MS培養(yǎng)基上，22 °C光照培養(yǎng)箱中連續(xù)光照(光強 60 μ mol · m_2 · s—1) 4天，然后分成兩組，分別移苗至MS培養(yǎng)基和低鉀培養(yǎng)基(用LK表示)上，繼續(xù)在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后拍照，分子鑒定(提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用 0sAKTl-UN1301F和0sAKTl_UN1301R組成的引物對進行PCR鑒定)并檢測鉀離子含量(將全植株進行鉀離子含量測定，方法同實施例2的步驟二的3)。
MS 培養(yǎng)基配方將 I. 65g NH4NO3U. 9g ΚΝ03、0· 17g ΚΗ2Ρ04、0· 37g MgSO4 · 7H20、 0. 332g CaCl2,22. 3mg MnSO4 · 4H20、8. 6mg ZnSO4 · 7H20、0. 025mg CoCl2 · 6H20、 0. 025mgCuS04 · 5H20、0. 025mg Na2MoO4 · 2H20、0. 83mg KI、6. 2mg H3BO3, 27. 8mg FeSO4 · 7H20 和37. 3mg Na2EDTA溶于水并用水定容至1L。
低鉀培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基的差異在于去除I. 9g KN03、1. 65g NH4N03、0. 332gCaCl2 和 0. 17g KH2PO4，加入 706mg Ca(NO3)2 和 144mg NH4H2PO4。
PCR鑒定圖譜見圖8。照片見圖9。鉀離子含量見圖10。
在MS培養(yǎng)基中，各個株系的表型均沒有顯著差異。在LK培養(yǎng)基中，各個轉(zhuǎn)OsAKTl 基因植株的生長狀態(tài)顯著優(yōu)于ataktl突變體，與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥無顯著差異，轉(zhuǎn)空載體擬南芥和aktl突變株的表型沒有顯著差異。
權(quán)利要求
1.一種培育耐低鉀逆境脅迫的植物的方法，包括如下步驟^fOsAKTl蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，得到對低鉀逆境脅迫耐受能力增強的轉(zhuǎn)基因植株；所述OsAKTl蛋白是如下(a)或(b)Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述編碼基因為如下I)或2)或3)或4)的 DNA分子1)序列表中序列2自5’末端第I至2805位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植株耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述編碼基因通過表達載體導(dǎo)入所述目的植物。
4.如權(quán)利要求I或3中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥。
6.OsAKTl蛋白或其編碼基因在培育耐低鉀逆境脅迫植物中的應(yīng)用；所述OsAKTl蛋白是如下(a)或(b):Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述編碼基因為如下I)或2)或3)或4)的 DNA分子1)序列表中序列2自5’末端第I至2805位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植株耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)蛋白的DNA分子。
8.如權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。
9.權(quán)利要求I至5中任一所述方法在植物育種中的應(yīng)用。
10.OsAKTl蛋白在參與生物體中的K+轉(zhuǎn)運中的應(yīng)用；所述OsAKTl蛋白是如下(a)或(b)Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加2且與植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了OsAKT1蛋白在培育耐低鉀逆境脅迫植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種培育耐低鉀逆境脅迫的植物的方法，包括如下步驟將OsAKT1蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，得到對低鉀逆境脅迫耐受能力增強的轉(zhuǎn)基因植株；所述OsAKT1蛋白獲自水稻(Oryza sativa)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐低鉀逆境脅迫相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明可用于提高植物耐低鉀能力，為培育適用于鉀貧瘠土壤的水稻新品種提供了保障。
文檔編號C12N15/29GK102978216SQ20121052132
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月6日
發(fā)明者王毅, 武維華, 李娟 , 龍雨 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)