本發(fā)明涉及一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著我國(guó)飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，一些常規(guī)飼料，尤其是蛋白質(zhì)飼料嚴(yán)重缺乏。蛋白質(zhì)飼料資源緊缺已成為當(dāng)今我國(guó)飼料行業(yè)的一個(gè)突出問(wèn)題，并將長(zhǎng)期成為我國(guó)畜牧業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸。尋求非常規(guī)蛋白質(zhì)飼料對(duì)我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展起著非常重要的作用。我國(guó)是一個(gè)產(chǎn)棉大國(guó)，年產(chǎn)棉籽量達(dá)到1100萬(wàn)噸，年產(chǎn)棉粕量在600萬(wàn)噸以上，占蛋白粕總量的10.7％。棉籽餅粕是棉花作物的重要副產(chǎn)品，是棉籽經(jīng)脫殼、加熱、壓扁成薄片用己烷浸出油后，所剩余的副產(chǎn)品。棉籽餅中營(yíng)養(yǎng)豐富，內(nèi)含蛋白質(zhì)40％以上(與豆餅接近)，粗纖維11-15％，賴氨酸1.59％，蛋氨酸0.52％，以及較多的維生素B，硫胺素和有機(jī)磷等，是畜禽飼料中非常有價(jià)值的一種原料。然而，棉籽餅中含有棉酚、環(huán)丙稀脂肪酸、單寧等有毒物質(zhì)，制約了其在畜牧業(yè)中的應(yīng)用，其中最主要的是棉酚。

棉酚(gossypol)俗稱棉毒素，占普通棉籽的0.7％-4.8％，是錦葵科棉屬植物色素腺產(chǎn)生的多酚二萘衍生物，存在棉花的根、莖、葉和籽實(shí)的色素腺體中，尤其是籽實(shí)棉仁的球狀腺體中含量較多。最早是由英國(guó)化學(xué)家Longmore從棉籽中分離出來(lái)的，是一種黃色的色素物質(zhì)。棉酚純品是由俄國(guó)人Marehiewski于1899年最先從棉籽油的下腳料中分離出來(lái)的，棉酚純品為黃色結(jié)晶，能溶于低沸點(diǎn)石油醚和水，熔點(diǎn)181-185℃，分子式為C₃₀H₃₀O₈，分子量518.55。棉籽體內(nèi)棉酚的存在形式有兩種，即結(jié)合棉酚和游離棉酚。結(jié)合棉酚在機(jī)體消化系統(tǒng)中不被吸收，可很快隨糞便排出體外，毒性很低。游離棉酚分子結(jié)構(gòu)中的活性基團(tuán)(醛基和羧基)對(duì)動(dòng)物毒性很大，游離棉酚含量在0.02％時(shí)無(wú)毒，0.02％-0.05％時(shí)輕微毒性，高于0.15％時(shí)具有強(qiáng)毒性。棉籽餅粕在飼料中的用量只有40％左右，極大限制了棉粕在畜禽飼料中的應(yīng)用。長(zhǎng)期飼喂動(dòng)物過(guò)多的棉粕飼料，尤其是未將棉粕進(jìn)行脫毒處理時(shí)，棉酚含量會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)蓄積，引發(fā)中毒。導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)急性呼吸窘迫臨床癥狀，厭食乏力，甚至死亡等。因此有必要尋求一種有效方式來(lái)利用棉籽粕，降低棉酚含量，這對(duì)解決我國(guó)蛋白資源嚴(yán)重短缺發(fā)揮巨大作用。

目前，降解棉酚的方法主要有化學(xué)法、物理法和微生物發(fā)酵法等，其中微生物發(fā)酵法是對(duì)棉籽餅粕中棉酚進(jìn)行降解的一種新方法，該方法不僅能降解棉籽粕中的游離棉酚，而且還可改善棉籽粕粗飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和飼用價(jià)值，增加適口性和采食量，提高棉粕的利用率，是目前普遍認(rèn)為的成本低、效果好、較安全的脫毒方法。但不同微生物菌種對(duì)棉酚的降解能力有較大的差異，篩選優(yōu)良的微生物菌種是影響棉籽餅粕脫毒效果和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的首要步驟。目前報(bào)道的用于棉籽餅粕脫毒的菌株種類較少，且主要集中于酵母菌和霉菌。而對(duì)于降解棉酚的枯草芽孢桿菌，相關(guān)的研究主要有：“高效降解棉酚菌株的篩選鑒定及毒性試驗(yàn)”(中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28(12)：112-117)和“棉酚降解菌株的分離及對(duì)棉餅的脫毒效果”(江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(11)：220-224)。上述研究分別從保定某棉花田地和保定某地棉籽榨油廠內(nèi)的土壤中篩選得到具有降解棉酚作用的枯草芽孢桿菌菌株M-9和菌株M-4，上述菌株M-9和菌株M-4雖然對(duì)棉酚具有較高的降解活性，但仍存在一些不足，如：在對(duì)棉籽餅粉進(jìn)行發(fā)酵脫毒時(shí)，需要額外加入碳源(蔗糖等)，增加了棉酚降解的成本；而且菌種的接種量大(10％)、降解所需時(shí)間長(zhǎng)(60h以上)。上述不足限制了其在棉酚脫毒中的應(yīng)用，因此，篩選新的具有快速、高效降解棉酚能力的枯草芽孢桿菌具有十分重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢桿菌，即為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039，已于2016年11月22日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，地址為：武漢市武昌珞珈山，其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2016663。

該菌株是從新疆棉籽餅粕中分離得到的，將菌株BLCC1-0039的純培養(yǎng)物接種于芽孢桿菌培養(yǎng)基平皿，37℃培養(yǎng)20h，形成灰白色菌落，不透明，表面較粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀。光學(xué)顯微鏡下觀察，革蘭氏陽(yáng)性，桿狀。

本發(fā)明的第二方面，提供一種菌劑，其活性成分為上述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039的發(fā)酵產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供上述菌劑的制備方法，包括如下步驟：發(fā)酵上述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039，得到發(fā)酵產(chǎn)物。

上述制備方法中，發(fā)酵采用的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化鈉0.5％、酵母膏0.5％、初始pH 7.0，均為質(zhì)量百分比。

上述制備方法中，發(fā)酵的條件為：35-40℃、罐壓0.05MPa、攪拌轉(zhuǎn)速220-260rpm、通氣量20m³/h，待芽孢率≥90％時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。

本發(fā)明的第三方面，提供上述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039和/或菌劑在降解游離棉酚中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，上述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039和/或菌劑在降低棉籽粕的游離棉酚含量中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供上述枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039在發(fā)酵棉粕生產(chǎn)中性蛋白酶和酸溶蛋白中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明首次從新疆棉粕中篩選分離得到一株具有高效降解棉酚能力的枯草芽孢桿菌，該菌株在只含有棉粕的培養(yǎng)基中即可實(shí)現(xiàn)對(duì)游離棉酚的降解，無(wú)需額外添加碳源，大大降低了棉酚降解的成本；而且，采用本發(fā)明的枯草芽孢桿菌，在2％的接種量、固體發(fā)酵48h的條件下，即可達(dá)到97.81％的棉酚降解率，實(shí)現(xiàn)了對(duì)游離棉酚快速、高效的降解。

(2)本發(fā)明的枯草芽孢桿菌在降解棉酚的同時(shí)，還能利用棉粕發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶和酸溶蛋白，中性蛋白酶的酶活性最高可達(dá)4101U/g，酸溶蛋白的含量可達(dá)26.96％。

附圖說(shuō)明

圖1：BLCC1-0039的菌落培養(yǎng)性狀；

圖2：BLCC1-0039的菌體形態(tài)(油鏡觀察)；

圖3：BLCC1-0039菌株固體發(fā)酵新疆棉粕產(chǎn)中性蛋白酶曲線。

具體實(shí)施方式

結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。

本發(fā)明實(shí)施例2和實(shí)施例5中所提及的“接種量”是指：每100g物料中接種的菌株種子液的體積，mL/100g。

實(shí)施例1：菌株的篩選與鑒定

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

棉粕由新疆泰昆集團(tuán)提供；醋酸棉酚購(gòu)自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司。

1.2培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基：醋酸棉酚0.10％、氯化鈉0.10％、硫酸銨0.50％、七水硫酸鎂0.05％、磷酸二氫鉀0.10％和瓊脂2.0％，吐溫-80 0.75％；均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

初篩斜面培養(yǎng)基：醋酸棉酚0.10％、氯化鈉0.10％、硫酸銨0.50％、七水硫酸鎂0.05％、磷酸二氫鉀0.10％和瓊脂2.0％，吐溫-80 0.75％；均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨1.0％、牛肉膏0.3％、氯化鈉0.5％，均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。pH值7.2-7.4，121℃滅菌15min備用。

復(fù)篩液體培養(yǎng)基：醋酸棉酚0.5％、氯化鈉0.10％、硫酸銨0.50％、七水硫酸鎂0.05％、磷酸二氫鉀0.10％，吐溫-80 0.75％；均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

芽孢桿菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化鈉0.5％、酵母膏0.5％，均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。pH值7.0，121℃滅菌30min備用。

芽孢桿菌平皿培養(yǎng)基：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化鈉0.5％、酵母膏0.5％，瓊脂1.5％，均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。pH值7.0，121℃滅菌30min備用。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1分離樣品：新疆棉粕。

1.3.2游離棉酚含量的測(cè)定：采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定棉粕中游離棉酚含量。

1.3.3棉酚降解菌株的初篩

取1.0g新疆棉粕放入99mL無(wú)菌水的三角瓶中制成1×10^-2的樣品稀釋液，在30℃，180r/min條件下充分振蕩30min，搖勻靜置。取1mL上清液加入盛有9mL無(wú)菌水的試管中進(jìn)行一系列梯度稀釋，制成1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5和1×10^-6不同稀釋度的稀釋液。然后將4個(gè)梯度稀釋的稀釋液涂布于初篩培養(yǎng)基平板上，于30℃恒溫箱倒置培養(yǎng)2-3d，挑取平板上具有明顯差異的菌落形態(tài)，Z形重復(fù)劃線接種于初篩培養(yǎng)基上，直至純化出單菌落，然后轉(zhuǎn)接于初篩斜面培養(yǎng)基上，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4棉酚降解菌株的復(fù)篩

將初篩得到的菌株于棉酚復(fù)篩培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，將初篩所得到的候選菌株以營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基活化后接種于100mL復(fù)篩液體培養(yǎng)液中，在30℃下180r/min搖床培養(yǎng)72h；培養(yǎng)液離心(4℃，5 000r/min)10min，上清液用0.2μm微孔濾膜過(guò)濾，得到除菌的發(fā)酵液；高效液相色譜法分別測(cè)定發(fā)酵前后發(fā)酵液中棉酚的含量并記錄，根據(jù)發(fā)酵液中棉酚的降解率，選取降解游離棉酚效果較好的菌株。

1.3.5菌株鑒定

(1)形態(tài)學(xué)鑒定

挑取降解游離棉酚效果最好的菌株的純培養(yǎng)物種接于芽孢桿菌培養(yǎng)基平皿，37℃培養(yǎng)20h，觀察菌落形態(tài)。

(2)分子生物學(xué)鑒定

將目的菌株接種于新鮮的芽孢桿菌液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h，采用天根公司的試劑盒提取菌體DNA，并對(duì)其進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增。所用引物為通用引物：

1492r：5，-ggttaccttgttacgactt-3，；

27f：5，-agagttgatcctggctcag-3，。

PCR反應(yīng)體系(50μL)為：Mixture 25μL(含Taq DNA聚合酶及dNTP等，天根生化科技有限公司)，上下游引物各1μL，模板DNA2μL，超純水21μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，25個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物送北京博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果如SEQ ID NO.1所示。

2試驗(yàn)結(jié)果

2.1菌株的分離篩選：將從新疆棉粕中分離得到的形態(tài)特征不同的單菌落經(jīng)純化后并分別接種到以醋酸棉酚為唯一碳源的初篩培養(yǎng)基平板上，共分離得到6株能夠在初篩培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株；然后經(jīng)過(guò)醋酸棉酚復(fù)篩培養(yǎng)基的篩選，得到對(duì)棉酚耐受性最強(qiáng)的1株候選菌株，編號(hào)為BLCC1-0039。

2.2BLCC1-0039菌株的鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)鑒定

菌株BLCC1-0039在37℃培養(yǎng)20h，形成灰白色菌落，不透明，表面較粗糙，似毛玻璃狀或融蠟狀(如圖1)。光學(xué)顯微鏡下觀察，革蘭氏陽(yáng)性，桿狀(如圖2)。

2.2.2分子生物學(xué)鑒定

菌株BLCC1-0039的16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，在分子量大小為1500bp左右得到一條特異性好的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，并進(jìn)行測(cè)序，序列如SEQ ID NO.1所示。將測(cè)序序列與http://www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站上已登錄的部分菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，菌株BLCC1-0039與已報(bào)道的Bacillus subtilis(EU346662.1、HQ317166.1和KF836543.1等)的序列同源性為99％。鑒定BLCC1-0039菌株屬于枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

上述獲得的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039，已于2016年11月22日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC)，地址為：武漢市武昌珞珈山，其保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2016663。

實(shí)施例2：不同芽孢桿菌的降解棉酚的能力和產(chǎn)酶活性比較

1材料與方法

1.1材料

1.1.1發(fā)酵基料：棉粕，由新疆泰昆集團(tuán)有限公司提供。

1.1.2菌種：本發(fā)明實(shí)施例1篩選得到的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039。

芽孢桿菌BLCC1-0090、BLCC1-0157、BLCC1-0169，均由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司生物研究院菌種保藏中心分離保存。

1.2方法

稱取一定量的新疆棉粕于1000mL三角瓶中，料水比為1：0.4(g/mL)，裝量100g/瓶，攪拌均勻后，按2％接種量分別接入本實(shí)施例“1.1.2”的菌種，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，于37℃培養(yǎng)箱中需氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24h和48h取樣，測(cè)定發(fā)酵樣芽孢桿菌活菌數(shù)、中性蛋白酶活性、酸溶蛋白含量及棉酚含量。

上述指標(biāo)的測(cè)定方法如下：

(1)芽孢桿菌活菌數(shù)的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取發(fā)酵新疆棉粕10.0g，用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當(dāng)稀釋度的樣品分別至芽孢桿菌平皿培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算樣品中芽孢桿菌活菌數(shù)，結(jié)果用cfu/g發(fā)酵料表示。

(2)中性蛋白酶活性的測(cè)定

取發(fā)酵棉粕1.0g，采用福林-酚試劑法測(cè)定樣品中中性蛋白酶活性。

中性蛋白酶酶活定義：1g固體酶粉(或1mL液體酶)，在一定溫度和pH值條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸為一個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

(3)酸溶蛋白含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取2.00g樣品于25mL具塞試管中，加入15％三氯乙酸溶液10mL，混合均勻，靜止5min。定容至25mL，每隔2min混勻一次，共計(jì)時(shí)30min。將溶液定量轉(zhuǎn)移，抽濾，取濾液10mL，轉(zhuǎn)入消化管中，加入3g混合催化劑(硫酸鉀：無(wú)水硫酸銅＝15:1)，與濾液混合均勻，再加入7-8mL濃硫酸，將消化管置于消化爐中420℃消化，待消化液呈透亮的藍(lán)綠色時(shí)，繼續(xù)消化40min，按照凱氏定氮法測(cè)定上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量。

酸溶蛋白含量％＝(上清液中可溶性蛋白質(zhì)含量×25/10)/樣品中粗蛋白含量。

(4)棉酚含量的測(cè)定

棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取棉酚標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈溶解得1.23mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，貯備液再用乙腈稀釋成123μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液。用流動(dòng)相將標(biāo)準(zhǔn)品工作液逐級(jí)稀釋得到濃度分別為61.5μg/mL、12.3μg/mL、6.15μg/mL和1.23μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度由低至高進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積和濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，為：Y＝0.00000545X+0.160525(R²≥0.9999652)，線性范圍為1.23-123μg/mL。

待測(cè)樣品游離棉酚的提?。簻?zhǔn)確稱取待測(cè)樣品3.00g，加入丙酮30mL，超聲提取30min，3000r/min 25℃離心10min，重復(fù)提取3次，合并上清液。全部轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙腈-0.2％磷酸(體積比為85:15)溶液溶解，多次超聲清洗轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶，定容，過(guò)0.22μm濾膜后供HPLC測(cè)定。

高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定棉酚含量：色譜條件為色譜柱Intertsil○R ODS-2(150mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.2％磷酸(體積比為85:15)溶液，流速1.0mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)235nm，進(jìn)樣量20μL，柱溫25℃。

2結(jié)果

2.1不同芽孢桿菌發(fā)酵對(duì)新疆棉粕品質(zhì)的影響

表1不同芽孢桿菌發(fā)酵新疆棉粕對(duì)酸溶蛋白、活菌數(shù)和中性蛋白酶含量的影響

由表1可知，24h時(shí)，在芽孢桿菌活菌數(shù)方面各菌株間差異不顯著，均在幾十億水平。酸溶蛋白含量以BLCC1-0039最高，其次是BLCC1-0157。中性蛋白酶活性方面以BLCC1-0039最高，酶活性達(dá)到4111.40U/g發(fā)酵料，其次是BLCC1-0157，均顯著高于BLCC1-0090和BLCC1-0169；

48h時(shí)，和對(duì)照組相比，各菌株均顯著提高酸溶蛋白含量，其中BLCC1-0039菌株發(fā)酵時(shí)最高。芽孢桿菌活菌數(shù)各菌株間差異不顯著，均能夠成功發(fā)酵棉粕。中性蛋白酶活性方面以BLCC1-0039最高，酶活性達(dá)到3983.24U/g發(fā)酵料，其次是BLCC1-0157，兩菌株間差異不大。

綜上可知，菌株BLCC1-0039發(fā)酵新疆棉粕可以顯著提高酸溶蛋白和中性蛋白酶活性。

2.2不同芽孢桿菌發(fā)酵新疆棉粕對(duì)棉酚含量的影響

表2不同芽孢桿菌發(fā)酵新疆棉粕對(duì)棉酚含量的影響

注：棉酚降解率＝[(對(duì)照樣品棉酚含量-發(fā)酵樣棉酚含量)/對(duì)照樣品棉酚含量]×100％；

由表2可知，發(fā)酵24h時(shí)以菌株BLCC1-0039棉酚含量最低，降解率達(dá)到93.89％，其次是菌株BLCC1-0157；菌株BLCC1-0039發(fā)酵新疆棉粕48h時(shí)棉酚含量為1.82μg/g，降解率為96.67％，顯著高于其余三株菌株發(fā)酵時(shí)。綜合可知，四株芽孢桿菌中以菌株BLCC1-0039發(fā)酵新疆棉粕降棉酚效果最好。

實(shí)施例3：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039菌粉的制備

1基礎(chǔ)培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌BLCC1-0039菌株菌粉的生產(chǎn)采用芽孢桿菌培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2菌種：選用本發(fā)明的枯草芽孢桿菌BLCC1-0039；

斜面培養(yǎng)：將枯草芽孢桿菌BLCC1-0039凍干粉菌種接種于芽孢桿菌固體斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h；

一級(jí)種子培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的斜面，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于100mL芽孢桿菌液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下，180rpm/min培養(yǎng)24h，制得一級(jí)種子液；

3 50L種子罐發(fā)酵

3.1培養(yǎng)基

葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化鈉0.5％、酵母膏0.5％，均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，初始pH 7.0，裝量為30L。

3.2滅菌、發(fā)酵

滅菌：空消，121℃30min；

實(shí)消：夾層加溫，121℃30min完成實(shí)消。

接種：待培養(yǎng)基溫度降至50℃接種，按照1％(體積百分?jǐn)?shù))接種量接入一級(jí)種子液。

發(fā)酵：接種后37℃培養(yǎng)，罐壓0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速260rpm培養(yǎng)16h制得二級(jí)種子液。

4發(fā)酵：500L發(fā)酵罐發(fā)酵

4.1培養(yǎng)基：同50L種子罐發(fā)酵，裝量為300L。

4.2滅菌

空消，121℃30min；

實(shí)消：夾層加溫，121℃30min完成實(shí)消。

4.3接種

待培養(yǎng)基溫度降至50℃接種，按1％(體積百分?jǐn)?shù))接種量接入二級(jí)種子液。

4.4發(fā)酵及發(fā)酵過(guò)程控制

接種后37℃培養(yǎng)，罐壓0.05MPa，攪拌轉(zhuǎn)速220rpm，通氣量20m³/h。

發(fā)酵期間每2h取樣一次，鏡檢，待芽孢率≥90％時(shí)放罐。

5后處理

發(fā)酵結(jié)束后，立即噴霧干燥，即得菌粉成品。

實(shí)施例4：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039安全性試驗(yàn)

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)菌株：本發(fā)明實(shí)施例3制備的枯草芽孢桿菌BLCC1-0039菌粉。

1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物：昆明系小白鼠，體重20±2g，購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司。

1.1.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)：選擇體重20±2g健康昆明種小鼠100只，雌雄各半?；A(chǔ)日糧預(yù)飼一周后隨機(jī)分為5組，每組20只，雌雄各10只，分籠喂養(yǎng)，其中一組為對(duì)照組，其余四組為試驗(yàn)組，分別灌胃1×10⁸cfu/mL、10×10⁸cfu/mL、100×10⁸cfu/mL和1000×10⁸cfu/mL。

1.1.4給藥

給藥方式為灌胃，各組小鼠禁食16h后，對(duì)照組灌胃生理鹽水，其余4個(gè)試驗(yàn)組分別灌胃生理鹽水稀釋好的菌粉，按照0.4mL/20g體重的受試樣品量進(jìn)行灌胃給樣，連續(xù)灌胃兩天，每次灌胃后密切觀察2小時(shí)，2h后常規(guī)飲食，連續(xù)觀察14天，每天定時(shí)觀察記錄。

1.1.5觀察指標(biāo)

①肉眼觀察詳細(xì)記錄被毛和皮膚、眼睛和粘膜，呼吸、循環(huán)、自主神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢體活動(dòng)和行為等改變。特別注意是否出現(xiàn)震顫、抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡和昏迷等癥狀。應(yīng)記錄毒作用體征出現(xiàn)和消失的時(shí)間和死亡時(shí)間。

②小鼠體重于試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)、7d和14d分別對(duì)每組雌雄小鼠進(jìn)行稱重，比較其體重情況。

③病理學(xué)檢查14d時(shí)對(duì)各組小鼠取5只進(jìn)行尸檢，觀察臟器器官病變，對(duì)觀察有變化的臟器需進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

2試驗(yàn)結(jié)果

2.1各組小白鼠的生長(zhǎng)和死亡情況

表3 BLCC1-0039菌粉對(duì)各組雌性小鼠生長(zhǎng)和死亡情況的影響

由表3可知，在14d觀察期內(nèi)，雌性小鼠體態(tài)觀察正常，四肢活動(dòng)正常，對(duì)體重?zé)o顯著性影響，各組均沒(méi)有出現(xiàn)死亡情況。解剖仔細(xì)觀察肝臟、腎臟和脾臟，均無(wú)肉眼可見(jiàn)病變。

表4 BLCC1-0039菌粉對(duì)各組雄性小鼠生長(zhǎng)和死亡情況的影響

由表4可知，在14d觀察期內(nèi)，雄性小鼠體態(tài)觀察正常，四肢活動(dòng)正常，對(duì)體重?zé)o顯著性影響，各組均沒(méi)有出現(xiàn)死亡情況。解剖仔細(xì)觀察肝臟、腎臟和脾臟，均無(wú)肉眼可見(jiàn)病變。

2.2各組小白鼠的器官指數(shù)

表5 BLCC1-0039菌粉對(duì)各組小鼠器官指數(shù)的影響

由表5可知，BLCC1-0039菌粉對(duì)各試驗(yàn)組小白鼠的脾臟指數(shù)和肝體比沒(méi)有顯著性影響。

綜上，本發(fā)明制備的BLCC1-0039菌粉使用安全，無(wú)毒副作用。

實(shí)施例5：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BLCC1-0039在降低棉籽粕的游離棉酚含量以及發(fā)酵棉粕生產(chǎn)中性蛋白酶和酸溶蛋白中的應(yīng)用

5.1不同接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)游離棉酚降解的影響

從BLCC1-0039斜面上挑取一環(huán)接種至裝有50mL芽孢桿菌液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于37℃、190r/min搖床培養(yǎng)24h，取樣鏡檢，待芽孢率≥95％時(shí)備用；

配料：稱取一定量的粉碎后可以過(guò)50目的新疆棉粕于1000mL三角瓶中，料水比為1:0.4(g:mL)，裝量100g/瓶，分別按2％、4％、8％和10％接種量分別接入培養(yǎng)好的BLCC1-0039種子液，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，每個(gè)接種量設(shè)3個(gè)平行，均置于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行需氧固體發(fā)酵，分別于發(fā)酵0h、12h、24h、36h、48h和60h取樣，測(cè)定棉酚含量，結(jié)果如表6所示。

表6接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)棉酚含量的影響(μg/g)

由表6可知，2％接種量時(shí)，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)棉酚含量呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵12h、24h、36h、48h和60h時(shí)棉酚降解率分別為59.18％、94.67％、96.15％、97.70％和98.30％，其中發(fā)酵24h棉酚降解率即可達(dá)到90％以上，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)棉酚的快速降解。

5.2BLCC1-0039菌株發(fā)酵新疆棉粕對(duì)游離棉酚含量、中性蛋白酶活性和酸溶蛋白含量的影響

從BLCC1-0039斜面上挑取一環(huán)接種至裝有50mL芽孢桿菌液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于37℃、190r/min搖床培養(yǎng)24h，取樣鏡檢，待芽孢率≥95％時(shí)備用；

配料：稱取一定量的粉碎后可以過(guò)50目的新疆棉粕于1000mL三角瓶中，料水比為1:0.4(g:mL)，裝量100g/瓶，設(shè)3個(gè)平行，分別按2％接種量分別接入培養(yǎng)好的BLCC1-0039種子液，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，均置于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行需氧固體發(fā)酵，分別于發(fā)酵0h、6h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h和48h取樣，測(cè)定中性蛋白酶活性、棉酚含量和酸溶蛋白含量。中性蛋白酶結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，BLCC1-0039菌株固體發(fā)酵新疆棉粕至12h，可以測(cè)得中性蛋白酶活，但活性低于1000U/g，之后隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)中性蛋白酶活性增加，24h中性蛋白酶活性達(dá)到3900U/g，之后中性蛋白酶活性維持一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定水平，36h中性蛋白酶活性達(dá)到最高，為4101U/g。

BLCC1-0039菌株固體發(fā)酵新疆棉粕對(duì)棉酚含量的影響結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 BLCC1-0039菌株固體發(fā)酵新疆棉粕對(duì)棉酚含量的影響(μg/g)

由表7可知，菌株BLCC1-0039固體發(fā)酵新疆棉粕12h時(shí)，棉酚降解率達(dá)到58.83％，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，棉酚降解率呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，發(fā)酵24h時(shí)棉酚含量?jī)H為2.87μg/g，降解率達(dá)到94.63％，隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)棉酚含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，直至48h棉酚含量?jī)H為1.17μg/g，棉酚降解率為97.81％。說(shuō)明菌株BLCC1-0039發(fā)酵新疆棉粕后能夠在短時(shí)間內(nèi)大大降低了游離棉酚的含量。

BLCC1-0039菌株固體發(fā)酵新疆棉粕對(duì)酸溶蛋白含量的影響結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 BLCC1-0039菌株固體發(fā)酵新疆棉粕對(duì)酸溶蛋白含量的影響(％)

由表8可知，酸溶蛋白含量隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，48h時(shí)酸溶蛋白最高，為26.96％。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司

<120> 一株具有降解棉酚能力的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1453

<212> DNA

<213> 菌株BLCC1-0039

<400> 1

agaatgcggg tgctatacat gcaagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60

agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120

aaaccggggc taataccgga tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct 180

tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240

ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300

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attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900

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tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg 1020

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aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1200

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