專利名稱：一種通過組織培養(yǎng)獲得大量小佛肚竹再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種獲得大量小佛肚竹再生苗的方法。
背景技術(shù)：
小佛肚竹屬簕竹屬，又名葫蘆竹、佛竹、密節(jié)竹，是以特形桿作為觀賞性狀的重要觀賞竹之一。小佛肚竹一般具2種桿形正常桿形的小佛肚竹桿下部略呈之字形曲折；畸形桿形的小佛肚竹節(jié)間短縮且腫脹呈花瓶狀。后一桿形常用于制作盆景及庭院栽培作觀賞用，其竹高25-60cm，直徑O. 5-2cm，節(jié)間較短，一般只有2-5cm，或短縮腫脹呈花瓶狀，為著名的觀賞竹種，具有廣闊的市場前景(陳雙林，楊希.觀賞竹種佛肚竹栽培及形態(tài)控制 [J].福建林業(yè)科技，2001，28(1) :79 80)。然而，竹類植物開花間隔期長，開花期無法預(yù)測，且種子獲取十分困難，萌發(fā)率也低。因此，竹子繁殖主要以埋鞭、埋桿、埋節(jié)等傳統(tǒng)方法為主，這些方法具有消耗種竹多、種苗運(yùn)輸不便、勞動強(qiáng)度大、繁殖系數(shù)低等缺點(diǎn)，小佛肚竹也是如此。而且，小佛肚竹畸形桿的變異不穩(wěn)定，利用生物技術(shù)可以高效、快速地對作物品種性狀進(jìn)行遺傳改良，從而為小佛肚竹再生植株的培養(yǎng)提供一種方便、快捷和有效的方法。竹子組織培養(yǎng)方面的研究，最早見于1968年，Alexander和Rao關(guān)于竹子合子胚離體培養(yǎng)的簡報。國外比較系統(tǒng)開展竹子組織培養(yǎng)工作始于20世紀(jì)80年代。我國的竹子組織培養(yǎng)工作開展得較晚，20世紀(jì)90年代才開始，闕國寧等以黃竹和印度箣竹2種叢生竹的嫩節(jié)作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，最終形成完整植株。現(xiàn)階段，國內(nèi)通過以芽繁芽途徑來實現(xiàn)竹子植株的再生，其技術(shù)已趨于成熟，但通過愈傷組織途徑來實現(xiàn)植株的再生，報道并不多。本發(fā)明針對背景技術(shù)的不足和缺陷，克服小佛肚竹組織培養(yǎng)過程中再生難的問題，通過不同生長調(diào)節(jié)劑的組合，設(shè)計出適合小佛肚竹再生的培養(yǎng)基，完成小佛肚竹植株再生的時間最快僅為15周左右。為小佛肚竹的快速繁殖和定向生物技術(shù)育種奠定了堅實的基礎(chǔ)。具有一定的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益，可以促進(jìn)我國竹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種快速、大量獲得小佛肚竹再生植株的方法。本發(fā)明提出的獲得小佛肚竹再生植株的方法，采用愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)，包括小佛肚胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、分化及植株再生等。具體步驟為
(O小佛肚竹胚性愈傷組織的誘導(dǎo)
將無菌的再生芽的芽尖接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，愈傷組織形成四周后將其轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織；其中，所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以 MS為基本培養(yǎng)基，再附加6mg/L2，4-D,O. 001mg/LTDZ、0. 5mg/L萘乙酸(NAA)組成，所述繼代培養(yǎng)基為MS, 5mg/L2, 4-D, O. 5mg/L6-BA, lmg/L 蔡乙酸，lOOmg/L Vc。( 2)胚性愈傷組織的分化將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到愈傷組織分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，至有再生芽分化形成，一般約一個月左右時間；其中，所述愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS，3mg/L6-BA，0. 5mg/LNAA。(3)小佛肚竹的植株再生
將已經(jīng)分化出再生芽的愈傷組織轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)，其中，所述生根培養(yǎng)基含 MS，3mg/l NAA, (O. 1-0. 5) mg/1 6-BA。待根生長至5cm時，可進(jìn)行再生苗的移栽。再生苗移栽花盆中后置于植物生長室中(濕度在60%-80%，溫度(25±1°0，光周期為光照14h/黑暗10h)。上述培養(yǎng)基組分中，MS為MS培養(yǎng)基成分(Murashige & Skoog medium, 1962, Physiol. Plant 15:473-497 )，2，4-D 為 2，4-二氯苯氧乙酸，TDZ 為噻二唑苯基脲，6-BA 為6-芐氨基腺嘌呤，Vc為維生素C。本發(fā)明方法獲得小佛肚竹的頻率高，適宜于小佛肚竹遺傳改良。


圖I小佛肚竹的枝芽外植體。
圖2小佛肚竹枝芽誘導(dǎo)出的愈傷組織。
圖3小佛肚竹愈傷組織在增殖培養(yǎng)基上生長一段時間后的愈傷組織。
圖4小佛肚竹愈傷組織在分化培養(yǎng)基上分化一個月后長出芽體。
圖5小佛肚竹愈傷組織在分化培養(yǎng)基上分化三個月后長出的芽叢。
圖6小佛肚竹再生苗的生根。
圖7移栽成功的小佛肚竹再生植株。
具體實施例方式小佛肚竹組織培養(yǎng)的方法獲得大量再生植株的方法的操作步驟如下
(1)外植體的選擇本發(fā)明的實驗中選取材料為小佛肚竹vantricosa)的無菌苗的再生芽。(圖I)
(2)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與保持選取無菌苗上剛萌發(fā)的再生芽，切取離芽尖約I.5cm 的莖段(圖 2)。接到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+TDZ0. 00lmg/L+ 2，4_D6mg/L+ NAAO. 5mg/L)，四周后愈傷組織形成，將形成的愈傷組織轉(zhuǎn)接到愈傷增殖培養(yǎng)基(MS+5mg/L2，4-D+O. 5mg/ L6-BA+lmg/L萘乙酸+100mg/LVc)進(jìn)行增殖培養(yǎng)。(圖3)
(3)胚性愈傷組織的分化胚性愈傷組織培養(yǎng)30天后，將愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基 (MS+3mg/L6-BA+0. 5mg/LNAA)上，使愈傷組織分化成芽。(圖4、圖5)
(4)再生芽的生根與移栽將分化后的芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中(MS+3mg/l NAA+(0. 1-0. 5)mg/1 6_BA)，2周后，就有不定根產(chǎn)生，待根生長至5cm時，可進(jìn)行再生苗的移栽。再生苗移栽花盆中后置于植物生長室中(濕度在60%-80%，溫度(25±1°0，光周期為光照14h/黑暗IOh)(圖6、圖7)。本實驗中所有培養(yǎng)基都在滅菌前將pH調(diào)到5. 8，滅菌條件為121°C下18min。培養(yǎng)室溫度為(25±1°C)。光周期為14h/黑暗10h。培養(yǎng)物表面的光照強(qiáng)度約為30001x。
權(quán)利要求
1.一種通過組織培養(yǎng)獲得大量小佛肚竹再生植株的方法，其特征在于具體步驟為(1)小佛肚竹胚性愈傷組織的誘導(dǎo)將無菌的再生芽的芽尖接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，愈傷組織形成四周后將其轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，得到胚性愈傷組織；(2)胚性愈傷組織的分化將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到愈傷組織分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，至有再生芽分化形成；(3)小佛肚竹的植株再生將已經(jīng)分化出再生芽的愈傷組織轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述通過組織培養(yǎng)獲得大量小佛肚竹再生植株的方法，其特征在于步驟(I)中所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為以MS為基本培養(yǎng)基，再附加6mg/L2，4_D、0. OOlmg/ LTDZ、0. 5mg/L萘乙酸，所述繼代培養(yǎng)基組成為MS，5mg/L2，4_D，0. 5mg/L6_BA，lmg/L萘乙酸，100mg/L Vc ο
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述通過組織培養(yǎng)獲得大量小佛肚竹再生植株的方法，其特征在于步驟(2)中所述愈傷組織分化培養(yǎng)基組成為MS，3mg/L6-BA，0. 5mg/L萘乙酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述通過組織培養(yǎng)獲得大量小佛肚竹再生植株的方法，其特征在于步驟(3)中所述生根培養(yǎng)基組成為MS，3mg/L萘乙酸，(O. 1-0. 5)mg/ L 6-BA。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種通過組織培養(yǎng)獲得大量小佛肚竹再生植株的方法。該方法包括采用小佛肚竹幼嫩枝芽芽尖為外植體，經(jīng)消毒處理后在經(jīng)改良的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上形成愈傷組織，進(jìn)而誘導(dǎo)胚性愈傷組織的發(fā)生，然后，將胚性愈傷組織接種到改良的分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)胚性愈傷組織分化出芽，再在生根培養(yǎng)基上分化出根，形成完整植株，最后移栽到花盆，完成小佛肚竹再生全程。本發(fā)明方法獲得小佛肚竹的頻率高，適宜于小佛肚竹遺傳改良。
文檔編號A01H4/00GK102577958SQ20121004377
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月26日
發(fā)明者丁雨龍, 林樹燕, 錢維杰, 魏強(qiáng) 申請人:南京林業(yè)大學(xué)