專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè) RRM1 mRNA 基因表達(dá)量的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)RRMl mRNA基因表達(dá)量的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
吉西他濱(Gemcitabine)為脫氧胞嘧啶核苷的類(lèi)似物，為核苷酸還原酶抑制劑。屬細(xì)胞周期特異性抗代謝類(lèi)化療藥，主要作用于S期(DNA合成期)的腫瘤細(xì)胞，同時(shí)也阻斷細(xì)胞周期由Gl期(DNA合成前期)向S期過(guò)渡。吉西他濱作為一種前體藥在細(xì)胞內(nèi)是脫氧胸苷激酶磷酸化的底物，在酶的作用下轉(zhuǎn)化成活性代謝物dFdCDP (吉西他濱二磷酸鹽)和dFdCTP (吉西他濱三磷酸鹽)。dFdCDP可抑制核糖核苷酸還原酶(ribonucleotidereductase, RR),導(dǎo)致dFdCTP大量積聚。dFdCTP則與dCTP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合進(jìn)入DNA鏈，插入至DNA鏈中脫氧胞苷的位點(diǎn)，并允許鳥(niǎo)苷與其配對(duì)，使其免受核糖核酸外切酶的移除修復(fù)，造成DNA鏈合成停止，進(jìn)而導(dǎo)致DNA斷裂、細(xì)胞死亡，達(dá)到治療腫瘤的目的。臨床上主要用于治療非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌·、膀胱癌、乳腺癌和其他實(shí)體腫瘤。RRMl基因(定位于I號(hào)染色體短臂)編碼核糖核苷酸還原酶Ml亞單位(RRMl)。核糖核苷酸還原酶(RR)參與核糖核苷酸還原成脫氧核糖核酸的過(guò)程，是DNA合成通路中的限速酶。RRMl是吉西他濱作用的靶點(diǎn)之一。所有腫瘤細(xì)胞中都存在RRMl表達(dá)，而且表達(dá)水平差異很大。臨床研究顯示，患者RRMl表達(dá)水平與吉西他濱的療效相關(guān)，RRMl mRNA低表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者經(jīng)吉西他濱治療療效較好，中位生存期較長(zhǎng)(Bepler G et al.J Clin Oncol.2006; 24(29): 4731-4737; Reynolds C et al.J Clin Oncol.2009;27(34):5808-15.)。RRMl mRNA也可以預(yù)測(cè)乳腺癌、胰腺癌、膽管癌患者的化療受益情況及預(yù)后(Jordheim LP et al.Lancet Oncol.2011; 12(7): 693-702.)。因此，美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)臨床實(shí)踐指南(第二版，2010)中指出:非小細(xì)胞肺癌患者RRMl的表達(dá)與吉西他濱的療效密切相關(guān)，在吉西他濱用藥前應(yīng)進(jìn)行RRMl基因表達(dá)水平的檢測(cè)(NCCNClinical Practice Guidelines in Oncology for NSCLC.V2.2010)。因此，對(duì) RRMl 表達(dá)量實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確、定量地檢測(cè)，有利于臨床醫(yī)生及時(shí)、準(zhǔn)確、合理的制定個(gè)體化治療方案。熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，為本發(fā)明提供了一種操作簡(jiǎn)單快速、易標(biāo)準(zhǔn)化、檢測(cè)費(fèi)用低，準(zhǔn)確可靠、定量檢測(cè)mRNA的方法。通過(guò)該方法可以快速檢測(cè)腫瘤細(xì)胞(來(lái)源于腫瘤組織、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、穿刺標(biāo)本、胸腹水等)中RRMl mRNA的表達(dá)量，用于臨床醫(yī)生對(duì)吉西他濱的合理化使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種檢測(cè)RRMl基因mRNA表達(dá)量的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，能簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)RRMl基因。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
一種檢測(cè)RRMl基因表達(dá)量的熒光定量PCR試劑盒，包含以下組成部分:(1)RRMl基因標(biāo)準(zhǔn)品:含有RRMl基因編碼序列的重組載體，所述RRMl基因編碼序列如SEQ ID N0.1 所示；
(2)內(nèi)對(duì)照P-actin基因標(biāo)準(zhǔn)品:含有P-actin基因編碼序列的重組載體，所述3 -actin基因編碼序列如SEQ ID N0.2所不；
(3)檢測(cè)RRMl基因的上、下游引物:
RRMl-上游引物:5’ - CTGGAAGCAGGGTTTGAAGAC -3’ (SEQ ID N0.3)
RRMl-下游引物:5’ - GATTGGATTAGCCGCTGGTC -3’ (SEQ ID N0.4)
(4)檢測(cè)P-actin基因的上、下游引物:
3-actin -上游引物:5，- CTCGCCTTTGCCGATCC -3，(SEQ ID N0.5)
3-actin -下游引物:5，- CATGCCGGAGCCGTTG -3，(SEQ ID N0.6)
進(jìn)一步，所述含有RRMl基因編碼序列的重組載體和含有P -actin基因編碼序列的重組載體的空載體均為PUC57載體；
進(jìn)一步，該試劑盒還包含逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT) ,dNTPs溶液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶。所述逆轉(zhuǎn)錄緩沖液為常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，如5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液(有濃度為50mmol/L、pH 為 8.0 的 Tris-HCl、濃度為 SOmmoI /I,的 KCl、濃度為 4 mmol /I,的 MgC12 和濃度為10mmol/L的二硫蘇糖醇DTT組成)等；所述逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)為寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸；所述dNTPs溶液為dATP (脫氧腺苷三磷酸)的混合水溶液；所述定量PCR緩沖液為常規(guī)定量PCR緩沖液，如5 X定量PCR緩沖液(由濃度為lOmmol/L，pH為8.0的Tris-HCl、濃度為50mmol/L的KCl和濃度為2 mmol/L的MgC12組成)等。本發(fā)明還提供了基于上述試劑盒檢測(cè)RRMl mRNA基因表達(dá)量的方法，包括以下步驟:
(1)從待測(cè)標(biāo)本(腫瘤組織、循環(huán)腫瘤細(xì)胞、穿刺標(biāo)本、胸腹水等)中提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度，加入逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo- (dT) ,dNTPs溶液和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ；
(2)分別將已知拷貝數(shù)的RRMl基因標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)對(duì)照P-actin基因標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋至108、107、IO6、105、IO4、103、IO2UO 個(gè)拷貝數(shù) /u I ；
(3)分別以步驟(I)所制備的待測(cè)cDNA及步驟(2)倍比稀釋的RRMl基因標(biāo)準(zhǔn)品為模板，加入內(nèi)對(duì)照P -actin基因標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)RRMl基因的上、下游引物，檢測(cè)內(nèi)對(duì)照P -actin基因的上、下游引物，定量PCR緩沖液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，進(jìn)行熒光定量PCR ；
(4)由于模板的循環(huán)閾值與該模板的初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，因此，根據(jù)倍比稀釋的RRMl基因標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)對(duì)照P-actin基因標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值與初始拷貝數(shù)分別繪制RRMl基因和內(nèi)對(duì)照P -actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)cDNA的循環(huán)閾值對(duì)其含有的RRMl基因和內(nèi)對(duì)照P -actin基因的初始拷貝數(shù)進(jìn)行定量，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取其含有的RRMl基因和內(nèi)對(duì)照P -actin基因的初始拷貝數(shù)。進(jìn)一步，所述步驟(3)的PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性3分鐘，然后95°C變性30秒、57°C退火40秒，共40個(gè)循環(huán)。本發(fā)明的定量PC R檢測(cè)試劑盒由于選擇了合適的引物，制備了合適的RRMl基因標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)對(duì)照P-actin基因標(biāo)準(zhǔn)品，能夠靈敏、特異、準(zhǔn)確地同時(shí)檢測(cè)RRMl基因，適用于臨床上對(duì)吉西他濱療效反應(yīng)的評(píng)價(jià)，利于臨床醫(yī)生對(duì)治療方案做出合理的選擇。


圖1為本發(fā)明7 //基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖2為本發(fā)明RRMl基因的溶解曲線；
圖3為本發(fā)明7 //基因的擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。一、RRMl基因的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的配置
本實(shí)施例的RRMl基因的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括以下組成部分:
1)RRMl基因標(biāo)準(zhǔn)品:含有RRMl基因編碼序列(GeneBank編號(hào)為NM_001033.3的第2500位至第2564位堿基)的重組pUC57載體；
2)內(nèi)對(duì)照P-actin基因標(biāo)準(zhǔn)品:含有P-actin基因編碼序列(GeneBank編號(hào)為NM_001101.3的第37位至第133位堿基)的重組pUC57載體；
3)檢測(cè)RRMl基因的上、下游引物:
RRMl-上游引物:5’ - CTGGAAGCAGGGITTGAAGAC-3’ (SEQ ID N0.2)
RRMl-下游引物:5’ - GATTGGATTAGCCGCTGGTC-3’ (SEQ ID N0.3)；
4)檢測(cè)內(nèi)對(duì)照P-actin基因的上、下游引物:
3-actin -上游引物:5，- CTCGCCTTTGCCGATCC-3’
3-actin -下游引物:5’ - CATGCCGGAGCCGTTG-3’ ；
5)5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，濃度 為lOpmol/ill的逆轉(zhuǎn)錄引物01igo-(dT)16，濃度為20pmol/ u I的dNTPs溶液，濃度為IOU/ U I的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，5 X定量PCR緩沖液，濃度為2U/ ill的TaqDNA聚合酶。其中，RRMl和內(nèi)對(duì)照@ _actin基因標(biāo)準(zhǔn)品由以下方法制得:
a)直接合成獲得含有RRMl和P-actin基因編碼序列的片段DNA;
b)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、切膠回收純化后，克隆至PUC57載體進(jìn)行連接；
c)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆；
d)提取重組質(zhì)粒，即得分別含有RRMl和P-actin基因編碼序列的重組pUC57載體。此外，逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶均為RT-PCR的常規(guī)試劑，故本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒也可以不包括上述常規(guī)試劑。二、RRMl基因的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)
本實(shí)施例的RRMl基因的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟:
(1)從待測(cè)外周血、腫瘤組織、穿刺標(biāo)本或其它標(biāo)本中提取總RNA，測(cè)RNA的濃度；
(2)將所得RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，轉(zhuǎn)錄體系如表I所示:
表I
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)RRMl mRNA基因表達(dá)量的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括以下組成部分: (1)RRMl基因標(biāo)準(zhǔn)品:含有RRMl基因編碼序列的重組載體，所述RRMl基因編碼序列如SEQ ID N0.1 所示； (2)內(nèi)對(duì)照P-actin基因標(biāo)準(zhǔn)品:含有P-actin基因編碼序列的重組載體，所述3 -actin基因編碼序列如SEQ ID N0.2所不； (3)檢測(cè)RRMl基因的上、下游引物: RRMl-上游引物:5’ - CTGGAAGCAGGGTTTGAAGAC -3’ ；RRMl-下游引物:5’ - GATTGGATTAGCCGCTGGTC -3’ ； (4)檢測(cè)P-actin基因的上、下游引物: 3-actin-上游引物:5，- CTCGCCTTTGCCGATCC -3，； 3-actin-下游引物:5，- CATGCCGGAGCCGTTG -3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述含有RRMl基因編碼序列的重組載體和含有0 -actin基因編碼序列的重組載體中的空載體均為pUC57載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶。
4.一種基于權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述試劑盒檢測(cè)RRMl mRNA基因表達(dá)量的方法，包括如下步驟: (1)從待測(cè)標(biāo)本中提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，加入逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ； (2)分別將已知拷貝數(shù)的RRMl基因標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)對(duì)照P-actin基因標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋至108、107、IO6、105、IO4、103、IO2UO 個(gè)拷貝數(shù) /u I ； (3)分別以步驟(I)所制備的待測(cè)cDNA及步驟(2)倍比稀釋的RRMl基因標(biāo)準(zhǔn)品為模板，加入內(nèi)對(duì)照P -actin基因標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)RRMl基因的上、下游引物，檢測(cè)內(nèi)對(duì)照P -actin基因的上、下游引物，定量PCR緩沖液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，進(jìn)行熒光定量PCR ； (4)根據(jù)倍比稀釋的RRMl基因標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)對(duì)照P-actin基因標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值與初始拷貝數(shù)分別繪制RRMl基因和內(nèi)對(duì)照P -actin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)cDNA的循環(huán)閾值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取其含有的RRMl基因和內(nèi)對(duì)照P -actin基因的初始拷貝數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)的PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性3分鐘，然后95°C變性30秒、57°C退火40秒，共40個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)RRM1 mRNA基因表達(dá)量的試劑盒及方法。該試劑盒包括用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品、內(nèi)參基因?qū)崟r(shí)定量PCR體系。通過(guò)該方法能準(zhǔn)確、快速、定量地確定RRM1基因表達(dá)量。本發(fā)明所述方法和試劑盒應(yīng)用在臨床中，有利于醫(yī)生合理化選擇吉西他濱進(jìn)行治療。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103088121SQ20121052116
公開(kāi)日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月7日
發(fā)明者郭成賢, 張偉, 陳小平, 劉昭前, 周宏灝 申請(qǐng)人:周宏灝