本發(fā)明涉及化合物的制備方法，具體涉及一種高純巖藻黃醇的制備方法，能夠用于食品加工技術(shù)及功能保健領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

巖藻黃質(zhì)(fucoxanthin)亦稱褐藻黃素，是自可食用褐藻中，如裙帶菜(翅藻科，Undaria pinnatifida)，海帶(Laminaria japonica Aresch)中提取出來的天然類胡蘿卜素，在其剛性全反式長鏈的兩端分別有一個化學(xué)性質(zhì)活潑的5，6-環(huán)氧非飽和丙二烯鍵結(jié)構(gòu)，因而又異于其他類胡蘿卜素分子，具有很強(qiáng)的生物活性。近年來它的多種生物學(xué)活性已被證實(shí)，一些潛在的活性也正在被科學(xué)家們積極探求之中，目前己成為當(dāng)今海洋藥物研究與開發(fā)的主攻熱點(diǎn)之一。

巖藻黃醇是巖藻黃質(zhì)脫去一個乙酰基的代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)與巖藻黃質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似，具有很強(qiáng)的生物活性，包括抗腫瘤、抗炎、抗氧化、減肥等多種生物活性。近年來研究表明，小鼠口服巖藻黃質(zhì)后可將其轉(zhuǎn)化為巖藻黃醇而得到利用。Hayato Maeda等研究也發(fā)現(xiàn)3T3-L1細(xì)胞系中的巖藻黃質(zhì)代謝產(chǎn)物巖藻黃醇可以通過減少PPARγ(過氧化物酶體增殖激活受體)從而達(dá)到抑制3T3-L1前成脂肪細(xì)胞系到脂肪細(xì)胞系分化的目的，從而達(dá)到減肥的效果。有研究表明，巖藻黃醇的體外抗腫瘤活性甚至強(qiáng)于巖藻黃質(zhì)。目前國內(nèi)僅少數(shù)幾個廠家提取制備低含量巖藻黃質(zhì)原料(HPLC法，含量＜1％)，出口歐美、日本等國家，目前國內(nèi)外尚未見到巖藻黃醇批量制備研究的報(bào)道，不能對巖藻黃醇以及巖藻黃醇系列產(chǎn)品進(jìn)行高值化開發(fā)應(yīng)用，因此，有必要發(fā)明一種高純巖藻黃醇的制備方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種以巖藻黃質(zhì)為底物，通過還原反應(yīng)制備巖藻黃醇得到巖藻黃醇粗提物的方法，還提供一種將巖藻黃醇粗提物再進(jìn)行分離純化獲得高純樣品的方法。

本發(fā)明一方面涉及一種巖藻黃質(zhì)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)、以巖藻黃質(zhì)或者含巖藻黃質(zhì)的提取物為原料；

2)、將原料用溶劑溶解,加入一定比例還原劑還原反應(yīng)得含有巖藻黃醇的反應(yīng)液；

3)、將反應(yīng)液濃縮至干，加水混懸，采用有機(jī)溶劑萃取，得到巖藻黃醇萃取液；

4)、將萃取液濃縮至干，加入流動相溶解，后采用半制備/制備型液相色譜制備分離得到制備液相純化液；

5)將制備液相純化液濃縮，后將濃縮液進(jìn)行干燥，得到巖藻黃醇高純單體。

優(yōu)選地，步驟2)中所述的溶劑為有機(jī)溶劑，優(yōu)選甲醇、乙醇、四氫呋喃。

優(yōu)選地，步驟2)中所述還原劑為硼氫化鈉、氫化鋁鋰、氯化亞錫、草酸、硼氫化鉀、硫酸亞鐵、亞硫酸鈉等的一種或者幾種組合；其中最優(yōu)選硼氫化鈉。

優(yōu)選地，步驟2)中所述的原料與還原劑比例為50：1至1：1，可選自50:1，40:1，30:1，20:1,10:1，5:1，1:1。

優(yōu)選地，步驟2)中所述的反應(yīng)溫度為20-50℃，可選自25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃；反應(yīng)時間為0.5-48h，可選自0.5h、1h、2h、4h、8h、10h、12h、16h、20h、24h、48h。

優(yōu)選地，步驟3)中所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷或者正丁醇。

優(yōu)選地，步驟4)中所述的流動相為甲醇-水、乙腈-水、乙醇-水三種體系溶劑以及該三種體系溶劑以任意比例混合的溶劑。

優(yōu)選地，步驟4)為將萃取液濃縮至干，加入流動相溶解，轉(zhuǎn)入半制備/制備型高效液相色譜進(jìn)樣瓶中，啟動半制備/制備型高效液相色譜進(jìn)行分離純化，通過紫外在線檢測信號觸發(fā)餾分收集器自動收集巖藻黃醇純化液

優(yōu)選地，步驟4)所述半制備/制備型高效液相色譜采用的半制備/制備柱填料為C8柱或C18柱。

優(yōu)選地，步驟4)所述半制備/制備型高效液相色譜采用的半制備/制備柱的直徑為10-50mm。

優(yōu)選地，步驟4)所述的半制備/制備型高效液相色譜采用的進(jìn)樣量為100μL/次-20mL/次。

優(yōu)選地，步驟4)所述的半制備/制備型高效液相色譜采用的流動相流速為5-200mL/min，優(yōu)選5、6、10、20、28、50、80、100、120、150、180、200mL/min。

優(yōu)選地，步驟4)所述的半制備/制備型高效液相色譜采用的檢測器為紫外檢測器或二極管陣列檢測器，檢測波長為400-500nm，優(yōu)選450nm。

優(yōu)選地，步驟5)所述減壓濃縮溫度為20-50℃，干燥方式為冷凍干燥。

優(yōu)選地，步驟5)所述高純巖藻黃醇，純度大于99％。

附圖說明

圖1實(shí)施例1中巖藻黃醇制備色譜圖

圖2實(shí)施例1中巖藻黃醇純度檢測色譜圖

圖3實(shí)施例1所制備的巖藻黃醇的核磁共振氫譜圖

圖4實(shí)施例1所制備的巖藻黃醇的核磁共振碳譜圖

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1)還原反應(yīng)：取巖藻黃質(zhì)(純度為99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入硼氫化鈉10mg，于37℃下反應(yīng)2h后，濃縮至近干，加入30mL的水混懸，用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮至干，用90％甲醇溶解；

2)巖藻黃醇精制：

a)原料的配置：將巖藻黃醇粗品配置成6mg/mL的溶液；

b)儀器：半制備型高效液相色譜；

c)色譜條件：半制備色譜柱為C8柱(250mm×10mm)，流動相系統(tǒng)為90％甲醇水溶液，流動相流速為4mL/min，檢測波長為450nm；

d)進(jìn)樣體積：100μL；

通過運(yùn)行半制備型高效液相色譜獲得巖藻黃醇制備液80mL，在30℃下減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得巖藻黃醇42.2mg，純度99.53％。

實(shí)施例2

1)還原反應(yīng)：取巖藻黃質(zhì)(純度為99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入硼氫化鈉10mg，于40℃下反應(yīng)4h后，濃縮至近干，加入30mL的水混懸，用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮至干，用90％甲醇溶解；

2)巖藻黃醇精制：

a)原料的配置：將巖藻黃醇粗品配置成6mg/mL的溶液；

b)儀器：半制備型高效液相色譜；

c)色譜條件：半制備色譜柱為C8柱(250mm×10mm)，流動相系統(tǒng)為90％甲醇水溶液，流動相流速為4mL/min，檢測波長為450nm；

d)進(jìn)樣體積：100μL；

通過運(yùn)行半制備型高效液相色譜獲得巖藻黃醇制備液100mL，在30℃下減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得巖藻黃醇40.3mg，純度99.36％。

實(shí)施例3

1)還原反應(yīng)：取巖藻黃質(zhì)(純度為99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入硼氫化鈉10mg，于45℃下反應(yīng)3h后，濃縮至近干，加入30mL的水混懸，用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮至干，用90％甲醇溶解；

2)巖藻黃醇精制：

a)原料的配置：將巖藻黃醇粗品配置成6mg/mL的溶液；

b)儀器：半制備型高效液相色譜；

c)色譜條件：半制備色譜柱為C8柱(250mm×10mm)，流動相系統(tǒng)為90％甲醇水溶液，流動相流速為4mL/min，檢測波長為450nm；

d)進(jìn)樣體積：100μL；

通過運(yùn)行半制備型高效液相色譜獲得巖藻黃醇制備液110mL，在30℃下減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得巖藻黃醇43.0mg，純度99.45％。

實(shí)施例4

1)還原反應(yīng)：取巖藻黃質(zhì)(純度為99％)50mg，用四氫呋喃30mL溶解，加入硼氫化鈉10mg，于37℃下反應(yīng)2h后，濃縮至近干，加入30mL的水混懸，用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮至干，用90％甲醇溶解；

2)巖藻黃醇精制：

a)原料的配置：將巖藻黃醇粗品配置成6mg/mL的溶液；

b)儀器：半制備型高效液相色譜；

c)色譜條件：半制備色譜柱為C8柱(250mm×10mm)，流動相系統(tǒng)為90％甲醇水溶液，流動相流速為4mL/min，檢測波長為450nm；

d)進(jìn)樣體積：100μL；

通過運(yùn)行半制備型高效液相色譜獲得巖藻黃醇制備液80mL，在30℃下減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得巖藻黃醇35.2mg，純度99.53％。

實(shí)施例5

1)還原反應(yīng)：取巖藻黃質(zhì)(純度為99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入硼氫化鈉20mg，于30℃下反應(yīng)10h后，濃縮至近干，加入30mL的水混懸，用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮至干，用90％甲醇溶解；

2)巖藻黃醇精制：

a)原料的配置：將巖藻黃醇粗品配置成6mg/mL的溶液；

b)儀器：半制備型高效液相色譜；

c)色譜條件：半制備色譜柱為C8柱(250mm×10mm)，流動相系統(tǒng)為90％甲醇水溶液，流動相流速為4mL/min，檢測波長為450nm；

d)進(jìn)樣體積：100μL；

通過運(yùn)行半制備型高效液相色譜獲得巖藻黃醇制備液50mL，在30℃下減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得巖藻黃醇42.7mg，純度99.38％。

實(shí)施例6

1)還原反應(yīng)：取巖藻黃質(zhì)(純度為99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入硼氫化鈉10mg，于37℃下反應(yīng)2h后，濃縮至近干，加入30mL的水混懸，用等體積正丁醇萃取3次，萃取液濃縮至干，用90％甲醇溶解；

2)巖藻黃醇精制：

a)原料的配置：將巖藻黃醇粗品配置成6mg/mL的溶液；

b)儀器：半制備型高效液相色譜；

c)色譜條件：半制備色譜柱為C8柱(250mm×10mm)，流動相系統(tǒng)為90％甲醇水溶液，流動相流速為4mL/min，檢測波長為450nm；

d)進(jìn)樣體積：100μL；

通過運(yùn)行半制備型高效液相色譜獲得巖藻黃醇制備液50mL，在30℃下減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得巖藻黃醇33.6mg，純度99.15％。

實(shí)施例7

1)還原反應(yīng)：取巖藻黃質(zhì)(純度為99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入氫化鋁鋰10mg，于37℃下反應(yīng)2h后，濃縮至近干，加入30mL的水混懸，用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮至干，用90％甲醇溶解；

2)巖藻黃醇精制：

a)原料的配置：將巖藻黃醇粗品配置成6mg/mL的溶液；

b)儀器：半制備型高效液相色譜；

c)色譜條件：半制備色譜柱為C8柱(250mm×10mm)，流動相系統(tǒng)為90％甲醇水溶液，流動相流速為4mL/min，檢測波長為450nm；

d)進(jìn)樣體積：100μL；

通過運(yùn)行半制備型高效液相色譜獲得巖藻黃醇制備液80mL，在30℃下減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得巖藻黃醇17.0mg，純度99.26％。

實(shí)施例8

1)還原反應(yīng)：取巖藻黃質(zhì)(純度為99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入硫酸亞鐵10mg，于37℃下反應(yīng)2h后，濃縮至近干，加入30mL的水混懸，用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮至干，用90％甲醇溶解；

2)巖藻黃醇精制：

a)原料的配置：將巖藻黃醇粗品配置成6mg/mL的溶液；

b)儀器：半制備型高效液相色譜；

c)色譜條件：半制備色譜柱為C8柱(250mm×10mm)，流動相系統(tǒng)為90％甲醇水溶液，流動相流速為4mL/min，檢測波長為450nm；

d)進(jìn)樣體積：100μL；

通過運(yùn)行半制備型高效液相色譜獲得巖藻黃醇制備液50mL，在30℃下減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得巖藻黃醇12.1mg，純度99.25％。

實(shí)施例9

1)還原反應(yīng)：取巖藻黃質(zhì)(純度為99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入氯化亞錫10mg，于37℃下反應(yīng)2h后，濃縮至近干，加入30mL的水混懸，用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮至干，用90％甲醇溶解；

2)巖藻黃醇精制：

a)原料的配置：將巖藻黃醇粗品配置成6mg/mL的溶液；

b)儀器：半制備型高效液相色譜；

c)色譜條件：半制備色譜柱為C8柱(250mm×10mm)，流動相系統(tǒng)為90％甲醇水溶液，流動相流速為4mL/min，檢測波長為450nm；

d)進(jìn)樣體積：100μL；

通過運(yùn)行半制備型高效液相色譜獲得巖藻黃醇制備液80mL，在30℃下減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得巖藻黃醇20.1mg，純度99.30％。

實(shí)施例10

1)還原反應(yīng)：取巖藻黃質(zhì)(純度為99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入亞硫酸氫鈉10mg，于37℃下反應(yīng)2h后，濃縮至近干，加入30mL的水混懸，用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮至干，用90％甲醇溶解；

2)巖藻黃醇精制：

a)原料的配置：將巖藻黃醇粗品配置成6mg/mL的溶液；

b)儀器：半制備型高效液相色譜；

c)色譜條件：半制備色譜柱為C8柱(250mm×10mm)，流動相系統(tǒng)為90％甲醇水溶液，流動相流速為4mL/min，檢測波長為450nm；

d)進(jìn)樣體積：100μL；

通過運(yùn)行半制備型高效液相色譜獲得巖藻黃醇制備液80mL，在30℃下減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得巖藻黃醇18.3mg，純度99.30％。

實(shí)施例11

1)還原反應(yīng)：取巖藻黃質(zhì)(純度為99％)50mg，用甲醇30mL溶解，加入氫化鋁鋰50mg，于50℃下反應(yīng)2h后，濃縮至近干，加入30mL的水混懸，用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮至干，用80％甲醇溶解；

2)巖藻黃醇精制：

a)原料的配置：將巖藻黃醇粗品配置成6mg/mL的溶液；

b)儀器：半制備型高效液相色譜；

c)色譜條件：半制備色譜柱為C8柱(250mm×10mm)，流動相系統(tǒng)為80％甲醇水溶液，流動相流速為4mL/min，檢測波長為450nm；

d)進(jìn)樣體積：100μL；

通過運(yùn)行半制備型高效液相色譜獲得巖藻黃醇制備液80mL，在30℃下減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得巖藻黃醇15.6mg，純度99.38％。

實(shí)施例12

1)還原反應(yīng)：取巖藻黃質(zhì)提取物(純度為50％)200mg，用甲醇100mL溶解，加入硼氫化鈉40mg，于50℃下反應(yīng)2h后，濃縮至近干，加入100mL的水混懸，用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮至干，用90％甲醇溶解；

2)巖藻黃醇精制：

a)原料的配置：將巖藻黃醇粗品配置成6mg/mL的溶液；

b)儀器：半制備型高效液相色譜；

c)色譜條件：半制備色譜柱為C18柱(250mm×10mm)，流動相系統(tǒng)為60％乙醇水溶液，流動相流速為6mL/min，檢測波長為450nm；

d)進(jìn)樣體積：300μL；

通過運(yùn)行制備型高效液相色譜獲得巖藻黃醇制備液160mL，在30℃下減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得巖藻黃醇83.4mg，純度99.33％。

實(shí)施例13

1)還原反應(yīng)：取巖藻黃質(zhì)提取物(純度為50％)200mg，用乙醇100mL溶解，加入氯化亞錫40mg，于50℃下反應(yīng)2h后，濃縮至近干，加入1000mL的水混懸，用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮至干，用90％乙醇溶解；；

2)巖藻黃醇精制：

a)原料的配置：將巖藻黃醇粗品配置成20mg/mL的溶液；

b)儀器：半制備型高效液相色譜；

c)色譜條件：制備色譜柱為C18柱(250mm×20mm)，流動相系統(tǒng)為90％乙醇水溶液，流動相流速為25mL/min，檢測波長為450nm；

d)進(jìn)樣體積：1200μL；

通過運(yùn)行制備型高效液相色譜獲得巖藻黃醇制備液1300mL，在30℃下減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得巖藻黃醇22.8mg，純度99.19％。

實(shí)施例14

1)還原反應(yīng)：取巖藻黃質(zhì)提取物(純度為50％)200mg，用甲醇100mL溶解，加入氫化鋁鋰40mg，于50℃下反應(yīng)2h后，濃縮至近干，加入100mL的水混懸，用等體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液濃縮至干，用90％甲醇溶解；

2)巖藻黃醇精制：

a)原料的配置：將巖藻黃醇粗品配置成6mg/mL的溶液；

b)儀器：半制備型高效液相色譜；

c)色譜條件：半制備色譜柱為C18柱(250mm×10mm)，流動相系統(tǒng)為60％乙醇水溶液，流動相流速為6mL/min，檢測波長為450nm；

d)進(jìn)樣體積：300μL；

通過運(yùn)行制備型高效液相色譜獲得巖藻黃醇制備液160mL，在30℃下減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，即得巖藻黃醇25.2mg，純度99.33％。