專利名稱：一株枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株可產(chǎn)生耐熱蛋白的植物病原真菌，以及其在防治植物病害中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f. sp. cubense)引起的毀滅性病害，是國際檢疫對象(肖彤斌，謝圣華，芮凱，等.香蕉枯萎病的發(fā)生及防控對策[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學，2006，沈(6) :53巧4.)。1904年香蕉枯萎病在美國夏威夷首次被發(fā)現(xiàn)(高喬婉.香蕉枯萎病[A]，中國農(nóng)業(yè)百科全書編輯部，中國農(nóng)業(yè)百科全書植物病理學卷 [C]·北京中國農(nóng)業(yè)出版社，1996，482-483.)，1910年Erim F. Smith分離到該病的病原菌， 1913年Ashby最先對該病原菌作了詳細的描述，1919年Brandes首次確證了該病原菌的致病性，1940 年 Snyder 禾口 Hansen 將該病原菌命名為 Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Ε. F. Smith) Snyderet Hasen (黎永堅，于莉.香蕉枯萎病發(fā)病機制及其防治技術(shù)研究[J].中國農(nóng)學通報，2006，22 (8) :515-519.)。1910年香蕉枯萎病在巴拿馬大發(fā)生，造成慘重損失， 因此該病又稱作香蕉巴拿馬病。1935至1939年，香蕉枯萎病相繼在哥斯達黎加、洪都拉斯、哥倫比亞等南美國家大面積爆發(fā)，給這些地區(qū)的香蕉種植業(yè)造成了毀滅性的打擊(陳敦忠，徐碧玉，金志強.香蕉鐮刀菌枯萎病的診斷及防治[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學，2005，25 O) 53-57. ；PeggK. G.，Moore N. Y.，Bentley S. Fusarium wilt of banana in Australia :a review[J]. AustralianJournal of Agricultural Research，1996，47(5) :637-650.)。之后香蕉枯萎病逐漸蔓延到世界各香蕉產(chǎn)區(qū)。目前香蕉枯萎病在亞洲、澳大利亞、非洲、熱帶美洲及南太平洋的香蕉產(chǎn)區(qū)均有分布(林時遲，張紹升，周樂峰，等.福建省香蕉枯萎病鑒定[J].福建農(nóng)業(yè)大學學報，2000, ) :465-469.)。我國臺灣在1967年最早報道香蕉枯萎病的發(fā)生(舒肇蘇.臺灣香蕉病害的防治[J].柑桔與亞熱帶果樹信息，2000，16 00) 43-44.)，隨后香蕉枯萎病在臺灣大流行，使臺灣香蕉種植面積驟降。60年代以前大陸香蕉枯萎病菌主要為1號生理小種，僅侵染粉蕉，1995年，廣東省首次發(fā)現(xiàn)在香蕉上發(fā)生枯萎病 (劉景梅，王璧生，陳霞，等.廣東香蕉枯萎病菌生理小種RAPD技術(shù)的建立[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2004，4 :43-55.), 2001年該病首次在海南省被發(fā)現(xiàn)(周傳波，李道民，張世能，等.海南島香蕉尖孢鐮刀茵枯萎病的發(fā)生與防治[J].海南農(nóng)業(yè)科技，2004,2:11-16.)。目前香蕉枯萎病在我國廣東、廣西、海南、福建等香蕉主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，并有快速擴展的趨勢，嚴重威脅著我國的香蕉種植業(yè)(陳銑，梁炳坤，何貴源，等.香蕉枯萎病的發(fā)生及防治試驗[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2005，5 :42-43.)。香蕉枯萎病的發(fā)生具有明顯的發(fā)病中心(卓國豪，黃有寶，吳運新，等.香蕉枯萎病的綜合防治技術(shù)[J]植物檢疫，2003，5 :279480.)，其典型外部癥狀為葉片黃化和假莖開裂(魏岳榮，黃秉智，楊護，等.香蕉鐮刀菌枯萎病研究進展[J].果樹學報，2005，22 O) 154-159.)。植株受害初期，香蕉下部葉片邊緣及其葉鞘外部發(fā)黃，并逐漸向葉片中脈擴展， 直至整葉發(fā)黃、枯死；近葉鞘處的葉柄倒折，葉片下垂；病株除頂端葉片外，所有葉片由下而上相繼變黃；嚴重病株出現(xiàn)假莖基部縱裂，甚至整株枯死。縱剖假莖和球莖，發(fā)現(xiàn)其維管束組織變褐、壞死，嚴重時病株根系變黑、腐爛壞死(林興祖，陳騰.海南香蕉鐮刀菌枯萎病綜合防治措施[J].植物保護，2007，3 :46-48.)。香蕉枯萎病屬于土傳維管束病害，遠距離傳播主要依靠染病種苗、帶菌土壤和流水(王茂明，楊秀娟，陳福如，等。我國香蕉鐮刀菌枯萎病的發(fā)生與防治[J].福建農(nóng)業(yè)科技， 2005,6 :36-38.)。高溫多濕的天氣有利于香蕉枯萎病的發(fā)生與擴展(李華勝，陳世凱，周榮等。香蕉鐮刀菌枯萎病的發(fā)生及綜合防治[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2007，3 :46-47.),因此，春季種植的香蕉，枯萎病一般在6 7月開始發(fā)生，8 9月病害加速擴展并逐步加重，10 11 月達到發(fā)病高峰(陳銑，梁炳坤，何貴源等。香蕉枯萎病的發(fā)生及防治試驗[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2005, 5 :42-43.)。香蕉枯萎病的外觀癥狀一般表現(xiàn)在抽蕾期至掛果期，感病香蕉植株一般不能結(jié)果或結(jié)果后不能成熟，因此容易造成嚴重的經(jīng)濟損失。發(fā)病嚴重的焦田第一年的發(fā)病率能達到10%，第二年為20% 30%，第三年發(fā)病率則能達到70%以上，這樣的蕉田不能再繼續(xù)種植香蕉，導致荒園(卓國豪，陳紹平，鄭康炎，等.香蕉枯萎病發(fā)生原因及控制對策[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2005，1 :56-57.)。香蕉枯萎病為系統(tǒng)性病害，病原菌主要通過根系侵入，并向植株輸導組織擴展危害維管束，形成系統(tǒng)性侵染，防治難度比較大(卓國豪，陳紹平，鄭康炎，等.香蕉枯萎病發(fā)生原因及控制對策[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2005，1 :56-57.)。同時香蕉枯萎病菌形成厚垣孢子，能夠在土壤中存活3至5年(王文華，王葵娣，曾會才.香蕉枯萎病的危害及其防治策略[J].廣西熱帶農(nóng)業(yè)，2007,3:19-21.)，即使在淹水2年的情況下，依然不能完全殺死病原菌，因此采用輪作的農(nóng)業(yè)防治措施不能很好的防治香蕉枯萎病(劉紹欽，梁張慧，黃熾輝.香蕉枯萎病的防治策略[J].廣西農(nóng)業(yè)科學，2006，37 (6) :686-687.)。采用無病組培苗和抗病品種能對香蕉枯萎病起到一定的防治效果(Hwang S. C. , KO W. H. Chao C. P. A promising Cavendish clone resistant to race 4 of Fusarium oxysporum f. sp. cubense[J].Plant Pretection Bulletin Taibei,1994,36(4) :282-291. ；Shin-Chuan Hwang, Wen-Hwiung Ko. Cavendish banana cultivars resistant to Fusarium wilt acquired through somaclonal variation in Taiwan[J]，Plant disease，2004，88 (6) 580-588.)，但香蕉品種多為三倍體，其雌花高度不孕，所以很難通過雜交方法得到抗病品種。目前的抗病品種多從無性系突變體中選育獲得，且均為中抗品種，農(nóng)藝性狀和品質(zhì)不好 (肖愛萍，游春平.香蕉枯萎病防治進展[J]·江西植保，2005, ) :67-69.),不能很好的滿足生產(chǎn)需要。近年來國內(nèi)外一直致力于防治香蕉枯萎病的化學藥劑的篩選，但成果大多還停留在實驗室階段(王忠全，方健葵，陳崎林.保水劑在香蕉枯萎病藥劑防治上的運用效果[J].江西農(nóng)業(yè)大學學報，2007，四(6) :933-936.)。許多在室內(nèi)測定對香蕉枯萎病菌有很好抑制效果的化學農(nóng)藥在田間的防治效果不理想(林蘭穩(wěn)，奚偉鵬，黃賽花.香蕉鐮刀茵枯萎病防治藥劑的篩選[J]·生態(tài)環(huán)境，2003，12 O) :182-183.) ；Nel等Q003)認為只有苯并噻二唑?qū)ο憬犊菸∮幸欢ǚ乐涡Ч渌瘜W農(nóng)藥幾乎沒有效果(肖愛萍，游春平.香蕉枯萎病防治進展[J].江西植保，2005, ) :67-69. ；Nel B.，ViljoenA.，Steinberg C.，et al. Evaluation of chemical substances for the management and control of Fusarium wilt of banana, In :Claudine Picq, Anne Vezina, Eds. 2nd International symposium on Fusarium wilt on banana [C]. Salvador de Bahia, Brazil, 2003.)。在目前還未有有效的抗病品種，而且現(xiàn)有的化學藥劑在防治上也難以奏效的情況下，采用生物防治特別是內(nèi)生生防菌是當前比較有效的途徑之一，生物防治逐漸成為各國研究香蕉枯萎病防治的熱點(肖愛萍，游春平.香蕉枯萎病防治進展[J]·江西植保，2005, ) :67-69.)。國外有很多學者很早就開始研究香蕉枯萎病的生物防治，也取得了一些成果。1932年ffeindling(1932)發(fā)現(xiàn)一株對香蕉枯萎病具有拮抗作用的木霉，并初步研究了該木霉對香蕉枯萎病菌的拮抗機理，發(fā)現(xiàn)該木霉主要通過重寄生、溶菌和生長競爭等一系列的拮抗作用來很好的抑制香蕉枯萎病病原菌(Weindting R. . Lignorum is a parusite of other soil fungil[J]· Pintopathology，1932，22)。 Saravanan 等(2003,2004)在香蕉植株根際分離到對香蕉枯萎病菌有顯著抑制作用的熒光假單胞菌(I^eudomonas fluorescens)，通過與其它8種生防菌在離體、盆栽和大田條件下對香蕉枯萎病的防效的比較，發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌的抑菌作用最好(Saravanan T.，Muthusamy M. , Marimuthu T. . Development of integrated approach to manage the fusarial wilt of banana[J], Crop Protection，2003，22 :1117-1123.)。 此夕卜，Cetha(2002)， Nautiyal (2002), Ting (2008)等均分離到對香蕉枯萎病菌有抑制作用的生防菌(Cetha K， Vikineswary S.. Antagonistic effects of streptomyces violacensniger strain GlO on Fusatium oxysporum f. sp.cubense race 4 [J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 2002,8(6) :303-306. ；]Nautiyal C. S. , Singh J. K. . Survival of the rhizosphere-competent biocontrol strain Pseudomonas fluorescens NBRI2650 in the soiland phytosphere[J]. Canaadian Journal of Microbiology. 2002,48(7) :588-601.； Ting A. S. Y.，Meon S.，Kadir J. et al. Endophytic microorganisms as potential growth promoters of banana[J]· Biocontrol，2008，53 :541-553.)。在國內(nèi)，對香蕉枯萎病的生物防治研究雖然起步較晚，但發(fā)展很快，目前已經(jīng)在生防菌的篩選方面取得了一定的成績，篩選到許多對香蕉枯萎病有拮抗作用的細菌。肖愛萍等Q008)從香蕉園土壤中分離到5株拮抗菌，測得對香蕉枯萎病孢子萌發(fā)抑制率最高能達到97. 18%，并初步研究了這些拮抗菌對香蕉枯萎病的抑制機理，發(fā)現(xiàn)其作用機制主要為對香蕉枯萎病菌菌絲的消融、菌絲細胞的泡囊化、抑制分生孢子的萌發(fā)以及孢子芽管的扭曲等(肖愛萍，李庚花，游春平等.5株拮抗細菌對香蕉枯萎病菌的抑制作用[J].江西農(nóng)業(yè)大學學報，2008,27 ) :572-575.)。鐘小燕Q009)等在發(fā)生枯萎病的香蕉園土壤分離到一株假單胞菌，測得該菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對抑制香蕉枯萎病菌十分重要(鐘小燕，梁妙芬， 甄錫壯等.假單胞菌對香蕉枯萎病菌的抑制作用[J].植物保護，2009，35(1) :86-89.)。程亮等000 初步研究了假單胞菌的抑菌機理，發(fā)現(xiàn)假單胞菌發(fā)酵液和無菌濾液對香蕉枯萎病菌絲生長和孢子萌發(fā)抑制作用顯著，同時能導致病菌菌絲和孢子芽管扭曲和膨大(程亮，肖愛萍，游春平。拮抗菌對香蕉枯萎病菌的抑菌作用初步研究[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學院學報，2005，18(1) :9-13.)。綜上所述，香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f. sp. cubense)引起的毀滅性病，是國際檢疫對象。在目前還未有有效的抗病品種，而且現(xiàn)有的化學藥劑在防治上也難以效的情況下，采用生物防治特別是內(nèi)生生防菌是當前比較有效的途徑之一，生物防治逐漸為各國研究香蕉枯萎病防治的熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株枯草芽孢桿菌，其是一種可產(chǎn)生耐熱蛋白的植物病原真菌拮抗菌，對香蕉枯萎病、水稻稻瘟病、三七根腐病、棉花枯萎病等病原真菌都具有很強的抑菌作用。本發(fā)明所提供的可產(chǎn)生耐熱蛋白的植物病原真菌拮抗菌為枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)HJXl，其保藏編號為 CGMCC No. 5498。所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJXl,已于2011年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，保藏編號為MC No. M98。所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJX1，保藏號CGMCC No. 5498，為革蘭氏陽性短桿菌，菌體大小約0. 7 0. 9 X 1. 8 2. 4 μ m之間，產(chǎn)生芽孢，芽孢中生，圓形，周生鞭毛、具運動性。菌體在LB培養(yǎng)基上能形成乳白色、表面濕潤、圓形、邊緣整齊。能產(chǎn)生耐熱蛋白(該蛋白在沸水浴中煮沸30分鐘，活性基本不變)。所述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJXl (保藏號CGMCC No. M98)，最適培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度為28 32°C，最適溫度為30°C，最適PH值7. 0。以上述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HJXl (保藏號為CGMCC No. M98)，活性成分的生物菌劑也屬于本發(fā)明的保護范圍。在需要的時候，該菌劑中還可包含菌劑制備中常用的載體和輔料。實驗證明，本發(fā)明的植物病原真菌拮抗菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HJXl (保藏號CGMCC No. M98)，對香蕉枯萎病、水稻稻瘟病、三七根腐病、棉花枯萎病等病原真菌都有很強的抑菌作用，可以對這些病原菌引起的真菌病害起到防治作用。本發(fā)明的野生菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HJXl (保藏號CGMCC No. M98)，分離自海南省東方市大田鎮(zhèn)的香蕉種植區(qū)重病田的香蕉根際土壤，實驗證明該菌株接種香蕉后能夠在香蕉植株內(nèi)穩(wěn)定定殖。實驗結(jié)果還證明該菌株產(chǎn)生的耐熱蛋白能夠有效抑制香蕉枯萎病菌的生長，為香蕉枯萎病的防治提供了一條環(huán)保、簡單、有效的途徑，同時也可以為作物提供一種新型的抗原材料。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJXl，保藏號CGMCC No. M98，是一株具有良好生防應(yīng)用前景的菌株。


圖1、2為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HJXl CGMCC No. M98和香蕉枯萎病
菌的對峙培養(yǎng)試驗結(jié)果。圖3為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJXl CGMCC No. 5498除菌體發(fā)酵液對香蕉枯萎病菌的抑制作用。左側(cè)的是對照樣，右側(cè)的為抑制的測試結(jié)果。圖4、5為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJXl CGMCC No. M98產(chǎn)耐熱蛋白實驗；圖中A為硫酸銨沉淀蛋白粗提液、B為硫酸銨沉淀蛋白粗提液經(jīng)100°C水浴30分鐘、P 為PBS緩沖液對照。圖6為HJXl菌株在不同培養(yǎng)基條件下的抑菌效果。圖7為培養(yǎng)溫度對菌株HJXl發(fā)酵液抑菌作用的影響測試結(jié)果圖。圖8為培養(yǎng)時間對菌株HJXl發(fā)酵液抑菌效果的影響測試結(jié)果圖。
圖9為搖床轉(zhuǎn)速對菌株HJXl發(fā)酵液抑菌效果的影響測試結(jié)果圖。圖10為pH對菌株觀-2發(fā)酵液抑菌效果的影響測試結(jié)果圖。圖11為本發(fā)明菌株的16S rDNA的核苷酸序列圖。本發(fā)明菌體的保藏信息如下保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，保藏編號為CGMCC No. 5498 ；保藏日期2011年11月30日；保藏編號CGMCCNo. M98。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
做進一步說明。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法，下述實施例中的百分含量， 如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實施例1植物病菌真菌拮抗菌的篩選及其鑒定1、植物病原真菌拮抗菌的篩選本菌株是從我國海南東方市大田鎮(zhèn)香蕉枯萎病發(fā)生嚴重的地塊中香蕉植株的根際土壤中分離到的，具體方法為稱取5克根際土壤，放入有IOOml無菌水的三角瓶中，在搖床上劇烈振蕩30min后，靜置15min。取Iml稀釋至10_4、10_5、10_6濃度梯度，從各濃度梯度懸浮液中取0. 1ml，用無菌涂棒涂于LB培養(yǎng)基(配方為每升含有蛋白胨10g，酵母粉 5g，NaCllOg，瓊脂粉12g，pH7. 0 7. 2)平板上，30°C恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，連續(xù)觀察3天， 挑取菌落形態(tài)不同的菌株再次劃線純化保存?zhèn)溆?。在倒好的PDA平板中央接入新鮮的香蕉枯萎病菌菌塊，在菌塊周邊用無菌牙簽點接篩選純化后的菌株進行對峙培養(yǎng)，篩選抑菌作用最強(抑菌活性最強)的菌株，結(jié)果得到一株對香蕉枯萎病菌有很強拮抗作用的菌株，將該菌株命名為HJXl。2、HJXl菌株的種屬鑒定通過形態(tài)學觀察及采用16S rDNA和細胞組分脂肪酸的測定，確認該菌株應(yīng)屬于枯草芽孢桿菌。1)該菌株的基本生物學特性為革蘭氏陽性短桿菌，菌體大小約0.7 0. 9X1. 8 2. 4μπι之間，產(chǎn)生芽孢，芽孢中生，圓形，周生鞭毛、具運動性。菌體在LB培養(yǎng)基上能形成乳白色、表面濕潤、圓形、邊緣整齊的菌落。該菌株已于2011年月日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCC No. Μ98。2)以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJXl (CGMCC No. 5498)的基因組 DNA 為模板，以細菌16S rDNA序列通用引物P0、P6作為引物，PCR擴增出約1. 5kb左右的產(chǎn)物片段，測序結(jié)果表明擴增出的序列長度為1521個堿基，具有附圖1所示的核苷酸序列；將該序列通過互聯(lián)網(wǎng)比對(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/B last, cgi)，擴增的片段序列與枯草芽孢桿菌的16S rDNA部分序列的同源性達99%以上。3)配制TSBA(Trypticase Soy Broth Agar)培養(yǎng)基，將保存的菌株進行四區(qū)劃線接種后在30°C恒溫箱中培養(yǎng)Mh。用接種環(huán)在四區(qū)劃線培養(yǎng)皿的第三區(qū)前后移動取出菌落。通過皂化反應(yīng)、甲基化反應(yīng)、萃取、洗滌和轉(zhuǎn)移過程后將樣品編號，然后進行GC分析。結(jié)果表明菌株HJXl的脂肪酸的含量同枯草芽孢桿菌最近，其相似度為0. 724。3、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJXl (CGMCC No. 5498)最適培養(yǎng)條件的確認1)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJXl (CGMCC No. 5498)生長最適培養(yǎng)基的
確定將HJXl菌株分別接種于NB、LB、PSB、PDB培養(yǎng)液中，于30°C，170rpm，振蕩培養(yǎng) 48h。離心，取上清液做抑菌實驗，如圖6所示，結(jié)果表明LB培養(yǎng)基為其最適培養(yǎng)基。2)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJXl CGMCC No. 5498生長最適溫度的確定接種HJXl菌株的LB培養(yǎng)液分別在25、28、30、32和35°C，170rpm，振蕩培養(yǎng)48h。 離心，取上清液做抑菌實驗，如圖7所示，結(jié)果表明該菌株最適生長溫度為30°C。3)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJXl (CGMCC No. 5498)培養(yǎng)時間的確定將HJXl接種于LB液體培養(yǎng)基中，于30°C，170rpm，分別振蕩培養(yǎng)對、36、48、60、 72、84和96小時。離心，取上清液做抑菌實驗，如圖8所示，結(jié)果表明該菌株最適培養(yǎng)時間為 4 1。4)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJXl (CGMCC No. 5498)培養(yǎng)時搖床轉(zhuǎn)速的
確定接種HJXl菌株的LB培養(yǎng)液分別在130、150、170、190和210rpm條件下，30°C，振蕩培養(yǎng)48h。離心，取上清液做抑菌實驗，如圖9所示，結(jié)果表明該菌株發(fā)酵培養(yǎng)時的搖床轉(zhuǎn)速為 170rpm。5)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJXl (CGMCC No. 5498)培養(yǎng)時 pH 的確定將HJXl 菌株接種于 pH 分別為 3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0、9. 0、10. 0 的 LB 培養(yǎng)液中，30°C，170rpm，搖床振蕩培養(yǎng)48h。離心，取上清液做抑菌實驗，如圖10所示，結(jié)果表明該菌株發(fā)酵培養(yǎng)時的最適PH值為7. 0。實施例2枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJXl (CGMCC No. 5498)產(chǎn)耐熱蛋白的實驗UHJXl菌株蛋白粗提液制備將保存的HJXl菌株活化后接種于LB液體培養(yǎng)基中，30°C，170r/min，振蕩培養(yǎng)48h 后，在冷凍高速離心機中10，OOOr/min離心IOmin后，收集上清液，然后在去菌體發(fā)酵液中加入硫酸銨至80%的飽和度，4°C沉淀20 Mh。在冷凍高速離心機中10，000r/min離心 20min，收集沉淀。將沉淀用磷酸緩沖液溶解后在透析袋(截留分子量為5KDa)中于4°C冰箱內(nèi)用蒸餾水進行透析48h，期間換水一次。然后將透析液倒入培養(yǎng)皿中，用保鮮膜封口后用無菌針頭刺出適量多的小孔，在-80°C冰箱中冷凍后置于冷凍干燥儀中凍干，凍干物用原體積1/20的25mmol/L的磷酸緩沖液溶解。2、病原真菌孢子懸浮液將香蕉枯萎病菌在PDA平板培養(yǎng)3天，從菌落邊緣挑取菌絲塊，接種于PDB培養(yǎng)液中，裝液量為每三角瓶O50mL)中盛有IOOmL PDB培養(yǎng)液，，170r/min，搖床振蕩培養(yǎng) 4 7天。根據(jù)培養(yǎng)情況，無菌紗布過濾去大塊菌絲體，得到分生孢子懸浮液；血球計數(shù)板計數(shù)，將制備的懸浮液用無菌水調(diào)整到濃度為108CFU/mL。3、對病原真菌的抑菌活性測定采用混菌法測定蛋白粗提液對香蕉枯萎病菌的抑菌活性融化瓊脂含量1. 0% 的PDA培養(yǎng)基，然后冷卻至37°C左右時，每IOOmL中加入ImL病原真菌的孢子懸浮液混合均勻，倒平板。在每個平板上放置2個內(nèi)直徑為6mm的無菌牛津杯。其中一個加入 100 μ L25mmol/L的磷酸緩沖液作為對照，另一個中加入100 μ L制備的蛋白粗提液。設(shè)3次重復(fù)。在4°c冰箱中放置過夜后在^rc恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 5天，測量抑菌圈直徑(牛津杯外圈到長有菌落之間未長菌落的徑線距離)。4、HJXl菌株產(chǎn)耐熱抗菌活性蛋白的確定將制備的HJXl菌株的蛋白粗提液分別于40、60、80、100°C的水浴鍋中處理30min， 再進行抑菌活性測定，用制備保存的蛋白粗提液為對照，5次重復(fù)。結(jié)果表明，菌株HJXl的粗提蛋白液經(jīng)40、60、80°C、10(TC水浴處理后抑菌效果不變，這充分說明菌株HJXl可產(chǎn)生抑制香蕉枯萎病菌的耐熱蛋白，如圖4、圖5所示。實施例3枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) HJXl (CGMCC No. 5498)對病原真菌的拮抗效果實驗在PDA培養(yǎng)基平板中央分別將直徑6mm的供試病原真菌菌塊(香蕉枯萎病菌、棉花枯萎病菌、水稻稻瘟病菌、三七根腐病菌、康乃馨鐮刀病菌、甘蔗莖腐病菌，均有本實驗室保存)接入，然后用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌株HJXl的菌液在距離病原真菌菌塊2cm的地方呈三角型點接3 μ 1菌液，置恒溫培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)(處理組)，以點接無菌水的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌塊為對照，培養(yǎng)至對照病原菌長滿皿后測量病原菌生長距離，計算平均抑菌效果。抑制率(％)=[(對照組病原菌生長半徑-處理組病原菌生長半徑)/(對照組病原菌生長半徑-接種菌餅半徑)]X 100%。結(jié)果該菌株對香蕉枯萎病菌的抑制率為89. 2%， 對其余幾種病原真菌的抑制率在64. 3 86. 5%之間，表明該菌株對多種病原真菌具有很強的拮抗活性，結(jié)果見下表(枯草芽孢桿菌(Bacillus SubtiliS)HJXl對不同病原真菌的抑菌率)。
權(quán)利要求
1.一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJXl，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. M98。
2.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HJXl抑制病原真菌的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征是所述枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) HJXl防治的是由病原真菌引起的香蕉枯萎病。
4.一種生物菌劑，其特征是所述生物菌劑含有保藏編號為CGMCC No. 5498的枯草芽孢桿菌HJXl。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物菌劑，其特征是所述生物菌劑中還含有載體和輔料。
6.由權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HJXl產(chǎn)生的耐熱蛋白，其具有附圖2中所示的核苷酸序列。
7.—種權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJXl的培養(yǎng)方法，其特征是培養(yǎng)溫度為28-32°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，已于2011年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.5498。所提供的可產(chǎn)生耐熱蛋白的植物病原真菌拮抗菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJX1，為革蘭氏陽性短桿菌，菌體大小約0.7～0.9×1.8～2.4μm之間，產(chǎn)生芽孢，芽孢中生，圓形，周生鞭毛、具運動性。菌體在LB培養(yǎng)基上能形成乳白色、表面濕潤、圓形、邊緣整齊。最適培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基；培養(yǎng)溫度為28～32℃，最適溫度為30℃，最適PH值7.0。實驗證明，本發(fā)明的植物病原真菌拮抗菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJX1，對香蕉枯萎病、水稻稻瘟病、三七根腐病、棉花枯萎病等病原真菌都有很強的抑菌作用，可以對這些病原菌引起的真菌病害起到防治作用。
文檔編號A01P3/00GK102533617SQ20121004407
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者伍蘇然, 張樹珍, 熊國如, 趙更峰 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所