本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及準(zhǔn)噶爾大戟中的萜類化合物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

大戟屬(Euphorbia)是大戟科(Euphorbiaceae)中的一個大屬，全球約有2000余種植物，廣泛分布于熱帶及溫帶地區(qū)。大戟屬植物具有重要的藥用價值，多用于通便、利尿，治療結(jié)核、水腫、牛皮癬、和疥瘡等疾患。準(zhǔn)噶爾大戟(Euphorbia soongarica Boiss.)為大戟屬多年生草本植物，產(chǎn)于新疆北部和甘肅西部，分布于中國、西西伯利亞至中亞和蒙古。其根部入藥，具有逐水、消腫、散瘀的功效，在新疆地區(qū)也作為大戟的替代品使用。目前已報道的從準(zhǔn)噶爾大戟中得到的化合物有50余個，主要為黃酮類、多酚類和三萜類化合物，但有關(guān)其生物活性的研究甚少，僅發(fā)現(xiàn)3個三萜類化合物具有一定的細(xì)胞毒性，而大戟屬的特征成分——二萜類化合物并未見報道。因此，對準(zhǔn)噶爾大戟的化學(xué)成分進(jìn)一步挖掘研究，對明確準(zhǔn)噶爾大戟次生代謝產(chǎn)物提供參考，也為揭示其藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，即一種藥物作用于腫瘤使之產(chǎn)生耐藥性后，該腫瘤對從未接觸、結(jié)構(gòu)無關(guān)、靶點不同、機(jī)制各異的多種抗腫瘤藥也具有交叉耐藥性的現(xiàn)象。MDR有多種形成機(jī)制，其中最主要的機(jī)制之一是ABC家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(目前研究最廣泛、最深入的為ABCB1基因編碼的P-糖蛋白，P-gp)的過表達(dá)，導(dǎo)致藥物外排增加，形成耐藥性。近年來，許多從植物中分離得到的二萜類化合物被發(fā)現(xiàn)具有顯著的MDR逆轉(zhuǎn)活性，因而成為研究熱點之一。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種準(zhǔn)噶爾大戟中的萜類化合物及其制備方法和用途，該方法以準(zhǔn)噶爾大戟(E.soongarica)的全草為原料，用有機(jī)溶劑提取，通過溶劑萃取法、正相硅膠柱層析法、反相硅膠柱層析法、Sephadex LH-20凝膠柱層析法中的三種至四種方法進(jìn)行分離，得到10個新的萜類化合物(包括5個二萜類、3個降碳三萜類和2個三萜類化合物)，并對得到10個新的萜類化合物進(jìn)行了多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性測定，結(jié)果表明：所述新的萜類化合物具有不同程度的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性，可用于制備多藥耐藥逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用，或?qū)⑵渑c抗腫瘤藥物組合制備抗腫瘤組合藥物。

本發(fā)明所述的一種準(zhǔn)噶爾大戟中的萜類化合物，該化合物為二萜類化合物和三萜類化合物，其中二萜類化合物的結(jié)構(gòu)式為：

式(Ⅰ)化合物為3β-苯甲酰氧基-5,6-環(huán)氧-隨續(xù)子烷-12E-烯-7β,15β-二醇-14-酮；

式(Ⅱ)化合物為3β-苯甲酰氧基-隨續(xù)子烷-5E,12E-二烯-7β,15β-二醇-14-酮；

式(Ⅲ)化合物為麻瘋樹烷-4E,6(17)-二烯-13β,14β-二醇-3-酮；

式(Ⅳ)化合物為12α-苯丙烯酰胺基-3β-乙酰氧基-甘青大戟B烷-5α,15β-二醇-14-酮；

式(Ⅴ)化合物為12α-苯甲酰氧基-甘青大戟B烷-4Z-烯-3β,5α-二醇-14-酮；

三萜類化合物的結(jié)構(gòu)式為：

式(Ⅵ)化合物為25,26,27-三降-大戟烷-8Z,22E-二烯-3β-醇-7-酮-24-醛；

式(Ⅶ)化合物為27-降-大戟烷-8Z,23E-二烯-3β-醇-7,25-二酮；

式(Ⅷ)化合物為24R-大戟烷-8Z,25E-二烯-3β,24-二醇-7-酮；

式(Ⅸ)化合物為22,23,24,25,26,27-六降-大戟烷-8Z-烯-3β-醇-7,20-二酮；

式(Ⅹ)化合物為7,15-二氧-D:C-friedo-齊墩果烷-8Z-烯-3β-醇。

所述準(zhǔn)噶爾大戟中的萜類化合物的制備方法，按下列步驟進(jìn)行：

a、以準(zhǔn)噶爾大戟全草為原料，粉碎后用5-10倍量體積濃度為50-99％的乙醇水溶液、無水乙醇、體積濃度為50-99％的甲醇水溶液、無水甲醇、體積濃度為50-99％的丙酮水溶液或丙酮進(jìn)行室溫下的滲漉或冷浸提取，或加熱回流提取，濃縮得到準(zhǔn)噶爾大戟粗提物；

b、將步驟a得到的粗提物用乙腈分散，加入環(huán)己烷、正己烷或石油醚萃取，或?qū)⒋痔嵛镉铆h(huán)己烷、正己烷或石油醚分散，再加入乙腈萃取1-5次，將乙腈萃取液濃縮，得到乙腈萃取物浸膏；

c、將步驟b得到的乙腈萃取物浸膏經(jīng)正相硅膠柱層析、反相硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析法中的兩種或三種進(jìn)行分離，即得到式(Ⅰ)—式(Ⅹ)化合物。

步驟c中所用正相硅膠柱層析法為常壓或加壓柱層析，所用填料為硅膠，所用洗脫劑為石油醚、環(huán)己烷、正己烷、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中至少兩種溶劑的混合物，采用等度洗脫或梯度洗脫。

步驟c中所用反相硅膠柱層析法為常壓或加壓柱層析，洗脫劑為體積濃度為30-99％的甲醇水溶液、10-99％的乙腈水溶液或10-99％的乙腈-甲醇-水混合溶液，采用等度洗脫或梯度洗脫。

步驟c中所用Sephadex LH-20凝膠柱層析法為常壓柱層析，洗脫劑為甲醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷或它們中至少兩種溶劑的混合物，采用等度洗脫或梯度洗脫。

所述準(zhǔn)噶爾大戟中的萜類化合物中的式(Ⅳ)和式(Ⅴ)化合物，式(Ⅵ)、式(Ⅶ)和式(Ⅷ)化合物在制備多藥耐藥逆轉(zhuǎn)藥物中的用途。

所述準(zhǔn)噶爾大戟中的萜類化合物中的式(Ⅳ)和式(Ⅴ)化合物，式(Ⅵ)、式(Ⅶ)和式(Ⅷ)化合物在制備與抗腫瘤藥物組合的藥物中的用途。

本發(fā)明所述的準(zhǔn)噶爾大戟中的萜類化合物及其制備方法和用途，通過所述方法獲得的10個新的萜類化合物經(jīng)過多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性測定，實驗結(jié)果表明：所述式(Ⅳ)、式(Ⅴ)、式(Ⅵ)、式(Ⅶ)和式(Ⅷ)化合物能夠不同程度地抑制耐藥細(xì)胞中P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物排外作用，從而表現(xiàn)出多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性，可用于制備多藥耐藥逆轉(zhuǎn)藥物或與抗腫瘤藥物組合制備抗腫瘤組合藥物。

本發(fā)明所述的準(zhǔn)噶爾大戟中的萜類化合物，可通過從植物中分離純化得到，也可以經(jīng)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的化學(xué)修飾方法合成獲得。

本發(fā)明所述的準(zhǔn)噶爾大戟中的萜類化合物，采用高分辨質(zhì)譜、一維和二維核磁共振譜等現(xiàn)代波譜手段確定其結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)鑒定過程如下：

式(Ⅰ)化合物為白色無定型粉末，[α]_D²⁰+44.0(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)229(4.21),267(4.19)nm；ECD(MeOH)202(Δε-2.71),231(Δε-8.34),272(Δε+8.15),348(Δε+0.53)nm；HRESI(+)MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 455.2422[M+H]⁺(計算值為C₂₇H₃₅O₆455.2434)，確定其分子式為C₂₇H₃₄O₆；根據(jù)¹H，¹³C NMR以及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)為3β-苯甲酰氧基-5,6-環(huán)氧-隨續(xù)子烷-12E-烯-7β,15β-二醇-14-酮，其¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)歸屬見表1[600MHz(¹H)，150MHz(¹³C)，溶劑：CDCl₃]。

式(Ⅱ)化合物為白色無定型粉末，[α]_D²⁰+90.0(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)229(4.20),274(4.13)nm；ECD(MeOH)216(Δε-16.13),237(Δε-14.58),278(Δε+16.85),345(Δε+2.53)nm。根據(jù)HRESI(+)MS(m/z 439.2498[M+H]⁺，計算值為C₂₇H₃₅O₅ 439.2484)確定其分子式為C₂₇H₃₄O₅；根據(jù)¹H，¹³C NMR以及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)為3β-苯甲酰氧基-隨續(xù)子烷-5E,12E-二烯-7β,15β-二醇-14-酮。其¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)歸屬見表1[400MHz(¹H)，100MHz(¹³C)，溶劑：CDCl₃]。

式(Ⅲ)化合物為白色無定型粉末，[α]_D²⁰-75.6(c 0.09,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)231(3.88)nm；ECD(MeOH)231(Δε-12.86)nm；根據(jù)其¹³C NMR和HRESI(+)MS(m/z 317.2101[M+H]⁺，理論值C₂₀H₂₉O₃ 317.2117)數(shù)據(jù)確定其分子式為C₂₀H₂₈O₃；根據(jù)¹H，¹³C NMR以及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)為麻瘋樹烷-4E,6(17)-二烯-13β,14β-二醇-3-酮。其¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)歸屬見表1[600MHz(¹H)，150MHz(¹³C)，溶劑：CDCl₃]。

表1.式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)化合物的¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)[δ(ppm),J(Hz)]

式(Ⅳ)化合物為白色無定型粉末，[α]_D²⁰+1.0(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)216(4.23),277(4.29)nm；ECD(MeOH)203(Δε-10.54),260(Δε-1.43),311(Δε+4.49)nm；通過其HRESI(+)MS數(shù)據(jù)(m/z 524.2996[M+H]⁺，計算值為C₃₁H₄₂NO₆524.3012)并結(jié)合氮率確定其分子中含有一個氮原子，分子式為C₃₁H₄₁NO₆；根據(jù)¹H，¹³C NMR以及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)為12α-苯丙烯酰胺基-3β-乙酰氧基-甘青大戟B烷-5α,15β-二醇-14-酮。其¹H和¹³C NMR歸屬見表2[400MHz(¹H)，100MHz(¹³C)，CDCl₃]。

式(Ⅴ)化合物為無色油狀，[α]_D²⁰-31.0(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)230(4.01)nm；ECD(MeOH)250(Δε-7.37),333(Δε+0.67)nm；根據(jù)其¹³C NMR和HRESI(+)MS數(shù)據(jù)(m/z 439.2469[M+H]⁺，理論值C₂₇H₃₅O₅ 439.2484)確定其分子式為C₂₇H₃₄O₅。根據(jù)¹H，¹³C NMR以及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)為12α-苯甲酰氧基-甘青大戟B烷-4Z-烯-3β,5α-二醇-14-酮；其¹H和¹³C NMR歸屬見表2[400MHz(¹H)，100MHz(¹³C)，CDCl₃]。

表2.式(Ⅳ)、式(Ⅴ)化合物的¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)[δ(ppm),J(Hz)]

式(Ⅵ)化合物為白色無定型粉末，[α]_D²⁰+7.8(c 0.09,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)216(3.94)nm；ECD(MeOH)219(Δε+1.37),247(Δε-0.27),280(Δε+1.34),337(Δε+0.65)nm；根據(jù)其HRESI(+)MS數(shù)據(jù)(m/z 413.3050[M+H]⁺，理論值C₂₇H₄₁O₃413.3056)判斷其分子式為C₂₇H₄₀O₃；根據(jù)¹H，¹³C NMR以及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)為25,26,27-三降-大戟烷-8Z,22E-二烯-3β-醇-7-酮-24-醛。其¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)歸屬見表3[600MHz(¹H)，150MHz(¹³C)，溶劑：CDCl₃]。

式(Ⅶ)化合物為白色無定型粉末，[α]_D²⁰+7.0(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)224(3.96)nm；ECD(MeOH)233(Δε+0.75),257(Δε-1.13),284(Δε+0.49),335(Δε+1.09)nm；HRESI(+)MS給出m/z 441.3353[M+H]⁺(理論值C₂₉H₄₅O₃ 441.3369)，確定其分子式為C₂₉H₄₄O₃；根據(jù)¹H，¹³C NMR以及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)為27-降-大戟烷-8Z,23E-二烯-3β-醇-7,25-二酮。其¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)歸屬見表3[400MHz(¹H)，100MHz(¹³C)，溶劑：CDCl₃]。

表3.式(Ⅵ)、式(Ⅶ)化合物的¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)[δ(ppm),J(Hz)]

式(Ⅷ)化合物為白色無定型粉末，[α]_D²⁰+15.0(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)254(3.97)nm；ECD(MeOH)220(Δε-2.73),260(Δε-2.44),338(Δε+1.86)nm；HRESI(+)MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 457.3662[M+H]⁺(理論值C₃₀H₄₉O₃ 457.3682)，確定其分子式為C₃₀H₄₈O₃；通過解析¹H，¹³C NMR以及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其平面結(jié)構(gòu)，并確定其與已知化合物[(+)-(24S)-eupha-8,25-diene-3β,24-diol-7-one]具有不同的C-24絕對構(gòu)型。進(jìn)一步采用氘代丙酮對上述兩個化合物進(jìn)行¹³C NMR測定并進(jìn)行數(shù)據(jù)比對，結(jié)果表明式(Ⅷ)化合物的C-20，C-23，C-24位分別與已知化合物相差-0.22,-0.20,-0.34ppm，而其他數(shù)據(jù)一致，因此確定式(Ⅷ)化合物的結(jié)構(gòu)為24R-大戟烷-8Z,25E-二烯-3β,24-二醇-7-酮。式(Ⅷ)化合物的¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)見表3[400MHz(¹H)，100MHz(¹³C)，溶劑：CDCl₃]；式(Ⅷ)化合物及已知化合物[(+)-(24S)-eupha-8,25-diene-3β,24-diol-7-one]的¹³C(文獻(xiàn)報道的和我們分得的)NMR數(shù)據(jù)見表4[150MHz(¹³C)]。

表4.式(Ⅷ)化合物和[(+)-(24S)-eupha-8,25-diene-3β,24-diol-7-one](文獻(xiàn)報道的和我們分得的)的¹³C NMR數(shù)據(jù)對比[acetone-d₆,δ(ppm)]

*文獻(xiàn)中的ND為未檢測到該信號。

式(Ⅸ)化合物為白色無定型粉末，[α]_D²⁰-24.2(c 0.03,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)252(3.89)nm；ECD(MeOH)257(Δε-2.75),287(Δε-1.41),339(Δε+1.35)nm。通過其¹³C NMR和HRESI(+)MS數(shù)據(jù)(m/z 373.2750[M+H]⁺，理論值C₂₄H₃₇O₃ 373.2743)確定其分子式為C₂₄H₃₆O₃。根據(jù)¹H，¹³C NMR以及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)為22,23,24,25,26,27-六降-大戟烷-8Z-烯-3β-醇-7,20-二酮；其¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)歸屬見表5[600MHz(¹H)，150MHz(¹³C)，溶劑：CDCl₃]。

式(Ⅹ)化合物為白色無定型粉末，[α]_D²⁰+1.0(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)245(3.96)nm；ECD(MeOH)209(Δε-4.22),254(Δε-4.76),284(Δε+0.53),334(Δε+0.74)nm。根據(jù)其HRESI(+)MS數(shù)據(jù)(m/z 455.3544[M+H]⁺，理論值C₃₀H₄₇O₃455.3525)判斷其分子式為C₃₀H₄₆O₃；根據(jù)¹H，¹³C NMR以及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)為7,15-二氧-D:C-friedo-齊墩果烷-8Z-烯-3β-醇。其¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)歸屬見表5[400MHz(¹H)，100MHz(¹³C)，溶劑：CDCl₃]。

表5.式(Ⅸ)、式(Ⅹ)化合物的¹H和¹³C NMR數(shù)據(jù)[δ(ppm),J(Hz)]

附圖說明

圖1-圖2為本發(fā)明所述式(Ⅰ)化合物的¹H和¹³C核磁共振譜圖；

圖3-圖4為本發(fā)明所述式(Ⅱ)化合物的¹H和¹³C核磁共振譜圖；

圖5-圖6為本發(fā)明所述式(Ⅲ)化合物的¹H和¹³C核磁共振譜圖；

圖7-圖8為本發(fā)明所述式(Ⅳ)化合物的¹H和¹³C核磁共振譜圖；

圖9-圖10為本發(fā)明所述式(Ⅴ)化合物的¹H和¹³C核磁共振譜圖；

圖11-圖12為本發(fā)明所述式(Ⅵ)化合物的¹H和¹³C核磁共振譜圖；

圖13-圖14為本發(fā)明所述式(Ⅶ)化合物的¹H和¹³C核磁共振譜圖；

圖15-圖16為本發(fā)明所述式(Ⅷ)化合物的¹H和¹³C核磁共振譜圖；

圖17-圖18為本發(fā)明所述式(Ⅸ)化合物的¹H和¹³C核磁共振譜圖；

圖19-圖20為本發(fā)明所述式(Ⅹ)化合物的¹H和¹³C核磁共振譜圖。

具體實施方式

實施例1.

a、取準(zhǔn)噶爾大戟全草10kg，粉碎后用50L丙酮室溫下滲漉提取，減壓蒸干溶劑得到準(zhǔn)噶爾大戟粗提物；

b、將步驟a得到的粗提物用乙腈分散，加入環(huán)己烷進(jìn)行萃取，合并乙腈層并減壓蒸干得到乙腈萃取物浸膏；

c、將步驟b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅膠柱分離，用體積比100:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，流分經(jīng)硅膠薄層層析(TLC)分析，合并相同流分，得到12個組分(F1-F12)；將組分F6進(jìn)行正相硅膠柱分離，以體積比為40:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，得到組分F6A-F6F；將組分F6C經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為50％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集70％甲醇-水溶液的洗脫液，減壓蒸干后采用制備反相柱(C₁₈ 5μm10×250mm)分離，以濃度為45％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅰ)和式(Ⅲ)化合物；將F7段進(jìn)行正相硅膠柱分離，采用體積比100:9:1-0:0:1的正己烷-氯仿-丙酮梯度洗脫，得到組分F7A-F7H；F7F段先經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，用無水甲醇洗脫，得到的流分再經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為30％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集70％甲醇-水溶液的洗脫液，減壓蒸干后采用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為50％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅱ)和式(Ⅵ)化合物；F7G段先經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，用無水甲醇洗脫，得到的流分再經(jīng)正相硅膠柱分離，采用體積比10:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，得到組分F7G3A-F7G3H；F7G3E段經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為50％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集70％甲醇-水溶液(F7G3E3)和80％甲醇-水溶液(F7G3E4)的洗脫液，減壓蒸干，F(xiàn)7G3E3段采用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為45％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅳ)和式(Ⅸ)化合物；F7G3E4采用制備反相柱(C₁₈ 5μm10×250mm)分離，以濃度為47％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅶ)、式(Ⅷ)和式(Ⅹ)化合物；對F7H段采用正相硅膠柱分離，采用體積比為10:1-0:1的正己烷-丙酮進(jìn)行梯度洗脫，得到組分F7H1-F7H8；F7H2段再經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為50％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集70％甲醇-水溶液，減壓蒸干后采用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為47％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅴ)化合物。

實施例2

a、取準(zhǔn)噶爾大戟全草10kg，粉碎后用60L的濃度為80％的丙酮-水溶液室溫下冷浸提取，減壓蒸干溶劑得到準(zhǔn)噶爾大戟粗提物；

b、將步驟a得到的粗提物用乙腈分散，加入正己烷進(jìn)行萃取，合并乙腈層并減壓蒸干得到乙腈萃取物浸膏；

c、將步驟b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅膠柱分離，用體積比為100:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，流分經(jīng)TLC分析，合并相同流分，得到12個組分(F1-F12)；將組分F6進(jìn)行正相硅膠柱分離，以體積比為40:1-0:1的環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，得到組分F6A-F6F；將F6C組分經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為30％-100％的乙腈-水溶液梯度洗脫，收集50％乙腈-水溶液的洗脫液，減壓蒸干后采用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為45％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅰ)和式(Ⅲ)化合物；將F7段進(jìn)行正相硅膠柱分離，采用體積比100:9:1-0:0:1的正己烷-二氯甲烷-丙酮梯度洗脫，得到組分F7A-F7H；F7F段先經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，用體積比為1:1的氯仿-甲醇洗脫，得到的流分再經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為30-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集70％甲醇-水溶液的洗脫液，減壓蒸干后采用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為50％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅱ)和式(Ⅵ)化合物；F7G段先經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，用體積比為1:1的氯仿-甲醇洗脫，得到的流分再經(jīng)正相硅膠柱分離，采用體積比10:1-0:1的環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，得到組分F7G3A-F7G3H；F7G3E段經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為50-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集70％甲醇-水溶液(F7G3E3)和80％甲醇-水溶液(F7G3E4)的洗脫液，減壓蒸干，F(xiàn)7G3E3采用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為65％的甲醇-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅳ)和式(Ⅸ)化合物；F7G3E4采用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為67％的甲醇-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅶ)、式(Ⅷ)和式(Ⅹ)化合物；對F7H段采用正相硅膠柱分離，采用體積比10:1-0:1的環(huán)己烷-丙酮梯度洗脫，得到組分F7H1-F7H8；F7H2段再經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為30％-100％的乙腈-水溶液梯度洗脫，收集50％乙腈-水溶液，減壓蒸干后采用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為47％的乙腈-水溶液等度洗脫得到式(Ⅴ)化合物。

實施例3

a、取準(zhǔn)噶爾大戟全草10kg，粉碎后用70L乙醇室溫下滲漉提取，減壓蒸干溶劑得到準(zhǔn)噶爾大戟粗提物；

b、將步驟a得到的粗提物用乙腈分散，加入石油醚進(jìn)行萃取，合并乙腈層并減壓蒸干得到乙腈萃取物浸膏；

c、將步驟b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅膠柱分離，用體積比為100:1-0:1的環(huán)己烷-乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，流分經(jīng)TLC分析合并相同流分，得到12個組分(F1-F12)；將組分F6進(jìn)行正相硅膠柱分離，以體積比為40:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，得到組分F6A-F6F；將F6C組分經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為50-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集70％甲醇-水溶液的洗脫液，減壓蒸干后采用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為65％的甲醇-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅰ)和式(Ⅲ)化合物；將F7段進(jìn)行正相硅膠柱分離，采用體積比100:9:1-0:0:1的環(huán)己烷-氯仿-丙酮梯度洗脫，得到組分F7A-F7H；F7F段經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為10-100％的乙腈-水溶液梯度洗脫，收集50％乙腈-水溶液的洗脫液，減壓蒸干后用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為50％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅱ)和式(Ⅵ)化合物；F7G段先經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，用體積比為1:1的二氯甲烷-甲醇洗脫，得到的流分再經(jīng)正相硅膠柱分離，采用體積比10:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，得到組分F7G3A-F7G3H；F7G3E段經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為50-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集70-80％甲醇-水溶液的洗脫液，減壓蒸干后以濃度為45％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅳ)、式(Ⅶ)、式(Ⅷ)、式(Ⅸ)和式(Ⅹ)化合物；對F7H段采用正相硅膠柱分離，采用體積比10:1-0:1的石油醚-丙酮梯度洗脫，得到組分F7H1-F7H8；F7H2段再經(jīng)RP-18反相柱色譜分離，以濃度為50-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集70％甲醇-水溶液，減壓蒸干后采用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為45％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅴ)化合物。

實施例4.

a、取準(zhǔn)噶爾大戟全草10kg，粉碎后用80L的濃度為90％的乙醇-水溶液溫度80℃下回流提取，減壓蒸干溶劑得到準(zhǔn)噶爾大戟粗提物；

b、將步驟a得到的粗提物用環(huán)己烷分散，加入乙腈進(jìn)行萃取，合并乙腈層并減壓蒸干得到乙腈萃取物浸膏；

c、將步驟b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅膠柱分離，用體積比100:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，流分經(jīng)TLC分析合并相同流分，得到12個組分(F1-F12)；將組分F6進(jìn)行正相硅膠柱分離，以體積比為40:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，得到組分F6A-F6F；將F6C段組分經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為30-100％的乙腈-水溶液梯度洗脫，收集50％乙腈-水溶液的洗脫液，減壓蒸干后采用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為65％的甲醇-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅰ)和式(Ⅲ)化合物；將F7段進(jìn)行正相硅膠柱分離，采用體積比100:9:1-0:0:1石油醚-氯仿-丙酮進(jìn)行梯度洗脫，得到組分F7A-F7H；F7F段先經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，用無水甲醇洗脫得到的流分再經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為30-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集70％甲醇-水溶液的洗脫液，減壓蒸干后采用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為70％的甲醇-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅱ)和式(Ⅵ)化合物；F7G段采用體積比10:1-0:1環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，得到組分F7G1-F7G8；F7G5段經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為30-100％的乙腈-水溶液梯度洗脫，收集40-60％乙腈-水溶液的洗脫液，減壓蒸干后以濃度為45％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅳ)、式(Ⅶ)、式(Ⅷ)、式(Ⅸ)和式(Ⅹ)化合物；對F7H段采用正相硅膠柱分離，采用體積比10:1-0:1的正己烷-丙酮梯度洗脫，得到組分F7H1-F7H8；F7H2段再經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為30-100％的乙腈-水溶液梯度洗脫，收集40-60％乙腈-水溶液，減壓蒸干后采用制備反相柱(C₁₈5μm 10×250mm)分離，以濃度為47％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅴ)化合物。

實施例5

a、取準(zhǔn)噶爾大戟全草10kg，粉碎后用90L無水甲醇室溫下滲漉提取，減壓蒸干溶劑得到準(zhǔn)噶爾大戟粗提物；

b、將步驟a得到的粗提物用正己烷分散，加入乙腈進(jìn)行萃取，合并乙腈層并減壓蒸干得到乙腈萃取物浸膏；

c、將步驟b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅膠柱分離，用體積比100:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，流分經(jīng)TLC分析，合并相同流分，得到12個組分(F1-F12)；將組分F6進(jìn)行正相硅膠柱分離，以體積比為40:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，得到組分F6A-F6F；將F6C段組分經(jīng)制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為45-100％的乙腈-水溶液梯度洗脫，得到式(Ⅰ)和式(Ⅲ)化合物；將F7段進(jìn)行正相硅膠柱分離，采用體積比100:9:1-0:0:1的環(huán)己烷-二氯甲烷-丙酮梯度洗脫，得到組分F7A-F7H；F7F段先經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，用體積比1:1的氯仿-甲醇洗脫得到的流分再經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為30-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集70％甲醇-水溶液的洗脫液，減壓蒸干后采用硅膠柱分離，以體積比為10:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，得到組分F7F2A-F7F2H；對F7F2E組分進(jìn)行制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為50％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅱ)和式(Ⅵ)化合物；F7G段先經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，用無水甲醇洗脫得到的流分再經(jīng)正相硅膠柱分離，采用體積比10:1-0:1的環(huán)己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，得到組分F7G3A-F7G3H；F7G3E段經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為50-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集70-80％甲醇-水溶液的洗脫液，減壓蒸干后以濃度為45％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅳ)、式(Ⅶ)、式(ⅧI)、式(Ⅸ)和式(Ⅹ)化合物；對F7H段采用正相硅膠柱分離，采用體積比為10:1-0:1的環(huán)己烷-丙酮梯度洗脫，得到組分F7H1-F7H8；F7H2段再經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為50-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集60-80％的甲醇-水溶液，減壓蒸干后采用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為46％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅴ)化合物。

實施例6

a、取準(zhǔn)噶爾大戟全草10kg，粉碎后用100L濃度為90％的甲醇-水溶液室溫下冷浸提取，減壓蒸干溶劑得到準(zhǔn)噶爾大戟粗提物；

b、將步驟a得到的粗提物用石油醚分散，加入乙腈進(jìn)行萃取，合并乙腈層并減壓蒸干得到乙腈萃取物浸膏；

c、將步驟b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅膠柱分離，用體積比為100:1-0:1的環(huán)己烷-乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，流分經(jīng)TLC分析合并相同流分，得到12個組分(F1-F12)；將組分F6進(jìn)行正相硅膠柱分離，以體積比為40:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，得到組分F6A-F6F；將F6C段組分經(jīng)制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為60-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，得到式(Ⅰ)和式(Ⅲ)化合物；將F7段進(jìn)行正相硅膠柱分離，采用體積比100:9:1-0:0:1的石油醚-二氯甲烷-丙酮梯度洗脫，得到組分F7A-F7H；F7F段經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為30-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集70％甲醇-水溶液的洗脫液，減壓蒸干后采用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為50％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅱ)和式(Ⅵ)化合物；F7G段先經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，用體積比1:1的氯仿-甲醇洗脫得到的流分再經(jīng)正相硅膠柱分離，采用體積比10:1-0:1正己烷-乙酸乙酯梯度洗脫，得到組分F7G3A-F7G3H；F7G3E段經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為30-100％的甲醇-水溶液梯度洗脫，收集70-80％甲醇-水溶液的洗脫液，減壓蒸干后以濃度為44％的乙腈-水溶液等度洗脫，得到式(Ⅳ)、式(Ⅶ)、式(Ⅷ)、式(Ⅸ)和式(Ⅹ)化合物；對F7H段采用正相硅膠柱分離，采用體積比為10:1-0:1的石油醚-丙酮梯度洗脫，得到組分F7H1-F7H8；F7H2段再經(jīng)RP-18反相柱分離，以濃度為30-100％的乙腈-水溶液梯度洗脫，收集40-60％的乙腈-水溶液，減壓蒸干后采用制備反相柱(C₁₈ 5μm 10×250mm)分離，以濃度為65％的甲醇-水溶液等度洗脫，得到式(V)化合物。

實施例7

式(Ⅰ)—式(Ⅹ)化合物的細(xì)胞毒和抗耐藥活性測試：

材料與試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；雙抗和胎牛血清購自Hyclone公司；胰蛋白酶購自Gibco公司；噻唑藍(lán)(MTT)購自上海翼飛生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購自國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；羅丹明123購于SIGMA公司；鹽酸維拉帕米購自阿拉丁化學(xué)有限公司；紫杉醇購自Biocompounds公司；酒石酸長春瑞濱購自上海贏瑞化學(xué)科技有限公司。

細(xì)胞株：人口腔鱗狀細(xì)胞癌KB細(xì)胞及其長春新堿耐藥株KBv200細(xì)胞(購自ATCC公司)。

細(xì)胞培養(yǎng)：人口腔鱗狀細(xì)胞癌KB細(xì)胞及其長春新堿耐藥株KBv200細(xì)胞在RPMI 1640完全培養(yǎng)基(RPMI 1640培養(yǎng)基+10％FBS+1％雙抗)中培養(yǎng)。所有細(xì)胞均置于CO₂培養(yǎng)箱(溫度37℃，5％CO₂)維持傳代培養(yǎng)。耐藥株(KBv200細(xì)胞)在無抗腫瘤藥的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周后用于實驗。

實驗方法：MTT法，以2500個/孔的密度將處于對數(shù)生長期的KB或KBv200細(xì)胞接種于96孔微量培養(yǎng)板內(nèi)，在溫度37℃培養(yǎng)箱孵育12h后加入供試單體化合物(20μL/孔)；另設(shè)空白對照組，溶劑(DMSO)對照組及陽性藥物對照組；腫瘤細(xì)胞在溫度37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)72h后棄去上清液，加入MTT液(5mg/mL，用生理鹽水配制，20μL/孔)，在溫度37℃、5％CO₂條件下繼續(xù)培養(yǎng)1h；棄去上清液，每孔加入100μL DMSO，待甲臜溶解后，用酶標(biāo)儀檢測各孔550nm的吸光度值(A)；按下列公式計算供試單體化合物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制率(半數(shù)抑制量IC₅₀值采用Logit法計算)和耐藥系數(shù)：抑制率(％)＝(A對照組－A給藥組)/A對照組×100％；耐藥系數(shù)(RF)＝IC₅₀(KBv200)/IC₅₀(KB)。

實驗結(jié)果：準(zhǔn)噶爾大戟中分得的式(Ⅰ)—式(Ⅹ)化合物的半數(shù)生長抑制率，見表6：

表6.準(zhǔn)噶爾大戟中式(Ⅰ)—式(Ⅹ)化合物對KB和KBv200細(xì)胞的半數(shù)生長抑制率

由上表可知，式(Ⅱ)、式(Ⅴ)、式(Ⅶ)、式(Ⅷ)、式(Ⅹ)化合物對KB及KBv200細(xì)胞均有較弱的細(xì)胞毒性(IC₅₀范圍10.34-22.94μM)，且對KB和KBv200細(xì)胞的抑制活性差別不大(耐藥系數(shù)范圍在0.90-1.19)，表明耐藥細(xì)胞KBv200對這些化合物同樣敏感。其他化合物未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性(IC₅₀＞30μM)。

實施例8.

式(Ⅰ)—式(Ⅹ)化合物的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性測試：

實驗方法：羅丹明123細(xì)胞內(nèi)蓄積實驗(流式細(xì)胞儀法)，該模型可間接顯示以P-糖蛋白藥物外排泵為靶點的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的逆轉(zhuǎn)活性。若羅丹明123細(xì)胞內(nèi)蓄積相對值越大，表明其在細(xì)胞內(nèi)蓄積越多，則其多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性越強(qiáng)。將KBv200細(xì)胞按15×10⁴/mL的密度接種于24孔板，每孔1mL，過夜以致貼壁；待細(xì)胞生長至70-80％融合時，每孔加入待測單體化合物(終濃度為10μM)后在溫度37℃培養(yǎng)箱孵育4h；設(shè)空白對照組、溶劑(DMSO)對照組和陽性藥物對照組(維拉帕米，10μM)；然后每孔加入羅丹明123(終濃度10μM)后于溫度37℃培養(yǎng)箱避光孵育1h；棄去培養(yǎng)基，每孔用1mL冰1×磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次后，消化收集細(xì)胞；每孔用300μL PBS重懸置于冰上、避光，用流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm)。按下列公式計算羅丹明123細(xì)胞內(nèi)蓄積相對值。

羅丹明123細(xì)胞內(nèi)蓄積相對值＝(給藥組平均熒光強(qiáng)度－空白對照組平均熒光強(qiáng)度)/(溶劑對照組平均熒光強(qiáng)度－空白對照組平均熒光強(qiáng)度)。

實驗結(jié)果：準(zhǔn)噶爾大戟中分得的式(Ⅰ)—式(Ⅹ)化合物的羅丹明123細(xì)胞內(nèi)蓄積相對值見表7：

表7準(zhǔn)噶爾大戟中分得的式(Ⅰ)—式(Ⅹ)化合物的羅丹明123細(xì)胞內(nèi)蓄積相對值

如上表所示，式(Ⅳ)、式(Ⅴ)、式(Ⅵ)、式(Ⅶ)、式(Ⅷ)化合物的羅丹明123細(xì)胞內(nèi)蓄積相對值均大于1，即這些化合物能夠不同程度地抑制P-gp介導(dǎo)的藥物外排作用，也即顯示出不同程度的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性。

實施例9

式(Ⅷ)化合物逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥活性測試：

本實驗選擇準(zhǔn)噶爾大戟中分得的萜類化合物中P-糖蛋白抑制活性最好的式(Ⅷ)化合物與抗腫瘤藥長春瑞濱(NVB)聯(lián)用，檢測聯(lián)用前后對耐藥細(xì)胞的生長抑制，進(jìn)行多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性測試。

實驗方法：將處于對數(shù)生長期的KBv200細(xì)胞以2500個/孔的密度接種于96孔微量培養(yǎng)板(每孔160μL)，在37℃培養(yǎng)箱中孵育24h后加入長春瑞濱(20μL/孔)和供試單體化合物或陽性對照藥維拉帕米(20μL/孔)，每個濃度均為3個復(fù)孔，并設(shè)空白對照組和溶劑(DMSO)對照組；腫瘤細(xì)胞在溫度37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)72h后棄去上清液，將MTT與細(xì)胞完全培養(yǎng)液按1:10的比例混勻后，每孔加入100μL，在溫度37℃、5％CO₂條件下繼續(xù)培養(yǎng)1h后棄去上清液，每孔加入100μL DMSO，待甲臜溶解后，用酶標(biāo)儀檢測各孔570nm的吸光度值(A)，按5.2.2中的公式計算抑制率，并按下列公式計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。

逆轉(zhuǎn)倍數(shù)＝IC₅₀(長春瑞濱)/IC₅₀(長春瑞濱+二萜類化合物)

實驗結(jié)果：式(Ⅷ)化合物與長春瑞濱聯(lián)用對KBv200細(xì)胞的半數(shù)生長抑制率及其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)見表8：

表8式(Ⅷ)化合物與長春瑞濱聯(lián)用對KBv200細(xì)胞的半數(shù)生長抑制率

由上表可知，長春瑞濱與式(Ⅷ)化合物聯(lián)用后與長春瑞濱單獨(dú)作用相比，IC₅₀值顯著降低，降低程度以逆轉(zhuǎn)倍數(shù)表示，3μM的式(Ⅷ)化合物的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(225.35倍)即與10μM陽性對照藥維拉帕米相當(dāng)(259.46倍)，即式(Ⅷ)化合物具有很強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的活性。